Um método para medir RNA N 6 -methyladenosine modificações nas células e tecidos

Resumo

Um método de transferência Northern modificado para medir N ⁶ -methyladenosine (M ⁶⁾ Um modificações em RNA é descrito. O actual método pode detectar modificações em diversos RNAs e controles sob vários modelos experimentais.

Resumo

N 6-metiladenosina (m⁶A) modificações de RNA são diversas e onipresentes entre os eucariotos. Eles ocorrem em mRNA, rRNA, tRNA e microRNA. Estudos recentes revelaram que essas modificações reversíveis de RNA afetam o splicing, tradução, degradação e localização do RNA. Múltiplos processos fisiológicos, como ritmos circadianos, pluripotência de células-tronco, fibrose, metabolismo de triglicerídeos e obesidade também são controlados por modificações m⁶A. Imunoprecipitação/sequenciamento, espectrometria de massa e northern blotting modificado são alguns dos métodos comumente empregados para medir modificações m⁶A. Aqui, apresentamos uma técnica de blotting nordestino para medir modificações de m⁶A. O protocolo atual fornece boa separação de tamanho de RNA, melhor acomodação e padronização para vários projetos experimentais e delineamento claro de modificações m⁶A em várias fontes de RNA. Embora as modificações m⁶A sejam conhecidas por terem um impacto crucial na fisiologia humana relacionada aos ritmos circadianos e à obesidade, seus papéis em outros estados (pato) fisiológicos não são claros. Portanto, as investigações sobre as modificações de m⁶A têm imensa possibilidade de fornecer informações importantes sobre a fisiologia molecular.

Introdução

Modificações dinâmicas e reversíveis de RNA têm papéis importantes na homeostase do RNA. Quatro décadas atrás, as modificações de N 6-metiladenosina (m⁶A) foram encontradas em transcriptomas eucarióticos¹. Eles têm diversas funções no RNA mensageiro (mRNA), RNA ribossômico (rRNA), RNA nucleolar pequeno, RNA de transferência e microRNA². As modificações m⁶A do mRNA influenciam seu splicing³, tradução⁴, degradação⁵ e localização². Além disso, eles afetam a biogênese do ribossomo e a função do microRNA⁶. A conservação evolutiva das modificações de RNA m⁶A é observada em bactérias unicelulares para humanos multicelulares⁷. A delimitação dos papéis das modificações m⁶A está atualmente sob extensa exploração. Espera-se que os esforços forneçam novos insights sobre o controle da transcrição. Estudos recentes revelam que outras modificações químicas do mRNA⁸ também desempenham papéis críticos no metabolismo do RNA.

Ritmos circadianos⁹, pluripotência de células-tronco¹⁰, metabolismo de triglicerídeos⁴, fibrose¹¹, obesidade¹² e depressão maior¹³ são alguns exemplos de processos em que as modificações m⁶A são conhecidas por controlar os resultados. Muitos transcritos de genes do relógio circadiano têm m⁶sítios A¹⁴. A modulação de m⁶A metilase ou desmetilase provoca alterações no período circadiano¹⁵. Mettl3, uma m⁶A transferase, é um regulador da pluripotência de células-tronco. Uma deficiência de Mettl3 leva à letalidade embrionária precoce e ao priming de linhagem aberrante no estágio^{pós-implantação 10}. Uma deficiência de massa gorda associada à obesidade (FTO), uma m⁶A desmetilase, em adipócitos afeta a mobilização de ácidos graxos e o peso corporal por meio da regulação pós-transcricional de Angptl4⁴. Esses estudos revelam que o m⁶A não apenas controla o processamento do mRNA, mas também desempenha papéis críticos no desenvolvimento embriológico e na fisiopatologia. A função das modificações m⁶A tem implicações para considerações terapêuticas no futuro.

