Injecção Intrarenal de Escherichia coli Em um modelo de rato de peleonefrite

Resumo

Este manuscrito descreve um modelo cirúrgico de pielonefrite em ratos usando infecção intra-renal direta por Escherichia coli na pelve renal. O procedimento experimental pode ser utilizado para estudar a patogênese da pielonefrite, bem como a inflamação e fibrose associadas.

Resumo

A pielonefrite é uma infecção bacteriana do rim e é mais comumente causada por Escherichia coli. Infecções recorrentes podem causar inflamação renal significativa e fibrose, resultando em declínio da função renal. Antes que o melhor manejo clínico e a prevenção da pielonefrite possam ser instituídos, um modelo animal confiável deve ser estabelecido para estudar os mecanismos de progressão, recorrência e eficácia terapêutica. O modelo de infecção transuretral imita de perto a pielonefrite humana, mas exibe uma variação considerável devido à sua dependência do refluxo uretral para transportar a bactéria para o rim. Aqui, um protocolo cirúrgico detalhado para a realização de injeções bacterianas na pelve renal de ratos é fornecido e confirmado por ressonância magnética (MRI) não invasiva. Usando este protocolo, os animais recebem exposição direta a uma concentração desejada de bactérias E. coli e podem se recuperar totalmente do procedimento cirúrgico com cuidados pós-operatórios adequados. Isso facilita as avaliações longitudinais subsequentes de ressonância magnética dos modelos animais experimentais para comparação com controles salinos (simulados). Usando essa abordagem de entrega direta, a gravidade da infecção é controlável e aplicável para estudos mecanicistas de progressão, bem como para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento.

Introdução

Os modelos de roedores têm sido utilizados para estudar numerosas manifestações de doenças humanas, incluindo pielonefrite e infecções do trato urinário (UTI). As UTIs são um problema de saúde global e podem afetar crianças, homens e mulheres de todas as idades. ^{1 , 2 , 3} A manifestação inicial de UTIs inclui cistite, e se a infecção ascende ao longo do ureter, pode ocorrer uma infecção renal (pielonefrite). Ao mesmo tempo, a prevalência de diabetes está se aproximando de 400 milhões de pessoas em todo o mundo. ^{4 , 5} Importante, a incidência de UTI pode ser até 4 vezes maior em pacientes obesos ou com diabetes mellitus tipo 2, resultando em maior risco de infecção recorrente de UTI (rUTI), sepse, fibrose renal de pielonefrite e disfunção da bexiga. ^{6 , 7 , 8} RoedorOs modelos são importantes no estudo de UTI, porque as terapias antibióticas atuais produzem uma resposta preventiva sustentada somente em um subconjunto de pacientes com UTI. Para melhorar o atendimento clínico de UTI, os principais passos são compreender o mecanismo da rUTI e seus processos fisiopatológicos de infecção aguda a inflamação à fibrose, bem como o impacto do diabetes mellitus tipo 2.

O objetivo de melhorar os modelos animais é desenvolver técnicas que permitam uma avaliação mais precisa da progressão da doença e das intervenções terapêuticas. Várias abordagens diferentes foram empregadas para induzir pielonefrite em ratos e / ou camundongos para estudar a fisiopatologia do dano renal, o efeito do tratamento antibiótico e outros aspectos do curso natural das UTIs. Uma abordagem comum para estabelecer UTI retrógrada é o cateterismo transuretral. ^{10 , 11 , 12 , 13 <}/ Sup> Este método introduz bactérias através da uretra na bexiga urinária de animais anestesiados. Embora esta técnica simula de perto a pielonefrite humana, a incidência real e a magnitude da infecção por pielonefrite podem ser altamente variáveis ​​devido a múltiplos fatores, incluindo a falta de refluxo ureteriano espontâneo ou micção urinária durante ou imediatamente após a inoculação. ¹¹ Como resultado, a variabilidade experimental na indução de uma infecção de pielonefrite ascendente pode limitar a utilidade deste modelo para estudar infecções renais, bem como estratégias terapêuticas.

Este relatório descreve um modelo de rato de pielonefrite cirúrgico onde E. coli é diretamente injetado no rim do rato. Apesar de este modelo de rato ser invasivo, a quantidade de E. coli administrada ao rim pode ser efetivamente controlada, possibilitando uma infecção e inflamação robusta do rim. ¹⁴ Dentro deste procedimento, também descrevemosComo essas infecções renais induzidas podem ser monitoradas longitudinalmente com a Ressonância Magnética In vivo (MRI).

Protocolo

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados do Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais (IACUC) na Case Western Reserve University. A duração do procedimento cirúrgico descrito abaixo é de aproximadamente 45-60 min. O procedimento de ressonância magnética em si é de aproximadamente 15 min para cada ponto do tempo.

