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Environment
A Tabela Gusseted Thermogradient para controlar a temperatura do solo para avaliar o crescimento ...

Research Article

A Tabela Gusseted Thermogradient para controlar a temperatura do solo para avaliar o crescimento da planta e monitoramento de processos do solo

DOI: 10.3791/54647

October 22, 2016

Gregory E. Welbaum1, Osamah S. Khan1, Nezar H. Samarah1,2

1Department of Horticulture,Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Department of Plant Production, Faculty of Agriculture,Jordan University of Science and Technology

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Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Retraction Notice

The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice

Summary

As tabelas termogradientes tradicionais criam uma faixa de temperaturas em toda a superfície. A soldagem de reforços perpendiculares à superfície de uma mesa termogradiente controlará a temperatura em profundidade, aumentando as possíveis aplicações de pesquisa.

Abstract

As tabelas termogradientes foram desenvolvidas pela primeira vez na década de 1950 principalmente para testar a germinação de sementes em uma faixa de temperaturas simultaneamente, sem o uso de uma série de incubadoras. Um gradiente de temperatura é estabelecido passivamente na superfície da mesa entre as extremidades aquecida e resfriada e é perdido rapidamente em distâncias acima da superfície. Como a temperatura é controlada apenas na superfície da mesa, os experimentos são restritos a recipientes rasos, como placas de Petri, colocados sobre a mesa. A soldagem contínua de tiras verticais de alumínio ou reforços perpendiculares à superfície de uma mesa permite o controle de temperatura em profundidade por meio do fluxo de calor por convecção. O solo nos canais entre os reforços foi mantido em um gradiente de temperaturas, permitindo uma maior diversidade de experimentação. O delineamento reforçado foi avaliado pela germinação de sementes de aveia, alface, tomate e melão. As temperaturas do solo foram monitoradas usando registradores de dados individuais alimentados por bateria posicionados na mesa. As luzes LED instaladas nas tampas ou nas laterais da mesa de gradiente criam uma câmara de temperatura controlada onde as mudas podem ser cultivadas em uma variedade de temperaturas. O design reforçado permitiu a determinação precisa das temperaturas ideais para uma taxa de germinação mais rápida e a maior porcentagem de germinação para cada espécie. As informações de germinação de experimentos de tabela de gradiente podem ajudar a prever a germinação de sementes e o crescimento de mudas sob as condições adversas do solo frequentemente encontradas durante a produção de culturas de campo. Os efeitos da temperatura na germinação das sementes, no crescimento das plântulas e na ecologia do solo podem ser testados sob condições controladas em laboratório usando uma mesa termogradiente reforçada.

Introduction

Tabelas Thermogradient não são novos e a sua utilização tem sido relatado na literatura por várias décadas 1-6. Mesas iniciais foram desenvolvidos ostensivamente para testes de germinação de sementes de laboratório, muitas vezes em substrato de papel sobre uma ampla gama de temperaturas em um único experimento (Figura 1). Existem diversos modelos de tabelas thermogradient mas uma das mais comuns consiste de uma folha rectangular relativamente espessa de metal, frequentemente de alumínio pela sua resistência à corrosão, com um ciclo de tubo quadrado soldada à parte inferior em extremidades opostas. tubos de plástico ligar as tabelas de entrada e saída de tubos para controle de temperatura, banhos que bombeiam o líquido resfriado e aquecido através dos tubos em lados opostos por baixo da mesa de circulação. O tubo conduz mistura de fluido, normalmente um água-anticongelante (etileno-glicol), para evitar o congelamento, se o sistema está a ser operado perto ou abaixo das temperaturas de congelação. Outro projeto é para soldar bandas de metal em conjunto para crecomeu um reservatório de fluido em cada extremidade da tabela, com entradas e saídas para a circulação de soluções quentes e frios em cada extremidade. Os banhos de circulação pode ser posicionado sobre o chão debaixo da mesa ou sobre uma mesa separada justaposta. Mesas thermogradient elétricos com bobinas de aquecimento e / ou módulos de refrigeração Peltier foram construídos, mas de alto custo, os desafios que geram baixas temperaturas consistentes, e confiabilidade questões impediram o uso comercial generalizado 8.

