Caracterizando o transporte de elétrons através de biofilmes vivos

Resumo

É apresentado um protocolo para medir a condutividade elétrica de biofilmes microbianos de vivos sob condições fisiologicamente relevantes.

Resumo

Aqui vamos demonstrar o método de retenção de eletroquímica usada para caracterizar a condutividade elétrica de biofilmes microbianos eletrodo-cultivadas sob condições fisiologicamente relevantes. ¹ estas medições são executadas em biofilmes de viver em meio aquoso, usando a fonte e drenagem eletrodos estampados em uma superfície de vidro em uma configuração especializada referida como uma matriz de eletrodo interdigitantes (IDA). Um biofilme é cultivado que se estende através da abertura, conectando a fonte e o dreno. Potenciais são aplicadas aos eletrodos (E_S e E_D) gerando uma corrente de dreno-fonte (I_SD) através do biofilme entre os eletrodos. A dependência da condutividade elétrica em potencial de portão (a média dos potenciais fonte e o dreno, E_G = [E_D + E_S] / 2) é determinado sistematicamente alterando o potencial do portão e o dreno-fonte resultante de medição atual. A dependência da condutividade no portão potencial fornece informações mecanicistas sobre o processo de transporte de elétrons extracelular subjacentes a condutividade elétrica do biofilme específico sob investigação. O método de medição associada electroquímico descrito aqui é baseado diretamente no usado por M. S. Wrighton^2,3 e colegas e R. W. Murray^4,5,6 e colegas em da década de 1980 é para investigar os polímeros condutores de película fina.

Introdução

Transporte de elétrons extracelular (EET) é um processo que permite que certos microorganismos para o transporte de elétrons entre os processos metabólicos intracelulares e aceitadores de electrões insolúveis ou doadores que residem fora da célula, variando de minerais naturais para eléctrodos. Em alguns casos, EET permite que microorganismos formar eletricamente condutivos várias células grossos biofilmes em superfícies de eletrodo, em que as células não em contacto directo com o eléctrodo podem ainda utilizá-lo como um aceptor de elétrons metabólica ou doador. Há considerável interesse em tais biofilmes como catalisadores de eletrodo para diversas aplicações, tais como Eletrosíntese microbiana, contaminantes de detecção/remoção e geração de energia remoto e armazenamento,^{,7,89 ,10,11,12,13,14} devido a diversidade de processos metabólicos realizados por microorganismos e a durabilidade dos biofilmes microbianos em comparação para bioelectrodes enzimáticos. ^{15 , 16} além disso, EET caminhos potencialmente podem ser utilizados para mudanças eletricamente controle ou sinal de ocorrência natural ou geneticamente processos metabólicos microbianos envolvidos, por exemplo, na produção de um produto desejado ou detecção de um analito de alvo ou estímulo. A condutividade elétrica de biofilmes de electrocatalytic, que define-os para além de outros materiais biológicos, é um aspecto central de suas propriedades electrocatalytic, no entanto, entende-se pouco sobre o processo subjacente de EET no ambiente do eletrodo, e o que é conhecido é altamente contestado. ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24}

Descrito aqui é um método de 2-eletrodo para medir a condutividade através da vida, eletrodo-crescido biofilmes usando matrizes de eletrodo interdigitantes (IDAs). IDAs consistem em paralelos retangulares eletrodos estampados na superfície de vidro plano, tais que todas as outras bandas é conectada em lados opostos da matriz resultante em 2 eléctrodos (a fonte e o dreno). Exame cuidadoso de uma IDA (ver, por exemplo, a Figura 6.12b de ref #1) revela que as lacunas que separam as faixas adjacentes estão também ligados em forma a forma uma única lacuna que tece e para trás através da matriz separando os dois eletrodos. O resultado é uma longa e estreita abertura separando os eléctrodos de fonte e o dreno, produzindo correntes de fonte-dreno muito alta quando um material condutor é formado, elenco, polimerizado ou crescido (no caso do tipo de biofilmes considerados aqui) sobre a matriz. Além disso, o pequeno tamanho dos eléctrodos resulta em pequeno plano atual devido a capacidade de carga e a alteração no estado de oxidação do material condutor com mudança de portão potencial, desde que a quantidade de material necessário para fazer a condutividade as medições utilizando IDAs são tão pequenas. A técnica de IDA-based gating electroquímico descrito aqui, desenvolvido para caracterizar polímeros condutores de película fina,^2,3,4,25 só recentemente tem sido aplicado a sistemas vivos. ¹⁸ outra técnica usada para medir a condutividade de biofilmes de vida utilizou um grande formato dividir eletrodos fonte e dreno e fonte metros para definir o portão potenciais. ^{26 , 27} no entanto, preocupações com esses métodos têm sido detalhadas anteriormente. ¹⁸

