Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

Summary

Este artigo descreve um protocolo simples e rápido para avaliar o estado oligomérico da proteína GTPase MxA semelhante à dinamina de lisados de células humanas usando uma combinação de PAGE não desnaturante com análise de western blot.

Abstract

A formação de complexos oligoméricos é um pré-requisito crucial para a estrutura e função adequadas de muitas proteínas. A proteína efetora antiviral induzida por interferon MxA exerce uma ampla atividade antiviral contra muitos vírus. MxA é uma GTPase semelhante à dinamina e tem a capacidade de formar estruturas oligoméricas de ordem superior. No entanto, se a oligomerização de MxA é necessária para sua atividade antiviral é uma questão de debate. Descrevemos aqui um protocolo simples para avaliar o estado oligomérico de MxA expressa endogena ou ectopicamente na fração citoplasmática de linhagens celulares humanas por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante (PAGE) em combinação com análise de Western blot. Uma etapa crítica do protocolo é a escolha de detergentes para evitar a agregação e/ou precipitação de proteínas particularmente associadas a membranas celulares como MxA, sem interferir em sua atividade enzimática. Outro aspecto crucial do protocolo é a proteção irreversível dos grupos tióis livres de resíduos de cisteína pela iodoacetamida para evitar interações artificiais da proteína. Este protocolo é adequado para uma avaliação simples do estado oligomérico de MxA e, além disso, permite uma correlação direta da atividade antiviral dos mutantes da interface MxA com seus respectivos estados oligoméricos.

Introduction

A estrutura quaternária de uma proteína desempenha um papel crucial em muitos processos celulares. Vias de sinalização, a expressão do gene e enzima de activação / desactivação todos contam com a montagem adequada de complexos de proteínas ^1-4. Este processo também conhecido como homo- ou hetero-oligomerização é devido à covalente irreversível ou interacções proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversíveis. A oligomerização não só diversifica os diferentes processos celulares sem aumentar o tamanho do genoma, mas também fornece uma estratégia para construir proteínas de complexos estáveis que são mais resistentes à desnaturação e degradação no ....

Protocol

NOTA: Este protocolo é baseado no não desnaturante protocolo de PAGE publicado anteriormente ^12. Neste estudo, o estado oligomérico da proteína MxA foi avaliada utilizando quer de células Vero ou de células que sobre-expressam MxA A549 IFN-ct-estimuladas expressam MxA endógena. O protocolo abaixo descrito pode ser utilizado para analisar o estado oligomérico da proteína em qualquer além MxA. No entanto, uma maior optimização pode ser necessária.

1. Preparação de lisado celular para PAGE não desnaturante

NOTA: Para analisar o estado oligomérico da proteína MxA humana tanto em células Vero ou A549, 1,0 ....

Results

Usando não-PAGE desnaturante, analisou-se o estado oligomérico do tipo selvagem humana MxA, os mutantes diméricas de interface MxA (R640A) e MxA (L617D), bem como o mutante de interface monomérica MxA (M527D) a partir de lisados celulares ^12. As células foram lisadas num tampão contendo 1% de octilfenoxipolietoxietanol (NP-40) e iodoacetamida para assegurar a solubilização da proteína e a protecção dos grupos tiol livres (ver Figura 1). Conforme descrito antes, sal e pequenos metabólitos fora.......

Discussion

Descrevemos aqui um método simples que permite a determinação rápida do estado oligomérico de proteínas expressas em células de mamíferos por PAGE não desnaturante seguido por análise Western Blot. A principal vantagem desta abordagem é que o estado oligomérico de uma dada proteína pode ser determinada a partir de lisados ​​de células inteiras sem purificação de proteína antes. Isto pode ser importante para proteínas que oligomerizar ou exercem a sua função em associação com factores auxiliares. Além disso, as proteínas.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unidades de Diálise Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Pré-equilíbrio em tampão de diálise (se a remoção de Glicerol for desejada) Pode ser feito por conta própria de acordo com Fiala et al. 2011
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados, 10 poços,	Bio-Rad	456-1083	Pré-corrida em buffer de corrida para ajustar o sistema de buffer
cOmplete, Mini, livre de EDTA	Roche	11836170001	use 1 comprimido por 50 ml
de PBS, pH 7.4  garrafa de 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Solução Ponceau S	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC use luvas e proteja os olhos
Padrão de Proteína Não Manchada NativeMark  50 µ l	Invitrogen	P/N 57030	carga 5 µ células
A549	ATCC	ATCC CCL185	Crescem em meio de crescimento (ver Tabela 1)
Células Vero	ATCC	ATCC CCL81	Crescem em meio de crescimento (ver anticorpo anti-Mx1 Tabela 1)
anti-Mx1	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Use em uma diluição de 1:1.000
ECL Anti-rabbit IgG, anticorpo inteiro ligado à peroxidase de rábano (de burro)	GE-Healthcare	NA934V	Use a uma diluição de 1:10.000
0,5% Tripsina-EDTA (1x)              Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacetamida    5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	estoque  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Estreptococos 100 x        100ml                            life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml        life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Soro Fetal Bovino, Dialisado, Origem US 500 ml Lote Gibco:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Papel de filtro de celulose	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  membrana	GE-Healthcare	10600022
Tris(hidroximetil)aminometano	Biosolve	0020092391BS
fluoreto de sódio (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS solução a 10%	Amresco	N907
DL-Ditiotreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
ortovanadato de sódio (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glicerol	Sigma Aldrich	G7757
β-Glicerophospate	Sigma Aldrich	G9422
Leite em pó	Migros/Suíça
Metanol	Millipore	1.06009
cloreto de sódio (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
cloreto de magnésio (MgCl2)	Amresco	288
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
hidróxido de sódio (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045