Os modelos de fluido circulante passivamente criar um gradiente unidimensional através de condução térmica. Se a placa de alumínio é de forma uniforme e a espessura e devidamente isoladas, de modo uniforme o calor flui do quente para a extremidade fria de uma tabela que estabelece um gradiente de temperatura unidimensional contínuo, após a segunda lei da termodinâmica 7. O gradiente em toda a superfície é uma função do comprimento da tabela e as diferenças entre as temperaturas finais. A mesa e plumbing são normalmente alojados em um compartimento isolado com tampas de acesso. O gabinete isola a mesa do seu entorno, criando um gradiente uniforme em toda a superfície com pouca variação de temperatura. O recinto de isolamento pode ser suportada por pernas ou colocado sobre uma superfície plana tal como uma mesa ou bancada. Para aplicações em que é necessário um controlo de temperatura uniforme, sem um gradiente, uma tabela pode ser configurado para produzir condições isotérmicas se ambas as extremidades circular o fluido à mesma temperatura.

Quando a tabela de inclinação está a funcionar correctamente, placas de Petri, os sacos de plástico seladas, recipientes de fundo plano, etc., são colocadas na superfície e termo-equilibrar para as várias temperaturas (Figura 1). A temperatura experimental em cada recipiente depende espaços aéreos que possam existir entre o recipiente e a superfície da mesa e a espessura e as propriedades de isolamento de cada recipiente. A tabela gradiente mantém efetivamente te amostramperatures perto da superfície, mas o controle é perdido acima da superfície. A falta de controlo da temperatura vertical, limita os tipos de experiências possível sobre uma mesa gradiente tradicional.

chapas de alumínio ou placas de união foram adicionados ao desenho tradicional tabela gradiente para melhorar o controlo da temperatura acima da superfície da mesa. Reforços foram soldadas em intervalos perpendicular à superfície da mesa. Os reforços facilitar o fluxo de calor por convecção vertical acima da superfície da mesa plana. As amostras colocadas entre reforços, têm superfícies com temperatura regulável em três lados proporcionando um controlo mais eficaz da temperatura. Clegg e Eastin 2 colocada areia de quartzo em uma superfície de mesa gradiente para criar controle de temperatura em profundidade. Clegg e Eastin 2 também experiências com a colocação de isolamento no topo da tabela. Webb et al. 9 colocados tubos cheios de terra sobre uma mesa em um esforço para maneira uniforme temperatura controle.

O novo tavel de criação relatado aqui tem nove 7,6 cm (3 polegadas) reforços elevados (tiras de alumínio) que são soldadas à superfície ao longo do comprimento da mesa (Figura 2). luminárias LED que emitem fotossinteticamente ativa freqüências são instalados nos lados da mesa para apoiar o crescimento das plântulas quando a tabela é fechada. O recinto isolado para a mesa thermogradient nesga é construído de um branco placas de PVC que são água, urdidura, e resistente. O objetivo deste artigo é descrever o novo design da tabela gradiente gusseted e possíveis aplicações.

