Aquosas gotículas usadas como Microreactors enzimática e sua atuação eletromagnética

Resumo

Sistemas de laboratório-em-um-gota reação permitem a implementação versátil de reações complexas em uma escala de microfluidic. Uma plataforma de acionamento automatizado que consiste de uma matriz 3 x 3 das bobinas electromagnéticas foi desenvolvida e utilizado com sucesso para mesclar dois 10 µ l de microreactors e, assim, iniciar uma reação enzimática em mármores do líquido resultantes.

Resumo

Para o sucesso da implementação de sistemas de reação microfluídicos, tais como a PCR e eletroforese, o movimento de pequenos volumes de líquidos é essencial. No convencionais laboratório-em-um-microplaqueta-plataformas, solventes e amostras são passadas através de canais microfluídicos definidos com instalações de controle de fluxo complexo. A plataforma de atuação da gota aqui apresentada é uma alternativa promissora. Com isso, é possível mover uma gota de líquido (Microrreator) sobre uma superfície plana de uma plataforma de reação (laboratório-em-um-gota). A atuação do microreactors na superfície hidrofóbica da plataforma baseia-se na utilização de forças magnéticas, atuando na camada exterior das gotas de líquido, que é feita de uma fina camada de partículas de magnetita superhydrophobic. A superfície hidrofóbica da plataforma é necessária para evitar qualquer contacto entre o núcleo líquido e a superfície para permitir um movimento suave do Microrreator. Na plataforma, um ou mais microreactors com volumes de 10 µ l pode ser posicionados e mudou-se simultaneamente. A plataforma em si consiste de uma matriz 3 x 3 de bobinas elétricas de duplas que acomodar os núcleos de ferro ou de neodímio. Os gradientes de campo magnético são controlados automaticamente. Pela variação dos gradientes de campo magnético, casca de hidrofóbicos magnético do microreactors pode ser manipulada automaticamente para mover o Microrreator ou abra o shell de forma reversível. Reações de substratos e enzimas correspondentes podem ser iniciadas por fusão a microreactors ou trazê-los em contacto com a superfície catalizadores imobilizados.

Introdução

Aplicações técnicas com micro reações são predominantemente realizadas em fichas microchannel predefinidos. Estes sistemas são amplamente estabelecidos e exaustivamente descritos na literatura (inter alia ^1,2,3). Em 2011, o volume de negócios de microfluidic tecnologias mundiais totalizou 6,2 bilhões euro ⁴. Em contraste, o uso de compartimentos livremente móvel reator micro era anteriormente apenas examinado e publicado de forma limitada. O método mais comum para mover aquosas micro gotículas é electrowetting ⁵. Outros métodos para o movimento das gotas em superfícies baseiam-se em campos elétricos ⁶, força magnética ⁷ ou atuação acústica ⁸. Devido à sua superfície desfavorável à relação do volume, estes sistemas baseados em gotículas Microrreator são expostos aos efeitos da evaporação forte. Assim, o movimento de queda é geralmente estabelecido como um sistema de duas fases líquido, onde a fase superior tem um alto ponto de ebulição, protegendo a fase aquosa da evaporação. No entanto, essa abordagem envolve um alto risco de contaminação da gota de reação por difusão descontrolada. Este é um obstáculo significativo para o estabelecimento técnico dos sistemas mencionados.

Trabalho recente é concernido com as transições de fase de líquido-sólido não-aderente. Uma abordagem altamente eficaz é o uso de superfícies superhydrophobic, permitindo a formação de gotículas aquosas esféricas. Uma extensão deste conceito de reação é a utilização de compartimentos de reação micro com uma superfície superhydrophobic ou shell, que por exemplo pode consistir de partículas de politetrafluoretileno (PTFE) ⁹. Seus ângulos de contacto em superfícies geralmente estão na faixa de 160° (dependendo da aspereza de superfície). Os compartimentos esféricos assim, fornecem a mínima resistência ao movimento em uma superfície e simultaneamente fornecem proteção contra a evaporação da água.

