Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

Summary

Protocolos para investigar a dinâmica dos estromos do cloroplasto, os túbulos cheios de estroma que se estendem da superfície dos cloroplastos, são descritos.

Abstract

Stromules, ou "túbulos cheios de estroma", são extensões tubulares estreitas da superfície do cloroplasto que são universalmente observadas em células vegetais, mas cujas funções permanecem misteriosas. Juntamente com a crescente atenção sobre o papel dos cloroplastos na coordenação das respostas das plantas ao estresse, o interesse em estromos e sua relação com a dinâmica de sinalização do cloroplasto aumentou nos últimos anos, auxiliado por avanços na microscopia de fluorescência e fluoróforos de proteínas que permitem uma visualização rápida e precisa da dinâmica do estroma. Aqui, fornecemos protocolos detalhados para testar a frequência do estroma nos cloroplastos epidérmicos de Nicotiana benthamiana, um excelente sistema modelo para investigar a biologia do estroma do cloroplasto. Também fornecemos métodos para visualizar estromos de cloroplastos in vitro extraindo cloroplastos das folhas. Finalmente, delineamos estratégias de amostragem e abordagens estatísticas para analisar as diferenças nas frequências de estromulos em resposta a estímulos, como estresse ambiental, tratamentos químicos ou silenciamento de genes. Os pesquisadores podem usar esses protocolos como ponto de partida para desenvolver novos métodos para experimentos inovadores para explorar como e por que os cloroplastos produzem estromulas.

Introduction

Os cloroplastos são organelas dinâmicas nas células vegetais responsáveis pela fotossíntese e uma série de outros processos metabólicos. As vias de sinalização do cloroplasto também exercem influência significativa na fisiologia e no desenvolvimento das plantas, coordenando as respostas das plantas ao estresse ambiental, patógenos e até mesmo ao formato^{das folhas 1-6}. Recentemente, os biólogos ganharam interesse em um aspecto pouco compreendido da estrutura do cloroplasto: estromos, túbulos muito finos cheios de estroma que se estendem da superfície do cloroplasto⁷.

As funções biológicas dos estromos permanecem desconh....

Protocol

NOTA: Para este protocolo, temos nos concentrado em ensaio frequência stromule na epiderme de N. deixa benthamiana. Várias linhas transgénicas estáveis foram gerados que pode ser utilizado para este fim, incluindo a 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ e NRIP1 Cerulean: ^6. Ambas estas linhas mostram a expressão robusta de fluoróforos no estroma do cloroplasto de folhas cultivadas sob uma ampla gama de condições. Alternativamente, fluoróforos segmentados por cloroplastos pode ser transitoriamente expresso em N. benthamiana usando Agrobacterium Transformações ^13. Isto é menos do que id....

Results

Este protocolo foi usado para visualizar a frequência stromule de dia e à noite nos cotilédones de jovens N. mudas benthamiana. Fatias de uma pilha z foram fundidas em uma única imagem (Figura 1A). Para efeitos visuais, que a imagem foi então Saturado e invertido de modo que o estroma aparece negro (Figura 1B). Os cloroplastos foram marcados quer como não tendo stromules asterisco (verde) ou com pelo menos um stromule (asterisc.......

Discussion

Ao investigar stromules, três fatores importantes devem ser considerados ao longo de: (i) a manipulação do tecido da planta devem ser mantidos a um mínimo absoluto, (ii) o sistema experimental deve ser mantido consistente, e (iii) estratégias de amostragem devem ser cuidadosamente planejado para assegurar robusto, os dados podem ser reproduzidos são analisados.

Stromules são notavelmente dinâmica: eles podem se estender e retrair rapidamente diante dos olhos de um observador sob o microscópi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Microscópio Confocal de Varredura a Laser	Carl Zeiss Inc	Modelo: LSM710
Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimetilsulfóxido (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring liquidificador	Waring	Modelo: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Software de código aberto para análise de imagens biológicas