Protocol

1. Preparação dos Banhos de circulação e Tabela

  1. Adquirir dois banhos que circulam com reservatórios que bombeiam, pelo menos, 10 L / min para controlar a temperatura em cada extremidade da mesa de thermogradient.
    NOTA: Um dos banhos de circulação deve refrigerar o reservatório, enquanto as outras necessidades apenas para aquecer.
  2. Inspecione banhos de circulação para garantir que seus filtros e reservatórios estão limpos.
  3. Identificar um local para a tabela e banhos. Posicionar os banhos de baixo da mesa, enquanto a bomba pode circular o fluido através da tabela acima. Coloque a mesa de gradiente a uma altura conveniente para remover tampas e atingir todas as posições na superfície.
    NOTA: A localização para a mesa e banho deve ser bem ventilado e livre de temperaturas extremas, relativamente livre de poeira, e ter acesso a circuitos elétricos para alimentar adequadamente os banheiros e sistema de iluminação.
  4. Encher cada de banho para o topo do tanque de reservatório com uma mistura de água e anticongelante (1: 1ratio) para melhorar a troca de calor e evitar o congelamento.
    NOTA: A concentração de anticongelante depende das especificações do banho e da temperatura da solução. Altas concentrações de anticongelante não são necessárias, a menos que as temperaturas subfreezing são gerados. anticongelante pura pode danificar algumas bombas de banho-maria.
  5. Ligar as entradas e saídas dos banhos com tubos flexíveis para os tubos de saída e de entrada de ar sobre a mesa, respectivamente, para criar um padrão de fluxo contínuo em ambas as extremidades quentes e frias opostos da mesa.
  6. Use tubos de plástico flexível de paredes espessas, com paredes inelásticos que não irá expandir sob pressão ou torção quando dobrados. Use colarinho-parafuso, abraçadeiras nas uniões de tubos para manter uma conexão livre de gotejamento quando o sistema é pressurizado. Enrole o tubo de circulação com isolamento de tubos de espuma para reduzir a troca de calor com o rodeia.
  7. Com as válvulas da tubulação aberta, momentaneamente ativar as bombas de circulação para verificar se há vazamentos e tubos desmoronadaque pode reduzir o fluxo. Ajuste as braçadeiras de parafuso se ocorrerem vazamentos. Verifique luminárias para garantir que eles estão funcionando corretamente.

2. Preparação da Tabela de Experimentação

  1. Forre o fundo da tabela de thermogradient entre reforços com material hidrofílico, como esteiras de efeito estufa capilar, toalhas de papel ou jornal nonglossy para distribuir água de forma mais uniforme.
  2. Encher a tabela uniformemente com um meio de crescimento a seguir ou até mesmo com os topos dos reforços. Embalar a mídia crescente força suficiente para remover bolsões de ar que interferem com o equilíbrio de temperatura.
    NOTA: O solo nativo também pode ser usado.
  3. Com a entrada de tabela e as válvulas do tubo de saída aberta, activar o banho de circulação, definindo um banho a uma temperatura de 5 ° C abaixo e o banho de oposta a uma temperatura 5 ° C acima da temperatura máxima desejada (5 a 40 ° C) no mínimo e, respectivamente, para explicar a perda de calor e ganho durante a circulação. monitor os banhos reservatório e adicionar uma mistura de água e anticongelante (etileno-glicol), conforme necessário, quando os níveis de cair como a solução em circulação enche os tubos na tabela.
  4. Ajustar a temperatura do banho até que os suportes de cultura desejadas temperaturas (5 a 40 ° C ou outras temperaturas experimentais desejados são alcançados) sobre a mesa de gradiente.
    NOTA: A temperatura exata é conseguido através de um processo iterativo de medição crescente temperatura media e ajustando os banhos até que as temperaturas de mídia em crescimento desejados são alcançados através da mesa.
  5. dataloggers de temperatura lugar em diferentes posições na tabela para registar as temperaturas dos meios de cultura ou no solo durante um experimento. Os dataloggers recomendadas são semelhantes em tamanho a uma bateria de hóstia em miniatura. Enrole os dataloggers em Parafilm para evitar danos causados ​​pela água e coloque em posições experimentais no meio de crescimento.
  6. Molhar os suportes de cultura uniformemente a 70-80% da capacidade máxima de retenção de águados meios de comunicação. solos mais úmidos conduzir o calor de forma mais eficiente entre os reforços.
    NOTA: A água tende a evaporar-se mais rapidamente da extremidade quente do quadro, de modo que aplicações mais frequentes podem ser necessários para repor as perdas por evaporação. A capacidade máxima de retenção de água é a quantidade de água retida no meio de crescimento após a saturação e a drenagem gravitacional de água durante 2 dias por meio de um recipiente com um fundo perfurado. O teor de humidade foi determinada gravimetricamente, antes e depois de secagem em forno a 105 ° C durante 72 h.
  7. Permitir que a tabela a equilibrar durante 24 horas para garantir as desejadas temperaturas (5 a 40 ° C) são alcançados ao longo antes de iniciar uma experiência.
  8. Incline a mesa, ajustando os pés em cada canto até que as encostas de mesa muito ligeiramente em direção ao canto com o dreno. Isso remove o excesso de umidade, evita manchas molhadas em cima da mesa, e incentiva teor de umidade uniforme. Coloque um recipiente por baixo do dreno para pegar o escoamento.
  9. NOTA: Como um exemplo de como o teste de germinação pode ser conduzido, plantamos 25 sementes de tomate (. Solanum lycopersicum L. cv Legend), melão (Cucumis melo cv Hales Melhor Jumbo.), Alface (Lactuca sativa L. cv Preto semeado. Simpson) e aveia (Avena sativa L. cv Swan) 2 cm de profundidade.
  10. Contar o número de plântulas que emergiram diária para calcular o tempo médio de emergência de acordo com a equação:
      Σ (n i i xt)
    MTE = -------------
    Σ (N i)
    NOTA: Onde n i; t é o número de dias a partir do início da emergência; e Σ n i é o número total de sementes surgiram.