Gotas aquosas revestidas com partículas PTFE micro tamanhos podem manter sua forma esférica, até um diâmetro de cerca de 2 mm. Em volumes mais elevados, o shell hidrofóbico normalmente não está completamente fechado mais ¹⁰. A influência de outros materiais de concha e a expansão do campo de aplicação do mármore líquido para solventes apolares foi implementadas pelo Gao e McCarthy usando líquidos iônicos ¹². Até agora para a formação de conchas com base em partículas hidrofóbicas, diâmetros de partículas em tamanhos de 10 nm-30 µm têm sido descritos ^11,14,16. Novos estudos demonstraram que nanopartículas hidrofóbicas como material de shell são de uso ainda melhor do que a de micropartículas ¹³. Estudos de estabilidade de primeira confirmaram um aumento na estabilidade quando o tamanho de partícula é reduzido de ca. 600 nm até ca. 100 nm. Este provável resultados na distribuição de partículas mais densas em torno da esfera aquosa ¹⁵.

A proteção de compartimentos aquosos reação por um escudo hidrofóbico e sua designação como bolinhas de gude líquidas foi descrita pela primeira vez em 2001 por Aussillous et al e Maria et al. ^{17 , 18}. desde então, têm sido descritos alguns aplicativos desses compartimentos definidos reação. Por exemplo, um sensor de gás baseado em mármores líquido ¹⁹ e um método de detecção para a contaminação da água com base em uma base qualitativa opticamente foram desenvolvidas ²⁰. Os autores distinguem as vantagens das taxas de reação e o baixo consumo de produtos químicos de seus sistemas de reação micro. Publicações recentes lidar com a produção de mármores líquidos sensíveis ao pH ¹⁶ ou a representação de 'Partículas de Janus' com dois diferentes revestimentos de diferentes funcionalidades. Por exemplo, Bormashenko et al poderia sintetizar um Microrreator com reservatórios de Teflon e semicondutor carbono preto ²¹. Além disso foi demonstrado que o microreactors pode eficientemente e conveniente sintetizar polyperoxides absorvendo oxigênio externo como comonômero através a interface permeable do gás-líquido ²⁴. Em outra abordagem a concha de mármores líquidos baseados em sílica-partícula fornecem as superfícies do substrato reativo para regular o espelho de prata clássica reação ²⁶. Problemas atuais de investigação e desenvolvimento no campo de gotículas hidrofílico-núcleo-hidrofóbico-shell são o ajuste de tamanho de partícula, a produção reprodutível de gotículas monodisperso, a molhabilidade das superfícies e o efeito de um segundo hidrofílica concha sobre a reação micro compartimentos ²², bem como um melhor controle das trajectórias da gota, por exemplo, para o desenvolvimento de sistemas contínuos microPCR- ⁴.

Uma atuação magnética destes microreactors oferece a vantagem de intervalos de movimento relativamente alta e uma boa seletividade da força quando se trabalha em sistemas bioquímicos. Quando usando partículas de magnetita hidrofóbicos, cumprem a função da transmissão para o movimento da microreactors força magnética, bem como a função de uma concha hidrofóbica. A circulação magnética de gotículas com partículas magnéticas dentro uma gota foi postulada pela primeira vez em 2006 pelo Lehmann et al ²³ e Shikida et al ²⁵, que usaram manualmente movidos ímãs permanentes como atuadores para a mobilização de uma única gotícula. Outra abordagem para mover uma pequena quantidade de líquido foi realizada por Zhao et al, que usado hidrofóbicas partículas Fe₃O₄ como escudo magnético. O shell do mármore líquido magnético foi aberto na parte superior da queda por um vertical inverter magnético campo ²⁷. Com base neste conceito, Xue et al foram capazes de desenvolver as partículas que formam um Microrreator com uma tensão de superfície da Dina 20,1 cm^{− 1 28}. Lin et al fabricado romance baseado em celulose micro/nano hierárquicas esferas com Superparamagnetismo e superhydrophobicity que preveem estabilidade Deus gotículas de líquido magnético transporte e manipulação de ³¹. Isso foi até agora lançado apenas como um prova de princípio estudar e não usado para qualquer aplicação. O controle elétrico e magnético dos mármores do líquido atualmente é perseguido em primeiras aproximações. Zhao et al . em 2010 ¹⁵ e Zhang et al . 2012 ²⁹ foram capazes de desenvolver uma manipulação da gota pelo movimento manual (manual) de um ímã permanente sob casca-núcleo de gotículas. Bormashenko et al . ¹¹ alcançou a aceleração de um mármore ferromagnético líquido a uma velocidade de 25 cm s^-1 por aproximar um ímã de neodímio. O princípio acima mencionado foram realizados estudos exclusivamente pelo movimento manual de um pequeno ímã permanente. Como uma próxima etapa de desenvolvimento, Zhao et al foram recentemente capazes de estimar a densidade de fluxo magnético necessária para o movimento de mármore líquido magnético variando a distância de um ímã permanente de ³⁰. Para um controle de reação comparável de sistemas comuns de laboratório-em-um-microplaqueta, parece inevitável para fornecer os meios de controle automatizado do discreto líquido volumes. Para satisfazer esta necessidade, desenvolvemos um novo sistema de controle baseado em gradientes de campo variável se fixam, mover e abrir o microreactors magnético.