O protocolo abaixo encapsula a nossa experiência com a fazer medições de condutividade de viver Geobacter sulfurreducens e biocathode MCL biofilmes. G. sulfurreducens é um eletrodo de modelo reduzindo o organismo capaz de usar materiais insolúveis, incluindo eletrodos, como o aceitador de electrões metabólico único. Além disso, formar biofilmes grossos que são capazes de transportar elétrons ao longo de vários comprimentos de célula, tornando-se um organismo modelo ideal para estudar a transferência de elétrons de longa distância extracelular anódica. Nós também incluímos detalhes para o estudo da biocathode MCL, uma comunidade mista aeróbio, autotróficas biofilme isolado do cátodo de uma célula de combustível microbiana bentônica. Biocathode MCL (nomeado para os três principais constituintes – Marinobacter, Chromatiaceaea e Labrenzia) é capaz de oxidar um eletrodo como seu doador de elétron único e transporte de elétrons ao longo de vários comprimentos de pilha, fazendo é um sistema interessante catódico para estudar. Além disso, biocathode MCL tem a mais alta condutividade relatada para um sistema vivo para data usando esses métodos. A inclusão destes biofilmes eletroativos diversa neste protocolo destina-se a destacar que esta técnica é aplicável para medir o transporte de elétrons através de qualquer biofilme de vida capaz de interagir eletricamente com eletrodos.

Protocolo

1. preparação de microeletrodos interdigitantes matriz (IDA)

1. Obter IDA disponível comercialmente eletrodos modelados sobre um substrato não condutora ou sintetizá-los usando métodos padrão litográficas. ²⁸
   Nota: Dimensões de IDA e/ou materiais podem ser variadas com base em condições desejadas para experiências diferentes. IDAs aqui utilizados foram obtidos comercialmente e consistia de dois microeletrodos ouro interdigitantes modelados sobre um substrato de vidro ligado às almofadas grandes eletrodo em lados opostos da matriz. Os eletrodos são expostos enquanto as linhas de ônibus ligando os eletrodos para as grandes almofadas de contato são revestidas com material isolante fino. IDAs usados aqui são compostas por dois conjuntos de 10 µm largura e 2 mm bandas de microeletrodos há muito ouro (fonte e dreno) espaçados distante 5 µm, modelada sobre uma superfície plana de vidro. IDAs usado aqui tinha 65 pares de eletrodo (130 bandas interdigitantes totais). Bandas alternadas estão ligadas às almofadas do eletrodo em lados opostos da matriz.
2. Fio e isolar IDA
   1. Ligue um fio para cada grande eletrodos pad usando condutivo epóxi prata.
      1. Prepare-se epóxi condutora de acordo com as instruções do fabricante para o epóxi específica em uso com uma ponta de vara ou pipeta mistura (instruções podem variar conforme o fabricante).
      2. Coloque um fio em cada bloco de ouro, seguro no lugar usando fita de laboratório. Cubra o fio e a almofada com epóxi prata usando uma ponta misturadora de haste ou pipeta.
      3. Cuidadosamente mova para um forno de 80 ° C durante 1 h a cura ou cura com base nas recomendações do fabricante para o epóxi prata condutor específico usado.
      4. Após a cura da cola epoxy, use um multímetro para garantir a ligação elétrica entre a extremidade do fio e as almofadas. A resistência entre o fio e a almofada deve ser < 5 Ω. Além disso, use o multímetro para verificar que não condutivo epóxi é Conectando várias almofadas do elétrodo, como este pode entrar em curto a matriz. Se condutivo epóxi é conectando diversas pistas, use um escriba para isolar os contatos.
   2. Isole a conexão epoxied revestindo a conexão com uma térmica, elétrica e material isolante à prova d'água. Resinas de poliuretano retardantes de chamas são muitas vezes adequadas.
      1. Retire a ponta de um tubo de centrifuga conico de 15 mL (até aproximadamente a marca de 2,5 mL) como um molde para o material de isolamento. Faça dois pequenos furos na parte inferior para os fios que se projetam através da utilização de uma agulha 21G.
      2. Insira a IDA do molde e fios através dos furos na parte inferior do molde.
      3. Prepare o material de isolamento específico. Siga as instruções fornecidas com a resina específica obtida.
      4. Pipetar o isolador para o molde, para que o epóxi prateado é completamente coberto (~2.5 mL) e deixe para secar de acordo com as especificações do fabricante.