Vários métodos estão disponíveis para medir modificações m⁶A do RNA^16-18. Tradicionalmente, a cromatografia em camada delgada (TLC) e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) são usadas para estudar a distribuição de m⁶A em vários RNAs^19,20. A espectrometria de massa é uma ferramenta sensível para a detecção de modificações m⁶A no RNA. No entanto, o RNA precisa ser excisado por RNase em fragmentos curtos antes da análise por espectrometria de massa²¹. A imunoprecipitação e sequenciamento de metil-RNA (m⁶A-Seq)²² imunoprecipita RNAs fragmentados com anticorpos específicos m⁶A e realiza sequenciamento paralelo de RNA. Este método gera paisagens m⁶A em todo o transcriptoma. O mapeamento de alta resolução de m⁶A de reticulação e imunoprecipitação de resolução de nucleotídeos individuais (miCLIP) mapeia ainda mais as modificações de m⁶A em uma resolução de nucleotídeo único²³. Ambos os métodos fornecem detalhes da modificação de m⁶A em todo o transcriptoma, com informações de genes específicos. No entanto, quantificações e padronizações em ambos os métodos são difíceis se os experimentos exigirem a comparação de várias condições. Além disso, fragmentações de RNA para m⁶A-Seq alteram a estrutura original do RNA, o que pode afetar os níveis nativos de m⁶A. Para detectar modificações globais de m⁶A do RNA e suas mudanças em diferentes condições experimentais, relatamos um método que emprega um protocolo de northern blotting modificado. Este método resolve o RNA por peso molecular, usando eletroforese em gel¹⁸. Este procedimento fornece melhor padronização e quantificações para experimentos que envolvem várias condições ou amostras. Ele também fornece informações específicas de modificação m⁶A para diferentes RNAs, seja rRNA, mRNA ou microRNA.

Protocolo

NOTA: O total RNA m ⁶ A nível inclui rRNA, mRNA, e outros pequenos RNAs. Desde RNA ribossomal tem abundantes m ⁶ modificações A, a medição da m ⁶ levels terá de considerar este fato.

Isolamento 1. RNA

1. Usando a solução ribonuclease descontaminação (pulverizado sobre toalhas de papel), limpe as pipetas e superfícies das bancadas do laboratório. papel-toalha molhada com água livre de nuclease e limpar as pipetas e superfícies das bancadas do laboratório novamente.
2. Extração de RNA
   1. Isolamento de ARN total
      1. Usando um agitador suspenso, homogeneizar 50-100 mg de tecido ou 5-10 X 10 ⁶ células em 1 mL de solução de isolamento de ARN mantidas a 4 ° C.
         NOTA: Mais tecido (100-150 mg) pode ser necessária para amostras de tecido adiposo de ratos por causa das concentrações de ARN inferiores das mesmas. As amostras provenientes de rato coração, fígado, músculo esquelético, o pulmão, cérebro, e os macrófagos foram empregues ^quatro anteriormente.
      2. DentroCubate os homogenatos de amostra durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      3. Adicionar 100 uL de 1-bromo-3-cloropropano (BCP) por 1 ml de homogenato da amostra. Agitar vigorosamente os tubos durante 15 s e proceder para isolar o ARN total de acordo com as instruções do fabricante ^24.
   2. A purificação a partir de ARNm poliadenilado do RNA total isolado
      1. Purificar mRNA poliadenilados usando kits ou protocolos disponíveis.
         1. Agitar minuciosamente para re-suspender cada uma das seguintes soluções: A solução de ligação, oligo (dT) de grânulos de poliestireno, e a solução de lavagem 2x. Certifique-se de que o oligo (dT) grânulos quentes à temperatura ambiente antes do uso.
         2. Transferir 120 uL da solução de eluição por preparação para um tubo de calor e a 70 ° C num bloco de aquecimento.
         3. Pipeta-se 500 ^ g de ARN total para um tubo de microcentrífuga. Com água livre de nuclease, ajustar o volume para 250 mL.
         4. Adicionar 250 uL de solução de ligação 2x para o ARN total assimlução e agitar com vortex brevemente para misturar o conteúdo.
         5. Adicionar 15 ul de oligo (dT) e grânulos de vórtice para misturar completamente.
         6. Incubar a mistura a 70 ° C durante 3 min.
         7. Retirar a amostra do bloco de aquecimento e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 10 min.
         8. Centrifugar a 15000 xg durante 2 min.
         9. Remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás cerca de 50 mL.
         10. Adicionar 500 uL de solução de lavagem para re-suspender o sedimento por pipetagem.
         11. Pipetar a suspensão em um conjunto tubo de filtro de spin / coleção.
         12. Centrifugar a 15000 xg durante 2 min. Retirar a coluna do tubo de recolha e o descarte de fluxo. Retornar a coluna para o tubo de recolha.
         13. Pipetar 500 L de solução de lavagem para o filtro de rotação.
         14. Centrifugar a 15.000 x g durante 2 min.
         15. Transferência do filtro de rotação para um tubo de recolha de fresco.
         16. Pipetar 50 ul de solução de eluição aquecidaa 70 ° C para o centro do filtro de rotação.
         17. Incubar durante 2-5 min a 70 ° C. Centrifugar a 15000 xg durante 1 min.
         18. Pipetar um adicional de 50 ul de solução de eluição aquecida a 70 ° C para o centro do filtro de rotação.
         19. Repita o passo 1.2.2.1.18.
      2. Adicionam-se 100 ug / mL de glicogénio, 0,1 volume de tampão de acetato de sódio 3 M (pH 5,2), e 2,5 volumes de etanol absoluto. Precipitar durante a noite a -80 ° C.
      3. Centrifuga-se a 15000 xg durante 25 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante.
      4. Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 75%. Centrifuga-se a 15000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retire cuidadosamente o etanol.
      5. Seco ao ar durante 3-5 min.
      6. Adicionar 10 ul de água isenta de nuclease para dissolver o sedimento.
      7. Armazenar a -70 ° C.
3. RNA qualificação e quantificação
   1. Usando um espectrofotómetro para determinar a concentração de ARN por NotIng a absorvância a 260 nm e 280 nm. A relação _A260 / _A280 deve ser 1,8-2,2.
   2. Verifique a qualidade da amostra de RNA usando 0,8% eletroforese em gel de agarose ^25.
      NOTA: O RNA total eucariótica intacta deve mostrar intensas bandas de 28S e 18S rRNA. A proporção de 28S contra 18S rRNA intensidade da banda para uma boa preparação de RNA é ~ 2.