3. Utilizar o Quadro Thermogradient

  1. Depois de ajustar os banhos para as temperaturas desejadas, substituir as duas tampas thermogradient tabela, as tampas transparentes folha interior-acrílico e uma tampa mais substancial de cloreto de polivinilo (PVC) isolados com poliestireno, para colocar a mesa. Ambas as capas no lugar fornecer as melhores propriedades de isolamento para reduzir o calor e perda de água durante o teste.
    NOTA: Se a luz ambiente ou luz auxiliar é montado por cima da mesa, apenas na tampa interior pode ser usada para transmitir a luz.
  2. Remova a tampa externa para verificar a tabela através das tampas interior de acrílico. Retire a tampa interna temporariamente para adicionar água ou outros insumos, temperatura verificação, ou gravar dados.
    NOTA: Em temperaturas mais altas, a água evapora rapidamente de solo úmido e condenses na parte inferior da tampa interior, porque a superfície é mais frio.
  3. Monitorar o sistema de perto durante as experiências de falta de energia, problemas de funcionamento de banho, vazamentos, ou flutuações excessivas nas temperaturas da tabela. Monitorar o nível de banho reservatório e, periodicamente, adicionar o líquido para repor as perdas por evaporação.

Representative Results

Recipientes rasos, como placas de Petri, pode ser posicionado sobre uma mesa tradicional unidimensional gradiente de modo que os efeitos de várias temperaturas experimentais podem ser avaliadas simultaneamente (Figura 1). Para aumentar a diversidade de aplicações de pesquisa possível sobre uma mesa thermogradient, 7,6 cm (3 polegadas) cantoneiras de alumínio de altura foram costura soldada alternadamente em ambos os lados de modo que cada pala fica perpendicular à superfície de 10,9 cm (4,2 polegadas) de distância em contacto íntimo com a superfície (Figura 2). Embora uma larga gama de espaçamentos de reforço são possíveis, 10,9 cm foi seleccionado para acomodar caixas de plástico quadrados "sanduíche" ou de recipientes de tamanhos similares, muitas vezes utilizados para testar a germinação das espécies de sementes pequenas ou de outras amostras biológicas (Figura 3). Ao contrário de uma mesa de inclinação plana convencional, o projeto de reforço acomoda solos e outros materiais friáveis ​​amorfos para tempera controladaexperimentos tura. Para remover o excesso de água, um furo de drenagem blindado e filtrada foi construído em um canto. Os calços ou "pés" em cada canto pode ser ajustado para inclinar a mesa para facilitar a drenagem por gravidade. Um pequeno intervalo entre as extremidades de lingueta e a parte externa da tabela permite que a água a fluir ao longo de um lado para o dreno canto.

