Os protocolos descritos aqui facilitam a investigação conveniente das respostas bacterianas do etileno utilizando ácido 2-cloroetilfosfônico (CEPA). O etileno é produzido in situ através da decomposição do CEPA em um meio de crescimento bacteriano aquoso, contornando a necessidade de gás etileno puro.
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Artigo de método
Utilizando o composto libertador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico, como uma ferramenta para estudar a resposta do etileno em bactérias
Neste artigo
Resumo
Resumo
O etileno (C2H4) é um fitohormônio gasoso que está envolvido em vários aspectos do desenvolvimento da planta, desempenhando um papel dominante na senescência e no amadurecimento dos frutos. O etileno exógeno aplicado durante o desenvolvimento inicial da planta desencadeia o fenótipo de resposta tripla; um hipocótilo mais curto e mais espesso com um gancho apical exagerado. Apesar da relação íntima entre plantas e bactérias, o efeito do etileno exógeno nas bactérias tem sido muito negligenciado. Isso se deve em parte à dificuldade de controlar o etileno gasoso dentro do laboratório sem equipamentos especializados. O ácido 2-cloroetilfosfônico (CEPA) é um composto que se decompõe em etileno, cloro e fosfato em uma proporção molar de 1:1:1:1 quando dissolvido em meio aquoso de pH 3,5 ou superior. Aqui descrevemos o uso de CEPA para produzir etileno in situ para a investigação da resposta do etileno em bactérias usando a bactéria produtora de celulose associada a frutos Komagataeibacter xylinus como organismo modelo. Os protocolos aqui descritos incluem tanto a verificação da produção de etileno a partir do CEPA por meio do ensaio de resposta tripla de Arabidopsis thaliana quanto os efeitos do etileno exógeno na produção de celulose de K. xylinus, propriedades da película e morfologia colonial. Esses protocolos podem ser adaptados para examinar o efeito do etileno em outros micróbios usando meios de crescimento apropriados e análises de fenótipo. O uso do CEPA fornece aos pesquisadores uma alternativa simples e eficiente ao gás etileno puro para a determinação rotineira da resposta bacteriana ao etileno.
Introdução
O etileno olefina (C 2 H 4) foi descoberto pela primeira vez como uma hormona vegetal, em 1901, quando foi observado que as mudas de ervilha, cultivadas em laboratório que utilizadas lâmpadas de gás de carvão, exibiu uma morfologia anormal em que hastes (hipocótilos) eram mais curtos, mais espessa e inclinou-se para os lados em relação às plantas de ervilha normais; um fenótipo mais tarde denominado a 1,2 resposta tripla. Estudos posteriores demonstraram que o etileno é um hormônio vegetal vital que regula vários processos de desenvolvimento como o crescimento, a resposta ao estresse, o amadurecimento dos frutos e senescência 3.<....
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Protocolo
1. Produtos químicos
- Prepara-se uma solução de CEPA mM 500 (144,49 g / mol), e uma solução que consiste em ambos NaCl 500 mM (58,44 g / mol) e 500 mM de NaH 2 PO 4? H 2 O (137,99 g / mol) em acidificada (pH 2.5) de água ultra-pura ou HCl 0,1 N. Misture usando um vortex até que as soluções são claras.
- Seriadamente diluído (10x) as soluções 500 mM no mesmo solvente para se obter a 5 mM e 50 mM de stocks.
- Prepara-se uma solução de 10 mM de 1-aminociclopropano-carboxílico (ACC; 101,1 g / mol) em água ultra-pura.
- Filtro-esterilizar soluções de reserva e alíquotas armazenar a -20 ° C.
- Filtr....
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Resultados
Uma configuração de placa esquemática para verificação da libertação de etileno CEPA em meio SH (pH 7) pelo ensaio de resposta tripla é mostrado na Figura 1A - C. Um fluxograma que ilustra o protocolo da película é mostrada na Figura 2. escuro cultivadas A. thaliana mudas exibem o fenótipo resposta tripla (mais curto e mais espessa do hipocótilo com um gancho apical exagerado) na presença da ACC e na presença de etileno produzid.......
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Discussão
Os métodos aqui descritos descrevem a produção in situ de etileno a partir de CEPA para o estudo da resposta ao etileno bacteriana usando o organismo modelo, K. xylinus. Este método é muito útil como o etileno pode ser produzido, completando qualquer meio aquoso que tem um pH maior do que 3,5 com 10,11 CEPA eliminando a necessidade de gás de etileno puro ou equipamentos de laboratório especializado. Este método não se limita ao estudo dos efeitos do etileno derivado de CEPA em bactérias, mas.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Dario Bonetta por fornecer sementes de Arabidopsis thaliana e pela assistência técnica em relação ao ensaio de resposta tripla, bem como a Simone Quaranta pela ajuda com FT-IR. Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Descoberta do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC-DG) para JLS, uma Bolsa de Pós-Graduação de Ontário (OGS) para RVA e uma Bolsa de Pós-Graduação Rainha Elizabeth II em Ciência e Tecnologia (QEII-GSST) para AJV.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido carboxílico 1-aminociclopropano (ACC) | Sigma | A3903 | Precursor biossintético do etileno em plantas |
| Placa de Petri de 4 setores | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | Para testar resposta tripla |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | Para solidificar o meio |
| Câmera Canon Rebel T1i DLSR | Canon | 3818B004 | Para fotos de películas |
| Celulase de Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Solução aquosa |
| Ácido cítrico | BioShop | CIT002.500 | Para SH médio |
| Alvejante comercial | Life | Brand 57800861874 | Alvejante para esterilização de sementes |
| HCl concentrado | BioShop | HCL666.500 | Ácido clorídrico para ajuste de pH |
| Microscópio digital USB | Plugável | N/A | Para fotos de colônias |
| Ethephon (≥ 96%; Ácido 2-cloroetilfosfônico) | Sigma | C0143 | Composto liberador de etileno |
| Glicose | BioBasic | GB0219 | Para meio SH |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | alfaproteobactéria produtora de celulose bacteriana |
| LifeGene | LMCT1.7B | Tubo de microcentrífuga de 1,7 ml | |
| Murashige e Skoog (MS) basal médio | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana meio de crescimento |
| Na2HPO4· 7H2O | BioShop | SPD579.500 | Fosfato de sódio, heptahidratado dibásico para meio SH |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Cloreto de sódio para solução salina e controle |
| NaH2PO4· H2O | BioShop | SPM306.500 | Fosfato de sódio, monobásico monohidratado para solução de controle |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Hidróxido de sódio para ajuste de pH |
| Filme de | parafina Parafilme | PM996 | Para placas e frascos de vedação |
| Peptona (bacteriológica) | BioShop | PEP403.1 | Para meio SH |
| Câmara de contagem Petroff-Hausser | Hausser câmara de | contagem de células bacterianas | 3900 |
| Filtro de esterilização de polietersulfona 0.2 µ m | VWR | 28145-501 | Para esterilização de celulase |
| Sacarose | BioShop | SUC600.1 | Sacarose para meio MS |
| Extrato de levedura | BioBasic | G0961 | Para meio SH |
Referências
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul....
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Reimpressões e permissões