2. instalação do reator eletroquímica, testes e inoculação

1. Configure a célula eletroquímica.
   1. Insira IDA, elétrodo contrário e eletrodo de referência a célula eletroquímica.
      Nota: O reator eletroquímico utilizado pode variar amplamente, enquanto todos os eléctrodos cabem dentro. Uma consideração é que o eléctrodo de referência deve ser tão próximo quanto possível para o eletrodo de trabalho dado os limites práticos do reator. Aqui, usamos um reator de câmara única com a referência eletrodo ~ 2-3 cm dos eletrodos de trabalho. Além disso, o elétrodo contrário deve ser maior do que o eletrodo de trabalho para garantir que isso não é limitante no sistema.
   2. Se trabalhar com uma cultura pura, esterilize o reator com o eletrodo contador dentro. Esterilizar o eléctrodo de referência por imersão em água sanitária para 10 min e água desionizada estéril durante 10 min. esterilizar a IDA por imersão em água sanitária para 5 s seguido de água desionizada estéril para 10 s antes da inserção no reator.
   3. Preencha a célula eletroquímica com estéril meio adequado para o crescimento do biofilme. Por g. sulfurreducens^17,18, use água doce média excluindo fumarato. Para biocathode MCL,⁹ uso médio da água do mar artificial. ⁹
   4. Conecte os eletrodos de um bipotentiostat. Conectar-se um eletrodo de IDA para a liderança de trabalho 1, o outro eletrodo de IDA para a liderança do trabalho 2, o eletrodo de referência para a pista de referência e o eletrodo contador para a liderança de contador.
2. Ensaios eletroquímicos de IDAs.
   Nota: O objetivo deste teste é para certificar-se de que os dois eletrodos são eletricamente isolados. Todas as técnicas eletroquímicas estão disponíveis no software usado para controlar o bipotentiostat.
   1. Realize testes de condutividade de controle (antes do crescimento do biofilme) para garantir a adequada função de IDA usando um bipotentiostat.
      1. Medida do potencial de circuito aberto de cada eletrodo para 1 min.
         Nota: Em alguns instrumentos, potencial de circuito aberto deve ser alcançado usando o programa de coleta de galvanostatic e definindo a corrente para 0 mA.
      2. Medida do potencial de circuito aberto de eletrodo 2 durante a execução de voltametria cíclica no eletrodo 1 entre + 0,2 V para +0.6 V (contra ela) a 20 mV/s.
         Nota: Outros limites e taxas de varredura para CV podem ser usadas se desejado. No entanto, Evite potenciais que resultarão na geração de hidrogênio ou oxigênio.
      3. Verifique se que o potencial de circuito aberto medido no eletrodo 2 não espelhem o potencial de eletrodo 1 durante o CV, utilizando o software potentiostat.
         Nota: O potencial de circuito aberto de eletrodo 2 pode mudar, mas deve ser independente do potencial de eletrodo 1.
      4. Repita os passos 2.2.1.1 através de 2.2.1.3 exceto controle o potencial de elétrodo 2 e medir o potencial de circuito aberto de eletrodo 1.
   2. Defina o potencial dos eletrodos de trabalho para o potencial de crescimento desejado do biofilme eletroativos relevantes utilizando o software bipotentiostat. Por exemplo, uso +-0,5 V (vs ela) para Geobacter sulfurreducens ou +0.31 V (vs ela) para biocathode MCL.
3. Crescer o biofilme eletroativos relevantes
   1. Inocule o reator eletroquímico de um cultura/enriquecimento das ações dos microorganismos eletroquimicamente ativos desejados utilizando técnicas microbiológicas assépticas padrão. Para testes padrão, inocular em um 01:20 ratio (inóculo para volume de reactor) de um OD₆₀₀ = 0,5 cultura.
   2. Definir a agitação no reator para o nível desejado (~ 200 rpm) e a incubadora / banho de água à temperatura desejada baseada sobre as condições de crescimento do biofilme de interesse. Para g. sulfurreducens, use 30 ° C para o crescimento ideal.
   3. Incube o sistema com base em requisitos específicos da microorganism(s) de interesse até o biofilme preenche a lacuna que separa os dois eletrodos. Para estacionário sulfurreducens g. biofilme, incubar ~ 7-10 dias. Para biocathode MCL, incube ~ 7 dias. Em cada caso, controlar a temperatura de 30 ° C.

