Artigo de método

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocit�des do rato de Medula Óssea

DOI:

10.3791/54641

⸱

4 de novembro de 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Neste artigo

Resumo

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Relata-se um protocolo de utilização de células activada por fluorescência para isolar células dendríticas plasmocitoides (PDC) com elevado grau de pureza a partir da medula óssea de ratinhos lúpus-propenso para estudos funcionais de PDC.

Resumo

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A classificação celular ativada por fluorescência (FACS) é uma técnica para purificar populações celulares específicas com base em fenótipos detectados por citometria de fluxo. Esse método permite que os pesquisadores entendam melhor as características de uma única população de células sem a influência de outras células. Comparado a outros métodos de enriquecimento celular, como a classificação de células ativadas por magnetismo (MCS), o FACS é mais flexível e preciso para a separação celular devido à capacidade de detecção de fenótipo por citometria de fluxo. Além disso, o FACS geralmente é capaz de separar várias populações de células simultaneamente, o que melhora a eficiência e a diversidade dos experimentos. Embora o FACS tenha algumas limitações, ele tem sido amplamente utilizado para purificar células para estudos funcionais em ambientes in vitro e in vivo. Aqui relatamos um protocolo usando classificação de células ativadas por fluorescência para isolar uma população muito rara de células imunes, células dendríticas plasmocitóides (pDC), com alta pureza da medula óssea de camundongos propensos ao lúpus para estudos funcionais in vitro de pDC.

Introdução

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A separação eficiente de uma população de células de escolha de outras células permite estudos da população que podem não ser possíveis de outra forma. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) é um método para enriquecer uma população de células interessante com alta pureza. 1,2 Diferentes tipos de células geralmente expressam moléculas únicas, ou uma combinação única de várias moléculas, na membrana plasmática que podem distinguir uma população de células de outra. Após a ligação dessas moléculas da superfície celular por anticorpos conjugados com fluorescência específicos, uma máquina de detecção chamada citômetro/classificador de fluxo é capaz de excitar e detectar os sinais de luz de diferentes corantes fluorescentes que representam diferentes marcadores de moléculas nas células no nível de célula única. A informação combinada que consiste na presença de um sinal de luz (representando a expressão positiva da molécula de superfície correspondente) ou na ausência de um sinal de luz (representando a expressão negativa de uma molécula) define o fenótipo da célula. Depois de passar pelo detector, as células com o mesmo fenótipo de interesse são desviadas para um tubo coletor designado com base na carga elétrica.

FACS é amplamente aplicado em vários estudos, desde que a população a ser enriquecida seja marcada com fluorescência. 3-7 Tem sido usado para separar bactérias revestidas com imunoglobulina (Ig)A de bactérias não revestidas com IgA na microbiota intestinal 8 e classificar populações de células geneticamente modificadas que expressam proteínas fluorescentes. 9 É importante ressaltar que ele tem a capacidade de separar mais de uma população simultaneamente, o que não apenas economiza tempo e reagentes, mas também permite projetos de estudo mais sofisticados. 10 No entanto, o FACS também tem suas limitações. Se uma população de interesse for muito rara (menos de 1%), a eficiência de classificação pode ser reduzida, causando perda celular significativa. Além disso, alguma ligação de anticorpos pode ativar a transdução de sinal intracelular que induz alterações funcionais da população de células classificadas. 11 Portanto, o fenótipo usado para classificação deve ser selecionado com cuidado.

Existem outros métodos além do FACS que também são baseados em marcadores de superfície celular para o enriquecimento de populações celulares específicas, como a classificação de células ativadas por magnetismo (MCS). 12 Semelhante ao FACS, os anticorpos conjugados com esferas magnéticas podem atingir moléculas específicas da superfície celular. Após a interação anticorpo-antígeno, as células revestidas com esferas magnéticas podem ser separadas das células não revestidas após passar por um campo magnético. No entanto, apenas um número limitado de moléculas pode ser direcionado no MCS, pois os grânulos magnéticos são, ao contrário de várias cores fluorescentes no FACS, indistinguíveis. Portanto, é difícil para o MCS definir um fenótipo celular com uma combinação complicada de marcadores de superfície. 13,14 Além disso, o MCS também é capaz de causar ativação não intencional de células-alvo.