1. Anestesia

1. Anestesiar o rato na câmara de isoflurano ajustada a 2% de isoflurano misturado com oxigênio para facilitar o manuseio e restrição de animais antes da administração de anestesia injetável intraperitoneal.
2. Após 3-5 minutos de exposição ao isoflurano, verifique se o animal é anestesiado e não exibe resposta à pitada do dedo do pé.
3. Mais rato sedado com injeção intraperitoneal de uma mistura de xilazina e cetamina: 75 mg / kg de cetamina / 10 mg / kg de xilazina. Ao realizar injeções intraperitoneais, retire a agulha para garantir que partes do intestino ou outros órgãos vitais não tenham sido perfurados.
4. EuNjeção 2 mg / kg de bupivacaína subcutaneamente no local da incisão para fornecer alívio da dor tópica.

2. Preparação da área cirúrgica

1. Esterilizar instrumentos e suprimentos cirúrgicos antes de serem utilizados para cirurgia e colocar na almofada cirúrgica para esterilidade. A maioria dos instrumentos e suprimentos podem ser autoclavados e reutilizados.
2. Use luvas estéreis para todos os procedimentos cirúrgicos.
3. Use uma lâmina elétrica para raspar a pele do lado direito do animal. Raspar o animal do fundo da caixa torácica até o topo da perna traseira proporcionando uma grande área livre de cabelo para a incisão.
4. Coloque o animal em uma almofada cirúrgica estéril para isolar a área desinfectada das áreas circundantes.
5. Esfregue a pele com um desinfetante, como povidona iodo ou betadina. Comece a esfregar no centro do local cirúrgico e se mova para o exterior de forma circular. Repita pelo menos três vezes com uma nova limpeza de povidona iodo ou betadina.
6. Esfregue o local cirúrgico com 70% de cotonete com álcool até a pele ficar clara, pois o iodo pode ser tóxico se for absorvido.

3. Procedimento cirúrgico

1. Mantenha este procedimento em condições assépticas.
2. Posicione o animal anestesiado em uma cama de aquecimento quente na posição de decúbito lateral esquerdo com o flanco direito voltado para cima.
   NOTA: Deve-se ter cuidado para manter a temperatura corporal central do animal a 35-37 ° C para prevenir a hipotermia. Esta cama de aquecimento também deve ser esterilizada conforme necessário para manter condições assépticas.
3. Sinta-se para a caixa torácica e faça uma pequena incisão retroperitoneal dorsal direita de 2-3 cm usando uma lâmina de bisturi esterilizada de tamanho 10 começando no fundo da caixa torácica.
4. Coloque a gaze estéril longitudinalmente ao longo de cada lado da incisão.
5. Dissecte o tecido subcutâneo, gordura e músculos para visualizar e acessar a cavidade abdominal. Use tesoura de ponta curvada para permitir uma penetração mais profundaRacionar em ferida e cortar tecidos grossos.
6. Uma vez que o fígado é claramente visível e acessível, use fórceps sem corte para retrair o fígado para cima.
7. Usando outro par de fórceps contundentes, por outro lado, exponha o rim direito, então fica sentado fora da cavidade abdominal.
8. Use o ponteiro do dedo e o polegar da mão esquerda para segurar o rim na posição. Com a mão direita, injete lentamente e de forma constante 0,1 ml de solução de E. coli UTI89 (concentração entre 1 x 10 ⁸ -1 x 10 ⁹ ) de uma seringa estéril para a pelve renal (que aparece como uma bolha branca) ¹⁵ .
   NOTA: Prepare o título bacteriano conforme descrito na referência ¹⁵ .
9. Coloque uma tira de hemostato absorvível sobre a agulha para evitar a saída de inóculo no peritoneu. Puxe lentamente a agulha para fora da pelve renal.
   NOTA: Deve-se ter cuidado para não perfurar ou infectar os tecidos circundantes, resultando em infecções fora do alvoOns e / ou complicações.
10. Use uma seringa maior para enxaguar completamente o rim com solução salina normal antes de colocá-lo de volta na cavidade abdominal.

4. Suturas

Nota: A sutura que será enterrada nos tecidos deve ser 4-0 sutura trançada não absorvível. Suturas absorventes ou monofilamentos podem ser utilizadas para superfícies do corpo.

1. Coloque as suturas de forma uniforme e tão perto da borda do tecido quanto possível para evitar a obstrução do fluxo sanguíneo; Normalmente não é necessário mais de 0,3 cm da borda.
2. Segure a pele e evite-a ligeiramente usando um par de fórceps com dentes finos e gire o suporte da agulha em uma posição pronada em preparação para perfurar a pele.
3. Dirija a agulha através da espessura total da pele, supinando o pulso para girar a agulha e passá-la através da pele.
4. Repita este processo para a borda da pele mais próxima do indivíduo que executa o procedimento.
5. ApertarAs suturas são suficientes para se opor às bordas dos tecidos. Qualquer mais apertado irá obstruir o suprimento de sangue, cicatrização lenta e pode resultar em deiscência.
6. Amarre a sutura usando nós quadrados, como se fosse um simples ponto interrompido, exceto que apenas a corda curta é cortada, deixando cerca de uma cauda de 3-4 mm.
7. Após o primeiro ponto ter sido amarrado, prepare-se para colocar um segundo ponto a cerca de 3 mm de distância do primeiro e continue com a sutura em execução.
8. Uma vez que o fim da incisão é atingido, não puxe o último ponto completamente. Em vez disso, use o loop que está sendo mantido com o suporte da agulha aqui como a corda curta para amarrar a extremidade distal do fechamento da sutura.
9. Usando laços do instrumento, amarre a sutura usando nós quadrados. Isso resulta em 3 strands que sobrescrevem do nó preenchido na extremidade distal.