Protocolo

1. Hydrophobization de nanopartículas magnéticas

1. para a síntese de partículas magnéticas hidrofóbicas, adicionar 0,85 g FeCl ₃ hexa-hidratado (3.14 mmol) e 0,30 g de FeCl ₂ Tetra (1.51 mmol) de 200 mL solução de etanol/água (4:1 v/v).
2. a esta mistura, adicione 0,20 mL 1H, 1H, 2 H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFOTES) (5,23 mmol) com agitação vigorosa por um agitador magnético (500 rpm). Realizar a síntese em uma atmosfera de gás inerte (N ₂) usando um balão de fundo redondo com uma rolha para evitar a oxidação secundária das partículas de magnetita.
3. Ajustar a gota de solução inteligente com uma solução de hidróxido de amônio (1,5 M) a um pH de 8 (pH determinada por um medidor de pH). Agitar a solução durante 24 h, utilizando um agitador magnético.
4. Separar as partículas magneticamente a solução, colocando o frasco em uma barra de ímã (adesivo de neodímio ímã cuboide 40 x 20 x 10 mm, força 25 kg). Deite fora a solução, mantendo o ímã anexado à parte inferior do frasco.
5. Lavar as partículas três vezes com a solução de água/etanol enquanto estiver usando uma barra de ímã, conforme descrito em 1.4). Seca as partículas a 60 ° C por 24 h (rendimento ca. 0,43 g).
6. Para analisar as partículas, usar um microscópio eletrônico de varredura de acordo com o fabricante ' instruções de s.

2. Fabricação de Microreactors

1. moer todas as partículas secas ligeiramente usando um pilão de vidro e posteriormente colocar todos eles diretamente em uma panela de pesagem (46 × 46 × 8 mm, poliestireno).
2. Pipeta 10 solução de reação de µ l (composição como descrito em 5.1) sobre todas as partículas e a pesagem de movimento pan ligeiramente de forma circular por aproximadamente 10 s (massa da partícula para um Microrreator de 10 µ l: ca. 3.2 x 10 ^-7 kg < sup classe = "xref" > 33). Armazenar as restantes partículas (partículas que não auto-montagem em torno da solução de reação) à temperatura ambiente para novas aplicações.
3. Para medir o ângulo de contacto da Microrreator, a construir um Microrreator de 5 µ l com água, conforme descrito no ponto 2.2), coloque-o em um filme de teflon e analisar o ângulo de contato usando um dispositivo de medição do ângulo de contato óptico de acordo com o fabricante ' s instruções.

3. 3D-impressão dos corpos bobina

1. desenha os corpos de bobina dupla, com uma altura de 16 mm (uma câmara), um diâmetro de 10 mm e um diâmetro interior de ca. 4 mm usando um software de CAD de acordo com o fabricante ' s instruções.
2. Imprimir os corpos de bobina com uma impressora 3D de acordo com o fabricante ' instruções s usando materiais como polilactida filamento. Enrole os corpos com um fio de cobre 0,08 milímetros para alcançar 4.500 enrolamentos usando uma máquina de enrolamento controlados computador.