3. eletroquímicos experimentos associados

1. Selecione os parâmetros experimentais que serão usados para determinar a dependência da corrente-potencial para as medições associadas.
   1. Determine a gama de potenciais de portão que será aplicado para a IDA para obter a corrente conduzida (I_SD) versus curva (E_G) potencial de portão para o sistema.
      Nota: A gama de potenciais portão examinados deve abranger todas as potencialidades com atividade redox possível. Se nenhuma informação sobre o sistema de interesse está disponível, uma gama ampla de potencial deve ser utilizado (-0.55 a +0.6 V vs ela). Uma abordagem de tentativa e erro pode ser usada para ajustar o intervalo baseado no sistema sob estudo. Portão potencial é definido como:
      
      onde a E_D é o potencial do eletrodo dreno e E_S é o potencial do eletrodo da fonte. A gama de potenciais portão usado é restringida pelos requisitos e limitações do sistema específico de interesse. ¹⁸
      Nota: Potenciais de fonte e o dreno que resultarão na evolução de oxigênio e hidrogênio devem ser evitados, pois estes processos podem danificar o biofilme.
   2. Determine a tensão de fonte-dreno (V_SD) que será usada como a força motriz para o transporte de elétrons através do filme da fonte para o dreno. Tensão de fonte-dreno é definido como:
      