2. eletroforese em gel e Transferência

NOTA: Os protocolos de preparação tampão são dadas na Tabela 1.

1. Formaldeído Preparação de gel (1%)
   1. Lavar todo o equipamento de eletroforese com dietilpirocarbonato (DEPC) de água.
   2. Melt 2,5 g de agarose em 215 ml de água com DEPC completamente num forno de microondas.
   3. Adicionar 12,5 ml de 10x 3- (N- morfolino) propanossulfónico (MOPS) Tampão e 22,5 ml de formaldeído a 37%.
   4. Deite-o no aparelho de electroforese com um pente de espessura de 1,5 mm.
   5. Eliminar as bolhas ou empurrar tbainha para as bordas do gel com um pente limpo.
   6. Deixar o gel solidificar à temperatura ambiente.
2. Preparação de amostra
   1. Misture 1-10 ug de ARN total, e 11,3 ul de tampão de amostra.
   2. Misturar 2 ug do marcador de ARN (1 mg / mL) com 11,3 mL de tampão de amostra.
   3. Adicionar água isenta de nuclease para as amostras a partir de 2.2.1 e 2.2.2 para um volume total de 16 uL.
   4. Aquecer a 60 ° C durante 5 min, e em seguida esfriar em gelo.
   5. Misturar 16 ul da amostra a partir de 2.2.3 com 4 ul de corante de acompanhamento, que contém 0,1 mg / mL de brometo de etidio em gelo.
      CUIDADO: O brometo de etídio é, possivelmente, teratogênico e tóxico se inalado. Leia brometo de etídio segurança folha de dados.
3. eletroforese
   1. Adicione 200 ml de 10x tampão MOPS a 1.800 mL de DDH ₂ O para fazer um tampão de corrida 1x MOPS.
   2. Utilize tampão de corrida 1x MOPS para lavar os poços do gel.
   3. Pré-run tele gel a 20 V durante 5 minutos.
   4. Coloque as amostras de ARN para os poços do gel.
   5. Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz. Execute a 35 V durante cerca de 17 h (durante a noite)
   6. Examinar e fotografar o gel sob uma luz UV.
4. Transferir
   1. Cortar o gel para remover a porção não utilizada.
   2. Preparar 500 ml de 10x tampão SSC (250 ml de 20x tampão SSC e 250 mL de água com DEPC).
   3. Lavar o gel duas vezes com 10x tampão SSC durante 20 min com agitação a 50 rpm.
   4. Cortar uma folha de papel de filtro suficientemente grande para servir como um pavio de papel, que absorve tampão de transferência do tabuleiro de transferência (figura 1).
   5. Corte 4 pedaços de papel de filtro para o mesmo tamanho que o gel.
   6. Cortar uma folha de membrana de nylon carregada positivamente para o mesmo tamanho que o gel.
   7. Marcar um entalhe sobre o gel e a membrana, como um marcador para assegurar a orientação correcta.
   8. Embeber a membrana em tampão SSC 2x durante 15 min.
   9. Despeje 500 ml of 10x SSC tampão na bandeja de transferência.
   10. Coloque a folha de papel de filtro grande do outro lado da placa de vidro e molhar o papel de filtro com tampão de transferência.
   11. Rolar para fora todas as bolhas com uma pipeta.
   12. Soak 2 peças de papel de filtro pré-corte em tampão de transferência e coloca-os no centro do papel de filtro a partir do passo 2.4.5. Remover quaisquer bolhas.
   13. Lay topo do lado do gel para baixo no papel de filtro.
   14. Colocar a membrana no topo do gel. Alinhar os entalhes do gel e da membrana.
   15. Coloque 2 peças de papel de filtro pré-corte na parte superior da membrana e molha o filtro de papel com tampão de transferência.
   16. Remover quaisquer bolhas entre as camadas.
   17. Aplicar película de plástico em torno do gel para garantir que as toalhas apenas absorver tampão que passa através do gel e da membrana.
   18. Empilhar as toalhas de papel no topo do papel de filtro.
   19. Coloque uma placa de vidro de grandes dimensões em cima das toalhas.
   20. Coloque um peso no topo da pilha.
   21. Manter durante a noite para permitir que o ARN de transferência do gel para a membrana.

