Este relatório descreve protocolos para caracterizar as interações entre proteínas de membrana externa bacteriana e a vitronectina regulador do complemento humano. Os protocolos podem ser usados para estudar as reacções de vinculação e função biológica da vitronectina em qualquer espécie bacteriana.
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Artigo de método
Ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro
Neste artigo
Resumo
Resumo
As bactérias utilizam reguladores de complemento como um meio de evasão da resposta imune do hospedeiro. Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar a aquisição de vitronectina papel em peças de superfície da célula bacteriana em resistência para o sistema imunológico do hospedeiro. Experimentos de citometria de fluxo identificaram vitronectina plasma humano como um ligante para a proteína de membrana externa bacteriana do receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Um ensaio enzima-lig da imunoabsorção foi empregado para caracterizar as interações da proteína-proteína entre proteína recombinante purificada H e vitronectina, e vinculação afinidade foi avaliada usando interferometria de bio-camada. A importância biológica da vinculação da vitronectina a proteína H na superfície da célula bacteriana em evasão da resposta imune do hospedeiro foi confirmada usando um ensaio de resistência de soro com soro humano normal e vitronectina empobrecido. A importância da vitronectina na adesão bacteriana foi analisada usando lâminas de vidro com e sem revestimento vitronectina, seguido de coloração de Gram. Finalmente, a adesão bacteriana em monocamadas de células epiteliais alveolares humana foi investigada. Os protocolos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para o estudo de todas as espécies bacterianas de interesse.
Introdução
Vitronectina (Vn) é uma importante glicoproteína humana envolvido na manutenção da homeostase através de regulamentação do sistema fibrinolítico. Vn também funciona como um regulador de complemento inibindo o caminho de complemento terminal durante a formação do complexo C5b6-7 e polimerização C9. Vários patógenos bacterianos foram mostrados para recrutar Vn à superfície da célula, como um meio de resistir ao complemento deposição1,2,3. Além disso, Vn funciona como uma molécula de "sanduíche" entre bactérias e receptores de células epiteliais anfitrião, assim, promover a ades....
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Protocolo
1. análise de Vn como um ligante de proteína de superfície bacteriana
-
Deteção de Vn-ligação na superfície bacteriana usando citometria de fluxo
Nota: Em citometria de fluxo, costumávamos lado scatter e dispersão frente portão eventos positivos. Para examinar as interações com Vn, Hif clínico isolados (n = 10)7 foram selecionados juntamente com Escherichia coli BL21 (DE3) como um controle negativo (Figura 1A).- Cultura Hif clínico isolados em suplementado com 10 µ g/mL NAD e hemina a 37 ° C com agitação a 200 rpm (BHI) de infusão cérebro-coração. Use me....
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Resultados
Vn-vinculação à superfície de bactérias foi determinada por citometria de fluxo. Hif todos os isolados clínicos testados neste estudo recrutou Vn à superfície da célula. Nenhuma interação de Vn com superfície celular foi observada para a tensão de controle negativo de e. coli (Figura 1A). Como mostrado na Figura 1B, PH é uma major Vn-proteína na superfície das células de Hif. Vinculação .......
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Discussão
Patógenos bacterianos recrutam Vn à superfície da célula e utilizam este regulador de complemento para impedir a deposição de factores do complemento e conclusão da membrana ataque complexo2. Vn também funciona como uma molécula de ponte entre proteínas de superfície bacterianas e receptores de superfície celular hospedeiro, permitindo assim a patógenos de aderir à superfície das células epiteliais e posteriormente mediar a internalização. Neste estudo, descrevemos os protocolos que podem ser usad.......
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesses financeiros.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação de Anna e Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e Edla Johansson Foundation, o sueco Medical Research Council (conceder o número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), a Fundação de câncer da Universidade Hospital em Malmö, a sociedade Physiographical (Fundação do Forssman) e o Conselho de Condado de Skåne pesquisa e Fundação para o desenvolvimento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| e resfriador de bloco seco | Eppendorf | 5355 | 1,5 mL |
| Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL | BD Falcon | 60819-138 | 12 &vezes; 75 mm estilo |
| 5% CO2 incubadora fornecida | Thermo Scientific | ||
| tubo de fundo redondo de poliestireno de 6 mL | VWR | 89000-478 | Estilo 12 &vezes; 75 mm com tampa |
| Placas de 24 poços | BD Falcon | 08-772-1H | Grau de cultura de células |
| 30% Peróxido de hidrogénio (H2O2) Solução | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Grau de análise laboratorial |
| 75 cm2 frasco de cultura de tecidos | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| Placa de fundo plano preta de 96 poços | Greiner Bio-One | 655090 | Tratamento para cultura de tecidos µ Placas pretas claras |
| A549 Linha celular humana | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Enzima de desprendimento celular (Accutase) | Sensores Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Grau de Cultura de Células |
| AR2G | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor para proteína imobilizada por acoplamento de aminos |
| Acetona | VWR | 97064-786 | Grau de análise |
| albuminas de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Adequado para cultura de células |
| Papel bibuloso | VWR | 28511-007 | |
| Interferômetro de biocamada | Pall Life Science | FB-50258 | Equipamento de medição de interferometria de bicamada |
| Solução violeta de cristal | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (proteína de ligação C4b) | Complement Technology, Inc. | A109 | Comprado como forma líquida congelada |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Solução de carbol-fucsina | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Ácido cítrico | Sigma-Aldrich | 251275-500G | de grau da American Chemical Society (ACS) |
| Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | ||
| E. coli hospedeiro (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Expressão de proteína |
| hospedeiro F12 médio | Sigma-Aldrich | D6421 | Citômetro de fluxo de grau de cultura celular |
| BD Biosciences | 651154 | Grau de análise celular para aplicações de pesquisa | |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Adequado para cultura de células |
| Soro humano normal (NHS) | Complement Technology, Inc. | de soro humano combinado | do NHS |
| AbD Serotec | STAR88F | ||
| Gentamicina | Sigma-Aldrich | G1397 | Grau de cultura de células |
| Glicose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G9391 | Adequado para cultura de células |
| Hemocitômetro | Marienfeld | 640210 | |
| Anticorpos anti-His tag conjugados com HRP | Abcam | ab1269 | Fator humano policlonal |
| H | Complement Technology, Inc. | A137 | Comprado como Congelado forma |
| líquida C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Solução congelada |
| Albumina de soro humano | Sigma-Aldrich | A1653-10G | pó liofilizado |
| Coluna de resina de afinidade de histidina (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Colunas pré-embaladas com Ni Sepharose |
| PH marcado com His | Recombinantemente expresso e purificado em nosso laboratório | ||
| Solução de iodo | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Metanol | VWR | BDH1135-1LP | Análise de grau |
| Microscópio | Olympus | IX73 | Microscópio invertido |
| Lâminas de microscópio | Sigma-Aldrich | S8902 | simples, tamanho 25 mm & vezes; 75 mm |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmídeo contendo terminal C 6x His-tag na espinha dorsal (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | Para ELISA |
| Hidróxido de Potássio (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grau |
| Ovelha anti-anticorpos Vn | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Agitador de plataforma |
| Cantil de cultura de tecidos | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Termomisturador | Sigma-Aldrich | T3317 | Agitador de aquecimento e resfriamento de bloco seco |
| Tetrametilbenzidina | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | Grau ELISA |
| Vitronectina (Vn) de plasma humano | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | grau de cultura de células |
Referências
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al.
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Reimpressões e permissões