Em nossos estudos de um modelo de camundongo de lúpus eritematoso sistêmico (LES), 15 pretendemos purificar células dendríticas plasmocitoides (pDC) para investigar suas alterações funcionais com a progressão da doença. Usamos MCS pela primeira vez para enriquecer pDC da medula óssea, visando PDCA-1, uma molécula altamente e exclusivamente expressa em pDC murino em estado estacionário. 16 No entanto, a pureza celular foi inesperadamente baixa, provavelmente devido à regulação positiva de PDCA-1 em outras populações de células em um ambiente inflamatório, como o LES. 16 Em última análise, usamos o FACS com uma combinação de quatro marcadores de superfície (CD11c, CD11b, B220 e PDCA-1) para separar o pDC de alta pureza como população CD11c + CD11b-B220 + PDCA-1 +. O pDC murino tem outro marcador de superfície específico, Siglec-H. Decidimos não usar Siglec-H, pois a ligação de anticorpos dessa molécula reprime a função do pDC para produzir IFNα. 11

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Protocolo

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NOTA: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) ratos com lúpus-propensa foram criados e mantidos em uma instalação livre de patógenos específicos seguindo as exigências do Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) no número Virginia Tech (Animal Welfare Assurance: A3208-01). Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os experimentos com animais foram realizados sob IACUC protocolo número 12-062.

1. celular Meio de Cultura e Tampão Sorting

  1. Prepare meio de cultura celular completo (C10), utilizando meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, piruvato de sódio 1 mM, 1% 100 de MEM aminoácidos não essenciais, 10 mM de HEPES, 55 uM de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
  2. Preparar tampão de triagem (HBSS-cheia) usando Solução Salina Equilibrada de Hank 1x (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES, 2,5 mg / ml de albumina de soro bovino,0,05 mM de MgCl 2 e 0,2 U / ml de ADNase I.

2. Rato Dissection

  1. Preparar dois pratos diâmetro de 6 cm contendo 4 ml C10. Coloque os pratos em gelo.
  2. Euthanize o mouse por inalação de CO 2.
  3. Colheita do baço e mantê-lo em um prato com C10 em gelo.
    1. Pin o mouse para baixo com a barriga virada para cima na placa de dissecação. Esteriliza-se o corpo de pulverização 70% de etanol.
    2. Cortar a pele e separar a pele da parede muscular debaixo ao longo da linha mediana ventral a partir da sínfise púbica para o pescoço.
    3. Cortar a pele ao longo do membro posterior a partir da primeira incisão para o tornozelo.
    4. Pin a pele volta sobre os lados e cortar a parede muscular ao longo dos lados a partir do primeiro local de incisão do diafragma.
    5. Pin parede do músculo volta no lado direito da cabeça.
    6. Localize o baço do lado direito do rato debaixo do intestino delgado e ao lado do estômago. Pegue uma extremidade do the baço e separá-lo do estômago.
  4. Cortar ambos os membros posteriores para fora, incluindo o fémur ea tíbia, e remover todos os músculos, tanto quanto possível.
    1. Corte os músculos ao longo do membro posterior do pélvica joint / quadril até o tornozelo com uma tesoura afiada, tentando evitar vasos sanguíneos.
    2. Separar o membro posterior pelo corte no pélvica / articulação do quadril e articulação do tornozelo / pé, sem a exposição do conteúdo da medula óssea.
    3. músculos restantes limpas nos ossos por riscar com uma lâmina de barbear repetidamente e cortando os músculos nos pontos comuns.
  5. Manter os ossos em um prato de 6 cm, que inclua 4 ml C10 em gelo. Proceder para dissecar a próxima mouse.

Isolamento 3. esplen�ito

  1. Homogeneizar o baço suavemente com um êmbolo de seringa de encontro a um filtro de células de 70 mícrons no topo do prato contendo 4 ml C10 até há peças vermelhos são visíveis.
  2. Adicionar adicional C10 6 ml no prato através do filtro umaND depois transferir a suspensão de células total de 10 ml para um tubo de 15 ml.
  3. Centrifuga-se o tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
  4. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão de lise de 1 x de glóbulos vermelhos (RBC). Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
  5. Após a incubação, centrifugar o tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
  6. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de C10. Descartar qualquer grandes aglomerados (células mortas) e manter o tubo em gelo para mais tarde.
    NOTA: Se há muitas pequenas aglomerações, usar um filtro de células 70 mícrons para filtrar a suspensão de células uma vez.
  7. Contar o número de células com azul de tripano utilizando um contador de células automatizado.