3. Detecção de N ⁶ -methyladenosine

1. membrana de reticulação
   1. Mantenha a membrana úmida em tampão 2x SSC.
   2. Coloque 2 folhas de papel de filtro imerso com 10x tampão SSC em reticulador de UV.
   3. Colocar a membrana no topo do papel de filtro, com o lado da ARN-adsorvido voltado para cima.
   4. Selecione "Modo autocrosslink" (120.000 μJ) e pressione o botão "Iniciar" para iniciar a irradiação.
   5. Examinar a membrana e o gel com uma imagem do gel de UV coletor para confirmar a transferência de ARN do gel para a membrana.
2. immunoblotting
   1. Bloquear a membrana em leite sem gordura a 5% em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST) de tampão à temperatura ambiente durante 1 h.
   2. Lavar três vezes com tampão de TBST, durante 15 min.
   3. Incubar a membrana durante a noite em ⁶ m A ( solução de N ⁶ -methyladenosine) anticorpo (1: não gordo leite tampão TBST 1000 em 5%) a 4 ° C.
   4. Lava-se a membrana três vezes com tampão de TBST, durante 15 min.
   5. Incubar a membrana na solução de burro conjugado com HRP anti-anticorpo de coelho (1: 2000 em tampão TBST leite 5% sem gordura) durante 1 h à temperatura ambiente.
   6. Lava-se a membrana três vezes com tampão de TBST, durante 15 min.
   7. Aplicar o substrato quimioluminescente melhorado (0,125 ml por ^cm2 de membrana).
   8. Capture a quimiluminescência com as definições ideais de o gerador de imagens digitais, de acordo com as instruções do fabricante ^26.
3. m ⁶ A Quantificação
   1. Medir a ⁶ m Uma intensidade quimioluminescente relativa utilizando o software ImageJ.
      1. Sob o menu do software ImageJ, selecione a opção "File" para abrir o arquivo pertinente.
      2. Selecione a ferramenta "Retângulo" de ImageJ e desenhar uma moldura em voltaos sinais.
      3. Se RNA ribossomal não é o foco dos experimentos, evitar os 18S e 28S RNA ribossomal m ⁶ a bandas para o cálculo.
      4. Clique "Comando" e "1" para confirmar a pista seleccionada.
      5. Pressione "Command" e "3" para mostrar o enredo selecionado.
      6. Clique no botão "Straight" ferramenta e desenhe linhas para separar a área segmentada.
      7. Clique na ferramenta "Wand" para gravar as medições.
      8. Exportar os dados.
      9. Normalizar os níveis de M ⁶ um com o ARN ribossómico 18S banda da coloração com brometo de etídio.