4. Fabricação da plataforma de atuação

1. organizar a dupla bobinas em uma matriz (por exemplo, 3 x 3 matriz) em um quadro eléctrico com um elemento Peltier debaixo, aparafusar as bobinas duplas e conectá-los a um controle via fita cabo ( a Figura 3).
2. Dependendo da aplicação desejada, adicionar um núcleo de ferro (32 mm de altura, diâmetro de 4 mm) ou um ímã de neodímio (12,5 mm de altura, diâmetro de 4 mm, 1.035 kA m ^-1) para o corpo de bobina para obter um campo magnético mais forte.
3. Para terminar a plataforma colocar uma placa, de preferência de vidro de quartzo, com uma altura máxima de 1 mm na matriz da bobina.
4. Colocar um Microrreator na superfície da plataforma.
5. Para retirar as partículas superiores a solução de reação e, assim, abrir uma Microrreator ativa uma bobina com um íman de neodímio dentro usando o controle mencionado no 4.1). Para fechar a Microrreator outra vez desactivar a bobina.
6. Para mesclar duas microreactors que são inicialmente ca. 10 mm separado usa ímãs de neodímio, conforme descrito em 4.2). Levante o ímã nos corpos bobina necessária ativando as bobinas para ca. 25 s para abrir um Microrreator (distância necessária entre Microrreator e ímã encontra-se cerca de 12 mm) e mover o outro para a mesma posição na plataforma.
7. Esfriar a reação solução na Microrreator sobre a superfície da plataforma e para diminuir a temperatura da bobina ligar o elemento Peltier, posicionado abaixo da matriz de bobina, conforme descrito em 4.1).

5. Reação enzimática por fusão Microreactors

1. peroxidase de rábano e dissolver em uma concentração de 0,1 µ g mL ^-1 em tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 6.5). Diluir o substrato, 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine (10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)) com tampão de fosfato de potássio (0,1 M, pH 6.5) a uma concentração de 200 µM.
2. Uso de 10 µ l de cada uma destas soluções para construir duas microreactors, conforme descrito no ponto 2.2). Mesclar os dois microreactors a média das forças magnéticas (ímã de neodímio cilindro: 12,5 mm x 4 mm, 1.035 kA m ^-1) conforme descrito em 4.6) a 25 ° C.
3. Detectar a reação pelo posicionamento de uma sonda de fluorescência (comprimento de onda de excitação: 570 nm, comprimento de onda de emissão: 585 nm) ca. 10 mm diretamente acima de um Microrreator aberto antes da mesclagem.

Resultados

As partículas de casca têm um diâmetro de cerca de 640 nm. As nanopartículas magnetizáveis colocadas entre esta partículas de casca de fluorosilane têm diâmetros em uma faixa entre 22 nm e 37 nm. Um Microrreator de 5 µ l com água como um núcleo líquido tinha um ângulo de contato de em torno de 160°.

A força necessária para mover um Microrreator de 10 µ l como descrito acima é 1,34 ± 0,08 µN. a Figura 1

Discussão

Para o uso bem sucedido de microfluidic tecnologias, é importante mudar o volume de reação correspondente às exigências da síntese biotecnológica e análises. A plataforma de atuação aqui apresentada, torna possível mover microfluidic gotículas por força magnética. O movimento pode ser realizado livremente em duas dimensões sobre uma superfície plana de uma plataforma de reação colocando-se a gota de líquido com um escudo magnético superhydrophobic. Assim, um sistema alternativo para canais microfluídicos predefinidos com...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Impressora 3D	FelixPrinters	Pro1
10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (Amplex Red)	Life Technologies	A12222
Hidróxido de amônio	TU-KL	1072
Software CAD	Siemens	Soled edge
Medidor de ângulo de contato	Dataphysics	OCA 20
Cilindro ímã	Webcraft GmbH	S-04-13-N	https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N
Fosfato dipotássico	Bernd Kraft	7758-11
Forno de secagem	Aglutinante	FD 115
Etanol	Sigma-Aldrich	68-17-5
FeCl2 tetrahidrato	TU-KL	1625
FeCl3 hexahidratado	TU-KL	1622
Sonda de fluorescência	PerkinElmer	LS 55
Peroxidase de rábano	Carl Roth	9003-99-0
Peróxido de hidrogênio	Th.Geyer GmbH & Co	7722-84-1
Fosfato monopotássico	Bernd Kraft	7778-77-0
Elemento Peltier	Conrad
Perfluoroctiltrietoxissilano	Sigma-Aldrich	51851-37-7
Microscópio Eletrônico de Varredura	FEI	Helios NanoLab 650 Ímã
	Webcraft GmbH	Q-40-20-10-N
Máquina de enrolamento	IWT GmbH	FW122