      Nota: A tensão de fonte-dreno deve ser suficientemente pequena para que o eu_SD escala linearmente com V_SD. ¹⁷
   3. Escolha uma taxa de varredura (v) no qual E_G é alterada linearmente com o tempo que é independente do eu_SD para que o sistema pode ser aproximado para estar no estado estacionário para cada portão potencial.
      Nota: Uma taxa de varredura de menos de 0.002 V/s é usada frequentemente para sistemas biológicos. ^{29 , 30}
   4. Configurar o software bipotentiostat para realizar as medições associadas (ou seja, varrer o portão potencial) ao longo do intervalo selecionado, na tensão dreno-fonte selecionada e a taxa de varredura desejado com base nas considerações acima.
      Nota: para o anteriores associada as medições utilizando sulfurreducens g.,^17,19 E_G =-0.55 V de 0,6 V (contra ela), V_SD = 0,01 V ou 0.1 V, v = V/s 0,001. Para Biocathode MCL, E_G = 0,25 V 0,7 V (contra ela), V_SD = 0.002 V, v = 0,0002 V/s.
      1. Além disso, realizar uma medição da linha de base com V_SD = 0.000 V (ou seja, um CV em cada eletrodo individual tomado simultaneamente) no mesmo v escolhido na etapa 3.1.3.
   5. Realize medições associadas usando as condições em 3.1.4 sob ambos os volume de negócios (com doador de elétron solúvel ou aceitador presente) e não-volume de negócios (sem doador de elétron solúvel ou aceitador).
      Nota: Non-volume de negócios são condições vantajosas porque as medidas não são obscurecidas pela oxidação ou redução de compostos solúveis para o metabolismo celular, embora resultados semelhantes devem ser obtidos independentemente de qual condição é usada após subtraindo as correntes de fundo (detalhadas no 3.1.8).
      1. Alcançar condições de volume de negócios usando o mesmo meio de reator utilizado para o crescimento bacteriano, sobre o eletrodo. Este meio contém um dador de electrões solúveis, tais como acetato de sulfurreducens g.,¹⁷ ou aceitador, tais como oxigênio para Biocathode MCL.
      2. Alcançar condições de não-volume de negócios, tornando o mesmo meio de reator usado para o crescimento bacteriano, sobre o eletrodo, exceto omitir o dador de electrões solúvel ou aceitador. Depois de se assegurar que o potentiostat está desligado, retire o meio assepticamente e adicione no meio fresco sem o doador de elétron para sistemas anódicos ou aceitador para sistemas catódico. Como alternativa, você pode configurar um sistema de fluxo contínuo para substituir lentamente o meio com o meio desejado para nonturnover condições.
         Nota: Se o oxigênio é o aceitador de electrões solúvel (quanto biocathode MCL), sparge o sistema com uma mistura de ~ 15% CO₂ e 85% N₂ (ou uma mistura de gás que irá manter o pH correto no meio).
   6. Após a conclusão das medições associadas, use o software potentiostat para definir o potencial de cada eletrodo voltar para o crescimento potencial para permitir que o sistema de re-estabilização (usando os mesmos valores como em 2.2.2).
   7. Se estiverem reunidas todas as condições acima descritas (_SD é independente de v e escala linearmente com V_SD), eu converter_SD valores para condutividade usando as seguintes equações como descrito anteriormente,³¹
      
      
   8. onde G é a condutância e S é um fator de escala que é dependente de sistema e fatores em variáveis tais como tamanho do eletrodo, tamanho de abertura e altura de biofilme. Para certos sistemas, S pode ser determinado de equações pré-determinadas. ³¹ como alternativa, S pode ser calculada numericamente usando um software de modelagem, como detalhado anteriormente. ¹⁷
   9. Subtrai as correntes de fundo para identificar a forma e a magnitude da corrente conduzida. Ou subtrair a corrente gerada no V_SD = 0,00 V da corrente gerada no V_SD = 0,01 V ou subtrair o dreno atual da fonte de corrente gerado com um V_SD = 0,01 V. qualquer método remove fundo correntes, deixando somente a corrente conduzida.
2. Dependentes eletroquímica associada as medições da temperatura
   1. Determine o intervalo de temperaturas de interesse. Este intervalo é altamente dependente do sistema sob estudo, as temperaturas no entanto fisiologicamente relevantes devem ser usadas.
      Nota: Estudos anteriores usaram uma escala de temperatura de 10 ° C a 30 ° C para estudar o transporte de elétrons sob condições fisiologicamente relevantes para os microrganismos mesófilos. ¹⁷
   2. Obter um banho de água de recirculação ou incubadora para regular a temperatura do reactor e um reator de controle para garantir que o ponto de ajuste e a temperatura real do meio é o mesmo.
      1. Coloque um termómetro ou o termopar em um reator de controle onde seria a IDA.
   3. Eu fazer medições de_SD (ver 3.1.4) na faixa de temperatura selecionada em volume de negócios e nonturnover (descrito na etapa 3.1.5) condições usando o bipotentiostat a seguir um dos procedimentos descritos abaixo.
      1. Eu gerar_SD vs curvas E_G , como descrito anteriormente (ver 3.1), para cada temperatura na faixa de temperatura de interesse. Para materiais que apresentam condutividade redox, tais como sulfurreducens g. e Biocathode MCL, o pico de corrente de cada temperatura é usado para determinar o eu_SD vs dependência T.
         Nota: Este método é usado para gerar um cheio eu_SD vs E_G curva para cada temperatura, mas requer mais tempo do que a segunda opção.
      2. Alternadamente, definir e segurar a IDA no portão potencial que produz máximo conduzido atual usando o bipotentiostat (obtido a partir do_SD eu curva de vs E_G , passo 3.1.4) e gravar a corrente máxima conduzida usando o bipotentiostat enquanto a temperatura é um ciclo entre o intervalo de temperaturas selecionadas usando os controles a bordo do banho-maria ou incubadora.
         Nota: com a geometria do eletrodo/reator usada aqui, o que serão autorizados a estabilizar pelo menos 20 min e uma média estável eu_{SD SD} e T é usado para cada temperatura. Mais ou menos tempo de estabilização pode ser exigido com base no sistema específico. Este método é mais rápido do que o primeiro e causa menos stress para o biofilme. No entanto, cheio de curvas associadas não são geradas.
      3. A temperatura do ciclo de um conjunto de ponto para o outro e de volta novamente usando os controles a bordo da incubadora ou o banho de água para determinar a reversibilidade da reação para garantir que a temperatura de ciclismo não prejudique o biofilme.
   4. Redefinida a temperatura para a temperatura de crescimento normal usando os controles a bordo da banheira incubadora ou água e permitir que o sistema se estabilize.
      Nota: Para um condutor de redox, o eu_SD versus 1/T dados podem ser cabido com a expressão de taxa de Arrhenius, que permite o cálculo da energia de ativação da seguinte forma:
      