4. Isolamento de medula óssea celular

  1. Transferir os ossos com 4 ml de C10 em um almofariz e ainda 6 ml C10 para perfazer um volume de 10 ml no total C10.
  2. Quebrar os ossos delicadamente na argamassa usando apestle.
  3. Agita-se suavemente com o pilão para libertar a medula óssea em C10.
  4. Transferir as ml C10 10 contendo medula óssea em um tubo cônico de 50 ml no gelo através de um filtro de células 70 mícrons. Adicionar C10 10 ml fresco na argamassa ainda contendo os ossos.
    NOTA: Pipeta a solução contendo medula óssea cima e para baixo várias vezes antes de passar através do filtro se contiver pedaços vermelhos são visíveis.
  5. Repita os passos de 4,2 a 4,4 vezes. Após a última lavagem, os ossos devem aparecer branco.
  6. Centrifuga-se o tubo de 50 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C. Enquanto isso, preparar 5 ml de meio de gradiente de densidade de pronto-a-usar num tubo de centrífuga de 15 mL cónico, à TA.
  7. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de C10.
  8. camada lentamente a suspensão a 10 ml de células no topo do meio de gradiente de densidade de 5 ml, mantendo clara interface entre as duas fases. Em seguida, centrifugar a 15 ml tubo cônico de 1.363 g por 30 min aRT (20 ° C) com o conjunto de aceleração como 9 e desaceleração definido como 0 (ou Brake OFF).
  9. Após centrifugação, remover a parte superior 8 ml de solução cuidadosamente e recolher o revestimento 2 ml de Buffy na interface (uma camada de células mononucleares) para um novo tubo de 15 ml.
  10. Adicionar C10 12 mL de gelo frio para as tubo de 15 ml contendo células mononucleares de medula óssea, tampa e gire várias vezes para misturar bem, em seguida, centrifugar o tubo a 800 xg durante 10 min, 4 ° C.

Manchas na superfície 5. celular para FACS

  1. coloração amostra
    1. Prepare de murganho anti-CD16 / 32 solução de anticorpo (diluição 1 a 100 em HBSS-cheia, 5 ug / ml de concentração final).
    2. Após centrifugação no passo 4.10, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 ul de solução de anticorpo anti-ratinho CD16 / 32 para bloquear o receptor de Fc nas células mononucleares. Incubar em gelo durante 10 min.
    3. Prepare a mistura de anticorpo conjugado com fluorescência (formigadiluição i-rato CD11c-PE 01:40, anti-rato CD11b-APC-CY7 1:80 de diluição, diluição 1:40 anti-rato PDCA-1-FITC e anti-rato B220-V500 diluição 1:40 em HBSS- completo, tal como recomendado pelo fabricante em 100 ul de volume final por amostra).
      NOTA: É importante para titular anticorpos antes do uso.
    4. Após 10 minutos de incubação no passo 5.1.2, adicionar 4 ml de HBSS arrefecido em gelo-cheia e centrifugar a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para remover o material não ligado Anti-ratinho de CD16 / 32.
    5. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 mistura de anticorpo conjugado com fluorescência-ul. Incubar em gelo durante 15 min no escuro.
    6. Após 15 min de incubação, adicionar 4 ml de HBSS arrefecido em gelo-cheia e centrifugar a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para remover os anticorpos não ligados fluorescência conjugado.
    7. Preparar a solução de carregamento de FACS (500 ng / ml de DAPI em HBSS-cheio).
    8. Após centrifugação no passo 5.1.6, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 μ; L FACS solução de carga. Transferir a suspensão de células em um 12 x 75 mm em volta do tubo inferior (tubo de FACS) e manter o tubo em gelo no escuro até triagem dentro de 1 h.
  2. A coloração para compensação
    1. Etiqueta de 6 tubos de FACS como PE, a APC-CY7, FITC, V500, DAPI ou corados. Esplenócitos alíquota a 1 X 10 6 células / tubo para os tubos de FACS, e lava-se com 4 mL de HBSS-completo a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
      NOTA: Use DNA de ligação de corante fluorescente, DAPI, distinguir células vivas a partir de células mortas. DAPI pode passar através da membrana plasmática de células mortas (mas não de células vivas) e ADN se ligam cromossoma.
    2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 uL de HBSS-cheia.
    3. Em cada tubo de FACS correspondente, adicionar um dos seguintes anticorpos: CD19-PE anti-ratinho de diluição 1:40, anti-ratinho de diluição 1:80 CD11b-APC-CY7, anti-ratinho PDCA-1-FITC ou diluição 1:40 anti-ratinho B220-V500 diluição 1:40 como recomendado pelo manufacturer. Deixar o 5º (DAPI) e 6º (sem manchas) FACS tubos como elas são. Misture bem, por agitação e incuba-se todos os tubos de FACS em gelo no escuro durante 15 min.
    4. Após a incubação, adicionar 4 ml de HBSS arrefecido em gelo-completo a cada tubo e os tubos de centrífuga de FACS a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
    5. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 uL de gelo frio HBSS completa excepto para o sedimento no tubo rotulado DAPI, que é ressuspenso em 500 ul de solução de FACS de carregamento. Manter todos os tubos de 6 em gelo no escuro até triagem.

