Este manuscrito fornece uma descrição da metodologia usada para estabelecer modelos de camundongos de transdução-transplante. Um relato detalhado é dado de erros técnicos a serem evitados ao realizar transplantes de medula óssea. Deve-se obter uma compreensão clara da importância do alto título viral, transfecção/transdução e irradiação.
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Artigo de método
Transdução-Transplante Rato Modelo de neoplasia mieloproliferativa
Neste artigo
Resumo
Resumo
O transplante de transdução é uma maneira rápida e eficiente de modelar malignidades hematológicas humanas em camundongos. Essa técnica resulta na expressão do gene de interesse nas células hematopoiéticas e pode ser usada para estudar o papel do gene na hematopoiese normal e/ou maligna. Este protocolo fornece uma descrição detalhada sobre como realizar o transplante de transdução usando mutações de calreticulina (CALR) recentemente identificadas na neoplasia mieloproliferativa (NMP) como exemplo. Neste protocolo, células inteiras da medula óssea de camundongos doadores tratados com 5-flurouracil (5-FU) são transduzidas com um retrovírus que codifica o CALR mutante e transplantadas para hospedeiros singênicos letalmente irradiados. As células doadoras que expressam CALR mutante são marcadas com proteína fluorescente verde (GFP). Os camundongos transplantados desenvolvem um fenótipo MPN, incluindo plaquetas elevadas no sangue periférico, expansão de megacariócitos na medula óssea e fibrose da medula óssea. Fornecemos um relato passo a passo de como gerar retrovírus, calcular o título viral, transduzir células inteiras da medula óssea e transplantar em camundongos receptores irradiados.
Introdução
Transdução-transplante é um método útil para modelar doenças malignas hematológicas em ratinhos. Esta técnica tem sido particularmente valiosa para estudar malignidades mielóides que datam da primeira demonstração de que a expressão ectópica de BCR-ABL1 poderia fielmente recapitular leucemia mielóide crônica em ratos 1. Esta técnica foi posteriormente facilitou o estudo extensivo de JAK2 V617F e MPL W515K / L mutado neoplasia mieloproliferativa (MPN).
NMP são um grupo de doenças hematológicas, caracterizado por o excesso de produção de células mielóides maduras e fibrose da medula óssea. Essas doenças gera....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado e executado de acordo com as recomendações do Comité Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade da Califórnia, Irvine. Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia isoflurano e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
1. Produção de Retrovírus ecotrópico
- Preparar plasmídeos de alta qualidade com uma concentração de pelo menos 1 mg / mL usando um kit Maxi-prep comercial ou purificação de cloreto de césio.
Nota: Estes incluem um vector de espinha dorsal MSCV que codifica o gene de interesse (neste caso Calr 7,8) e o marcador de escolha (GFP, neo, etc.)....
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Resultados
A técnica de transdução-transplante resulta na reconstituição hematopoiética dos ratinhos receptores com células que expressam o gene de interesse. A Figura 1 mostra uma visão geral do modelo de rato transdução-transplante de calreticulina mutado MPN. Resumidamente, retrovírus que expressam CALRwt ou CALRdel52 é utilizado para infectar células de MO de um ratinho dador C57B / 6. transduzidas células são transplantadas para irradiado C57B / 6 rato receptor e doador da cél.......
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Discussão
Este protocolo fornece uma descrição detalhada de como realizar os transplantes de medula óssea em ratinhos recapitular uma doença trombocitemia essencial, como com progressão para mielofibrose com mutação CALRdel52 como o controlador da doença. O transplante bem sucedido de células que expressam os resultados CALRdel52 no aumento de plaquetas, a expansão de megacariócitos e fibrose da medula óssea. Como o transplante de medula óssea é um processo de vários passos, é importante reconhecer passos onde erro técnico pode s.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelo V Foundation Scholar (AGF) e pela MPN Research Foundation (AGF).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T células | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 células | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, também conhecido como pCL-Eco | Addgene | 12371 | Linhas celulares de empacotamento retroviral, como EcoPack 2-293, podem ser usadas no lugar do plasmídeo EcoPak e das células 293T padrão. Envelopes adicionais de retrovírus e plasmídeos de embalagem estão disponíveis na Addgene e outros. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) Addgene | 20672 | Plasmídeos de transferência γ-retrovirais adicionais estão disponíveis na Addgene e outros. | |
| consumíveis< / forte> | |||
| 27 G x 1/2 "agulhas | BD | 305620 | |
| Soro bovino fetal | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicilina / estreptomicina / L-glutamina | Corning | MT-30-009-CI | |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Corning | MT-25-052-CI | Pode ser PBS caseiro |
| Corning | MT-21-031-CV | ||
| Pratos de 10 cm | Fisher | 172931 | |
| tubos cônicos de 15 ml | Pratos Fisher | 12565268 | |
| 60 mm | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µ filtros de células m | Fisher | 22363549 | |
| tubos cônicos de 50 ml | Fisher | 12565270 | |
| placa de 6 poços | Fisher | 130184 | |
| tubos FACS | Fisher | 14-959-5 | |
| 0,45 μ m filtros de seringa | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Pode ser caseiro |
| IL-3 murino recombinante | Peprotech | 213-13 | |
| IL-6 murino recombinante | Peprotech | 216-16 | |
| SCF murino recombinante | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Reagente de transfecção |
| centrífuga de 1,5 ml | EUA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| Irradiador |
Referências
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G.
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Reimpressões e permissões