As temperaturas do solo foram medidos no teor de humidade do solo 70-80% depois dos banhos foram circulante a uma temperatura constante, durante 24 horas com as tampas no lugar (Figura 4). A variação da temperatura medida depois de um período de equilíbrio de 12 h em quatro posições diferentes em toda a mesa foi de 0,4 ° C ou menos (Figura 4). Variação nas temperaturas perfil do solo medidos em três profundidades do solo foi maior nos extremos. A uma temperatura alvo de 13 ° C, registadores colocadas sobre a superfície de alumínio entre reforços registou uma média de 11,0 ± 0,0 ° C. madeireiros placed na superfície do solo em média de 13,5 ± 0,1 ° C. A temperatura do solo média geral em todos os três níveis para a temperatura alvo de 13 ° C foi de 12,3 ± 0,1 ° C. A uma temperatura alvo de 18 ° C, a temperatura média durante todo o perfil do solo foi de 19,1 ± 0,1 ° C. Variação na temperatura alvo de 23 ° C era maior do que a 18 ° C, com uma média de 23,8 ± 0,2 ° C. No outro extremo da temperatura, 29 ° C, a temperatura da superfície de alumínio tabela foi de 30,8 ± 0,2 ° C, enquanto a temperatura da superfície do solo foi de 25,7 ± 0,4 ° C. A temperatura média do solo em geral a 29 ° C foi de 28,2 ± 0,3 ° C (Figura 4).

espécies de sementes pode ser testado para as suas temperaturas ideais de germinação e crescimento de mudas em uma tabela thermogradient com reforços. Tomate e melão, ambas as culturas de estação quente considerados, germinadas em uma faixa de 14,1-40.2 ° C (Tabela 1, Figura 3). Matrizes de LED montado nas tampas de mesa e / ou emitem os lados do espectro fotossintética permitindo que as plantas crescem no solo a temperaturas experimentais solo quando a tabela é fechada (Figura 3). Crescimento das plântulas óptima para tomate ocorreu a 29,6 ° C com um percentagem de emergência de 100% e um tempo médio de aparecimento de 5,3 dias (Tabela 1, Figura 5). Emergência foi mais lento em outras temperaturas. Para o melão, a percentagem ideal surgimento foi de 96% eo tempo médio de emergência foi de 5,1 dias, tanto a 24,7 ° C (Tabela 1). Ambos alface e aveia são consideradas culturas de estação fria. Sementes de aveia germinadas numa gama de 5,1-40,2 ° C, o mais importante de todos sementes testadas (Tabela 1, Figura 5). Para aveia, a maior percentagem de emergência foi de 100% a 24,7 ° C e o aparecimento mais rápido foi de 3,4 dias a 29,6 ° C (Tabela 1, (Tabela 1).

Matriz de placas de Petri em experimento de ágar nutriente; Análise de crescimento microbiano em configuração de laboratório.
Figura 1: Uma tabela thermogradient plano tradicional com as tampas removidas isolados, mas com uma tampa de acrílico interior cobrindo ½ a mesa a mesa plana testes de desenho tradicional efeitos da temperatura sobre amostras em recipientes rasos.. O controlo da temperatura do gradiente é rapidamente perdido a distâncias acima da superfície uma vez que não existe qualquer barreira à mistura de ar. Experimentos que exigiam uma temperatura constante em profundidade não são viáveis usando este projeto. Por favor clique aqui para ver a laversão rger desta figura.

Desenho técnico da bandeja do refrigerador; dimensões, projeto de engenharia, projeto de fabricação.
Figura 2: Diagrama esquemático de uma placa thermogradient com reforços cantoneiras são soldadas longitudinalmente ponto de costura por cima da mesa perpendicular à superfície.. Um dreno em um canto remove o excesso de água. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Experimento de gradiente de temperatura com câmara de crescimento de plantas e configuração do solo sob iluminação LED rosa.
Figura 3:. Iluminado mesa thermogradient com reforços cheios de terra, sod, e recipientes para experimentos de germinação de sementes O gradiente nesta tabela é criada a partir de (final morna) esquerda para a direita (fim frio). Embora a concepção de reforço foi desenvolvido para utilização com o solo, recipientespode ser colocada entre os elementos de junção para experiências com espécimes pequenas. A planta luzes LED crescer pode ser montado nas tampas ou periferia e emitem frequências fotossinteticamente ativas e permitir que as plantas a ser cultivada no interior do recinto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras da temperatura do solo em diferentes profundidades e temperaturas-alvo, mostrando a variação espacial.
Figura 4. As leituras de temperatura a partir de posições de solo diferentes em uma tabela thermogradient nesga. Loggers de temperatura foram colocados no solo através da mesa para a parede esquerda, centro-esquerda (20 cm da parede à esquerda), de centro-direita (40 cm da parede esquerda) e, no meio do caminho parede direita entre reforços. posicionamento inferior do logger de temperatura foi próximo à superfície tabela de alumínio 8 cm abaixo do topo do solo, enquanto colocação center foi approximatEly 4 cm abaixo do solo. loggers de temperatura colocados em cima do solo foram descobertos. Valores acima de barras indicam as temperaturas médias globais ± erro padrão da média (n = 72). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Crescimento das plantas vs. temperatura; fotos de experimentos; câmaras de crescimento em temperaturas variadas: 5-40°C.
Figura 5:. Mudas de aveia e tomate cultivadas durante 14 dias em thermogradient tabelas ao longo de um intervalo de temperatura de 5 a 40 ° C A figura ilustra como a germinação e o crescimento de plântulas de várias espécies podem ser avaliadas no solo em simultâneo ao longo de um intervalo de temperaturas numa única experiência para simular condições de campo. Principais (esquerda e direita) imagens mostram a tabela de thermogradient quando visto verticalmente. Inferior (esquerda e direita) imagens mostram a mesa na orientação horizontal. alcohol termómetros foram colocadas no solo para controlar rapidamente a temperatura durante todo o experimento.