5. Recuperação de animais

1. Injete 2,1 mg / kg de Yohimbina intraperitonealmente após a cirurgia para reverter a anestesia. UMAEspera-se que os nimais se recuperem completamente do procedimento cirúrgico após 3-5 horas.
2. Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento (para evitar hipotermia) e roupa de cama suave absorvente após a cirurgia.
3. Fornecer reidratação com líquidos orais ou parenterais até que ele possa retornar à alimentação normal (dentro de 24 horas). Injetar aproximadamente 0,6 ml de solução salina normal peritonealmente imediatamente após a cirurgia para limitar os efeitos de desidratação.
4. Forneça analgesia conforme descrito no protocolo de uso e cuidado de animais aprovado pela IACUC. Injete 5 mg / kg de carprofen por via subcutânea para o tratamento da dor.
5. Monitorar incisões regularmente para inchaço, exsudato, dor ou deiscência.

6. Validação por imagem de Ressonância Magnética

1. Realizar i n vivo em experiências MRI alto campo animal pequeno ressonância magnética.
2. Induzir anestesia com 3% de isoflurano em oxigênio e posicionar o animal com o rim direito no isocentro no scanner MRI e apropriadoComia bobina de radiofrequência. Fornecer animais com 1-2% de anestesia com isoflurano continuamente ao longo do procedimento de imagem por meio de uma nosecone.
   NOTA: Para as imagens de MRI in vivo mostradas na Figura 1 , utilizou-se uma bobina de volume de tamanho de rato (diâmetro interno = 72 mm).
3. Use um sistema de monitoramento e controle de animais para manter a taxa de respiração de cada animal (40-60 respirações / min) e temperatura corporal central (35 ± 1 ° C).
4. Use uma aquisição de MRI de eco de rotação multi-fatia e multi-eco para obter imagens ponderadas axiais de alta resolução de ambos os rins infectados e de controle. Os parâmetros típicos de aquisição de MRI são o tempo de repetição = 5,000 ms, tempo de eco = 40 ms, espessura da fatia = 2,0 mm, resolução espacial no plano = 200 μm, 3 médias de sinal e um tempo de aquisição de 8 min.

Resultados

As técnicas de imagem médica oferecem a oportunidade de avaliar de forma não invasiva UTI e eficácia terapêutica. Portanto, a RM foi utilizada para validar a indução de infecção aguda após a injeção de 1-2 x 10 ⁷ UTI89 E. coli e para visualizar as alterações no rim antes e após a cirurgia. A Figura 1a-b mostra uma região progressivamente crescente de infecção renal (setas amarelas). As imagens de ressonância magnética obtidas para cada animal nos dias...

Discussão

A pielonefrite aguda ascendente em roedores (por exemplo, ratos e ratos) pode ser produzida por cateterismo transuretral. ^{16 , 17 , 18} Este método de infecção transuretral é vantajoso por não ser invasivo e simula a fisiopatologia humana da infecção ascendente. ^{17 , 18 , 19 , 20} No entanto, e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Absorvente	Fisher	14-127-47
Almofada de Gaze de Algodão Estéril Fisher		22-415-469
Luvas Cirúrgicas de Látex	Henry Schein Animal Health	21540
Tesoura Mayo Curvada	Fisher	S17341
Reta Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Cabo de bisturi	Estéreis Fisher	08-913-5
Seringa Luer-Lok
	BD Biosciences	301031	Para lavagem salina
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 pol. Agulha	BD Biosciences	305143
30 G 1 pol. Agulha	BD Biosciences	305128
Seringa de Insulina U-100	Exel International	25846	Para injeções de medicamentos
Isoflurano	Henry Schein Saúde Animal	050033
Xilazina	Henry Schein Saúde Animal	33197	Injetar IP
Cetamina	Patterson Vetrinário	07-881-9413	Injetar IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Injetar IP após cirurgia
Bupivacaína (Marcaína)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Injete SQ no local da incisão
4-0 Sutura Intestinal Crômica	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Sutura Vicryl Trançada	Ethicon Inc.	J304H
1 ml Seringa SubQ	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 ou CFT073	ATCC	700928
Surgicel Hemostat Absorvível	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR

Lâminas de Bisturi Fisher 53220 1 ml BD Biosciences 309628 Para injeções bacterianas Seringa Luer-Lok de 20 ml