Resultados

Após 14 dias em fase circadiana luz-escuro normais, os ratinhos do tipo selvagem foram colocadas em escuridão constante. Os ARN de fígado foram amostrados a intervalos de 4 horas e estudaram com Northern blotting modificado. A metilação de ARNr, ARNm, e pequenos RNAs foram claramente detectadas (Figura 2). A comparação entre os diferentes tempos circadianos (CT) pode ser calculado com precisão com o padrão de rRNA 18S. Houve oscilação circadiana robusto de m ⁶ levels em rRNA, mRNA, e pequenos RNAs.

Para evitar a interferência oferecida por ARNr, RNAs poliadenilados pode ser purificado, tal como no passo 1.2.2. Após purificação, o rRNA pode ser largamente eliminada para permitir uma melhor visualização de outros ARN (Figura 3).

g> Figura 1: Montagem da unidade de transferência blot. A unidade de transferência capilar para blotting do ARN para a membrana é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ritmo circadiano dos m ⁶ levels em camundongos C57BL / 6J. Esta figura mostra a M ⁶ Um blot de ARN total a partir de fígados de ratinhos de tipo selvagem sacrificados no primeiro dia da fase de escuro-escuro após 14 dias de uma fase de luz-escuro normal em intervalos de 4 h. A quantificação foi feita usando o m ⁶ A diferença de densidade de imagem entre 18S e 28S rRNA. O M ⁶ Uma abundância foi normalizada para a banda de ARNr 18S a partir do gel de formaldeído na parte inferior.et = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Os m ⁶ borrões com ou sem rRNA. M representativas ^6-blots de ARN total e ARN poliadenilado a partir de fígados de ratinhos do tipo selvagem são mostradas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Os tampões e soluções.

1	tampão 10x MOPS (pH 7,0, proteger da luz)
	MOPS			41.85	g	0,2 M
	O acetato de sódio			4.1	g	0,05 M
	EDTA, sal dissódico			3.7	g	0,01 M
	água DEPC
	Total			1	eu
	Agita-se à temperatura ambiente
2	tampão SSC 20x (pH 7,0)
	O cloreto de sódio			175,3	g	3 M
	citrato trissódico			88,3	g	0,3 M
	água DEPC
	Total			1	eu
	Agita-se à temperatura ambiente, em seguida, autoclave
3	Acompanhando Dye
	tampão 10x MOPS			500	ul	1x
	Ficoll 400			0,75	g	15%
	azul de bromofenol			0,01	g	0,2%
	xileno cianol			0,01	g	0,2%
	água DEPC
	Total			5	mL
	Armazenar a -20 ° C
4	água DEPC
	Diluir proporção de 1: 1000 de DEPC em ddH2O
	Agita-se durante a noite à temperatura ambiente, em seguida, autoclave
5	tampão de amostra (proteger da luz)
	tampão 10x MOPS			200	ul
	37% de formaldeído			270	ul
	formamida			660	ul
	Armazenar a -20 ° C

Discussão

As modificações do RNA têm papéis importantes na função e fisiologia celular. A compreensão atual da regulação, função e homeostase dessas modificações ainda está sendo explorada e expandida⁸. Portanto, é necessário um método preciso e padrão-ouro para avaliar as modificações do RNA. O método de northern blotting modificado fornece quantificação precisa das modificações de RNA e delineamento claro das modificações em diversos RNAs. Embora o método exija pelo menos 3 dias, ele pode ser padronizado e pode ser usado em vários projetos experimentais. Além disso, com diferentes anticorpos, pode detectar diferentes modificações de RNA²⁷.

É importante separar diferentes RNAs ao analisar as modificações do RNA. O RNA ribossômico compreende uma grande parte da quantidade total de RNA^28,29. Os resultados da análise das modificações do RNA apenas no RNA total representarão principalmente as alterações do rRNA. A metilação e outras modificações do rRNA podem potencialmente mascarar as mudanças em outros RNAs. Com o procedimento de separação em gel, as modificações de mRNA e outros pequenos RNAs podem ser analisadas com mais precisão.