6. Classificando no Sorter celular

NOTA: A operação de triagem procedimento no citômetro e software é padronizado com instruções detalhadas fornecidas pela empresa. Resumidamente, usamos 100 bocal micron a 20 psi, a concentração de células alvo definido entre 5-10.000.000 por ml, e ajustar a eficiência de 70% ou superior (ou seja, os conflitos mantida sob 30%).

  1. Preparar tubos de recolha de FACS com 500 mL de FBS / tubo contendo 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
  2. Ajustar os parâmetros de compensação do classificador de células utilizando tubos de compensação-mancha única a partir do passo 5.2.
    1. Grave 10.000 células em tubos sem mácula para definir porta negativo para cada intensidade de fluorescência.
    2. Grave 10.000 células em outros tubos de compensação mancha única para definir portão positivo para cada intensidade de fluorescência.
      NOTA: O software calcula automaticamente os parâmetros de compensação.
  3. Use uma amostra a partir do passo 5.1 para definir as portas de populações de células classificadas segundo a gravação 3.000 células. Usando intensidade fluorescente como parâmetros de X e do eixo Y do gráfico, a população de células alvo porta manualmente como um grupo de pontos aparentemente separados dos outros pontos.
    NOTA: Este conjunto gating é flexível e arbitrária com base nos requisitos de pesquisadores. Se os pesquisadores esperam maior pureza com base em um ou mais marcadores, mover o portãomais elevada com base na intensidade de fluorescência correspondente.
  4. Carregar um tubo de recolha e começar a separar a população de células alvo.
  5. Mantenha o tubo de coleta no gelo após a triagem até que todos os tubos de amostras são feitas.
  6. Adicione gelo frio C10 ao tubo de recolha de até 4 ml, tampa e inverta para misturar.
  7. Centrifuga-se o tubo de recolha a 800 xg durante 5 min, 4 ° C, e, em seguida, aspirar o sobrenadante, deixando cerca de 200 ul com sedimento de células intactas.
  8. Adicionar 1 mL de gelo frio C10 para ressuspender a pelete de células e transferir toda a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
  9. Centrifugar o tubo de 1,5 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C e aspirar o sobrenadante, deixando 100? L com o sedimento de células intactas.
  10. Armazenar as populações de células ordenadas em gelo até à sua utilização.

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Resultados

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Nosso objetivo para enriquecer medula óssea pDC com elevado grau de pureza, e sem a influência de outros tipos de células, a partir de ratos lúpus-propensa MRL / lpr de ambos tenra idade e de idade para estudar as mudanças funcionais do PDC em relação à sua capacidade de produzir IFN. A primeira estratégia de purificação usado foi de MCS, a qual, como mostra a Figura 1, conduziu apenas a 7,75% de pureza, após o enriquecimento. Comparado ao MCS, FACS enriquecido pDC com p...

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Discussão

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O protocolo descrito neste manuscrito é para enriquecimento de alta pureza de pDC vivo que retém a capacidade de produzir IFNα. As aplicações deste protocolo incluem, mas não estão limitadas a, purificação de pDC e / ou quaisquer outras células mononucleares da medula óssea de MRL / lpr e quaisquer outras cepas de camundongos para estudos de funções celulares e moleculares. Várias etapas críticas neste protocolo são garantir alta viabilidade e pureza do pDC classificado. O primeiro passo fundamental é a liberação da medu...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses em relação à publicação deste artigo.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Laboratório de Citometria de Fluxo da Faculdade de Medicina Veterinária da Virgínia-Maryland pelo uso da instalação central de citometria de fluxo. Este trabalho foi apoiado pelos fundos iniciais da XML. XL é bolsista do programa de pós-graduação em Ciências Biomédicas e Veterinárias.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RPMI 1640gibco da life technologies11875-093
Soro fetal bovinoHyCloneSH30396.03
Pirovato de sódiogibco da life technologies11360-070
MEM aminoácidos não essenciaisgibco da life technologies11140-050
HEPESgibco da life technologies15630-080
2-mercaptoetanolgibco da life technologies21985-023
L-glutamina gibco da life technologies25030-164
Penicilina-Estreptomicinagibco da life technologies15140-122
1x Hank' s Solução salina balanceadaGibco by Life Technologies14175-079
MACS BSA Solução de EstoqueMiltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
Tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) eBioscience00-4300-54
Gradiente de densidade médioGE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
anti-rato CD19-PEBD Pharmingen553786
anti-rato CD11c-PEeBioscience12-0114-82
anti-rato CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
anti-rato PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
anti-rato B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
Kit de Isolamento de Células Dendríticas Plasmocitóides II, camundongoMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I citômetro de fluxo BD Biosciences643178
BD FACS Diva versão 6BD Biosciences

Referências

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