      
      onde E_um é a energia de ativação para a transferência de elétrons entre cofactores redox adjacentes e k é a constante de Boltzmann.

Resultados

IDAs foram ligadas, isoladas e testadas para garantir que os dois eletrodos eram eletricamente isolados uns dos outros (Figura 1). Reatores foram montados, inoculadas com g. sulfurreducense incubados até um biofilme construiu uma ponte sobre a abertura entre os eletrodos. O biofilme sulfurreducens g. pode ser visto visualmente para cobrir a matriz. Outros biofilmes podem exigir o pesquisador fazer um eletroquímica associada medições para ver...

Discussão

Durante a configuração do IDA, é crítico para testar que a fonte e o dreno não são curto-circuitados juntos antes da eletroquímicas associadas medições, como isso irá alterar o eu_SD vs E_G curva e pode levar a interpretações e resultados errados. Também é fundamental para selecionar V_SD e v tal que a corrente é linearmente dependente V_SD e independente de v. Se isso não for o caso, então, as equações acima descritas não podem ser utilizadas para calcular a condutividade.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
IDAs	CH Instruments	012125	Fabricado pela ALS-Japan; vendido pela CH Instruments
Wire	Digikey	W7-ND
Epóxi de prata condutor	Electroscopy sciences	12670-EE
Material isolante	3M	2131-B	Composto retardador de chama escocês
15 mL tubo de centrífuga cónico	VWR	89004-368
Agulha de 21g	VWR	BD-305165
Ponteiras de pipeta de 5 mL	VWR	82018-842
Pipetador de 5 mL	VWR	89079-976
Componentes médios de água doce	Sigma Aldrich	Todos os produtos químicos
Cloreto
Fosfato de sódio monobásico
Bicarbonato
Componentes de meio de água do mar artificial	Sigma Aldrich	Todos os produtos químicos
Cloreto
Cloreto de magnésio hexahidratado
Sulfato de magnésio heptahidratado
Cloreto
Bicarbonato
Cloreto de cálcio di-hidratado
Cloreto
Fosfato de potássio dibásico
Ag / AgCl eletrodo de referência	Basi	MF-2079
Contra-eletrodo de haste de grafite	Ciências de microscopia eletrônica	70230
Banho-maria de recirculação	Thermo Scientific	152-5256
Bipotenciostato	Instrumentos de pinho	WD-20	http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Barras de agitação	VWR	58947-114
G. sulfurreducens cultura	ATCC	51573
Reator revestido	Pine Instruments	RRPG085