O mapeamento de todo o transcriptoma com imunoprecipitação e sequenciamento m⁶A fornece informações detalhadas sobre a modificação de cada tipo de RNA²². Ele fornece informações sobre os RNAs específicos e uma resolução de cerca de 80-120 pb. Embora m⁶A-Seq possa comparar as modificações entre diferentes condições experimentais, a seleção de padrões e controles adequados para tais experimentos é difícil¹⁸. A imunoprecipitação é difícil de reproduzir, muitas vezes dando variações significativas entre as repetições. Além disso, m⁶A-Seq requer a fragmentação de amostras de RNA antes da imunoprecipitação e sequenciamento³⁰. O processo de fragmentação poderia potencialmente induzir influências indevidas nas modificações originais do RNA. Se o experimento não precisar de informações do gene específico, mas exigir condições diferentes para comparação, o método atual fornece melhor visualização e controle para diversas configurações experimentais.

A modificação do RNA é um passo importante na regulação do controle transcricional³¹. No entanto, a homeostase e os mecanismos regulatórios de várias modificações de RNA sob diversos domínios fisiológicos ainda não estão claros. Usando o presente método modificado de northern blotting, diferentes modificações de RNA podem ser quantificadas e comparadas. Além disso, as mudanças e regulações das modificações de RNA podem ser investigadas com mais detalhes. No futuro, também pode ser possível combinar os dados experimentais dos protocolos clássicos de northern blotting e northern blotting modificados, fornecendo maiores insights sobre a biologia do RNA.

O fator mais importante que determina o sucesso do protocolo de northern blotting modificado é a integridade da amostra de RNA. RNAs com alguma quantidade de degradação podem produzir bons resultados clássicos de northern blotting, mas isso pode ter um impacto significativo nos resultados modificados de northern blotting. As modificações do RNA em diferentes tecidos ou linhagens celulares também podem variar significativamente. É importante testar as cargas de amostra de RNA adequadas para diferentes tecidos antes de realizar os experimentos finais.

Como os procedimentos de blotting têm sido tradicionalmente nomeados em homenagem ao Dr. Southern e diferentes direções geográficas, propomos o nome blotting "nordestino" para a técnica atual.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução RNaseZap	Ambion	AM9782	Protocolo 1.1
Solução de reagente TRI	Ambion	AM9738	Protocolo 1.2.1.1
1-Bromo-3-cloropropano (BCP)	Sigma	B9673	Protocolo 1.2.1.3
Etanol	JTbaker	8006	Protocolo 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protocolo 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocolo 1.2.2.1
Glicogênio	Ambion	AM9510	Protocolo 1.2.2.2
Acetato de sódio	Fluka	71183	Protocolo 1.2.2.2
Água livre de nuclease	Ambion	AM9930	Protocolo 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocolo 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protocolo 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocolo 2.1.3
Solução de formaldeído a 37%	Sigma	F8775	Protocolo 2.1.3
EDTA, Sal Dissódico	JT Baker	8993	Protocolo 2.1.3 10x MOPS tampão
formamida	Sigma	F7503	Protocolo 2.2.1
RNA Millennium Marker		Ambion AM7150	Protocolo 2.2.2
Brometo de Etídio	Amresco	X328	Protocolo 2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocolo 2.2.5 corante de rastreamento
Azul de bromofenol Sigma		114391	Protocolo 2.2.5 corante de rastreamento
Xileno Cyanol FF	Sigma	X4126	Protocolo 2.2.5 corante de rastreamento
Cloreto de sódio di-hidratado	JT Baker	3624	Protocolo 2.4.2 20x SSC tampão
Citrato trissódico	Sigma	S1804	Protocolo 2.4.2 20x SSC tampão Hybond
Papel mata-borrão	GE Healthcare	RPN6101M	Protocolo 2.4.4
GE Hybond-N+ membrana	GE Healthcare RPN303B		Protocolo 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Protocolo 400075 Stratagene		3.1.2
Coletor de gel 1500	Tecnologia ANT	Gel Catcher 1500	Protocolo 3.1.5
Anti-m6A (N6-metiladenosina)	Sistemas sinápticos	202003	Protocolo 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd inteiro Ab	GE Healthcare	NA934	Protocolo 3.2.5
Sistema ChemiDoc MP	BIO-RAD	1708280	3.2.8