8,7
Temperatura-alvo A temperatura medida Tomate Melão Alface Aveia
EM † MTE †† EM MTE EM MTE EM MTE
° C ° C % dias % dias % dias % dias
5 5.1 0 0.0 0 0.0 78 11,4 46 12,7
10 0 0.0 0 0.0 92 7,5 58 12,5
15 14.1 100 10,8 16 13,8 68 5.9 96 7.2
20 19.8 100 7.2 84 7,5 66 6.5 100 5.4
25 24,7 100 6 96 5.1 22 8.1 100 3.7
30 29,6 100 5.3 92 5.5 4 12,5 98 3.4
35 36,1 94 7 92 4.4 0 0.0 94 4,5
40 40,2 72 7.8 88 5.1 0 0.0 10 8.2
† surgimento de sucesso (EM) foi marcado quando mudas tinham pelo menos um cotilédones aberto.
†† O tempo médio de aparecimento (MTE) foi calculada pela soma dos produtos das sementes Número que surgiram cada dia por o número do dia e dividindo-se pelo número total de sementes que surgiram para cada tratamento.

Tabela 1: Germination de tomate, melão, alface e aveia Sementes em solo em oito temperaturas em uma tabela Thermogradient. Os números em negrito mostram os valores ideais para cada espécie e ilustram a dependência da temperatura de diferentes espécies de cultivo. O experimento foi conduzido por 14 dias em substrato e da mídia foi regada diariamente ou quando necessário para manter o solo visivelmente húmida. Os dados são baseados em 25 sementes para cada espécie.

Discussion

Os autores não têm nada a divulgar.

Disclosures

As tabelas termogradientes tradicionais criam uma faixa de temperaturas em toda a superfície. A soldagem de reforços perpendiculares à superfície de uma mesa termogradiente controlará a temperatura em profundidade, aumentando as possíveis aplicações de pesquisa.

Acknowledgements

Agradecemos a Kent J. Bradford e seus alunos do Centro de Biotecnologia de Sementes da UC Davis por registrar os dados de emergência de mudas.

Materials

Tubo de PVC trançado Spectrum Technologies Inc Industrial
Tabela termogradienteAppalachian Machinge IncMesa termogradiente reforçada feita sob medida (esquemas estão incluídos no manuscrito). A fabricação e soldagem de alumínio foram realizadas pela Appalachian Machinge Inc. 5304 State Rd 790, Dublin, VA 24084.
Armário de placa de polímero isoladoTASCO LLCO armário de placa de polímero isolado contendo a placa de alumínio foi construído pela TASCO LLC,  1440 Roanoke Street, Christiansburg, VA 24073 
Blue Hawk Cavalete de Aço DobrávelAjustável Lowes Home Improvement162111Modelo #: 60142 Cavaletes de Aço Dobrável Ajustáveis
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Seeds (200 sementes)Johnny's Selected SeedsSementes de aveia, alface, tomate, melão da Johnny's Selected Seeds 955 Benton Ave, Winslow, ME 04901 ou qualquer outra semente para teste de germinação, 
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References

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