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Artigo de método

Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,

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⸱

DOI:

10.3791/54695

⸱

26 de novembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Science and Mathematics, Volda University College, 2Department of Biology, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, Macquarie University, 4Department of Biology, University of Konstanz, 5Research Center on Animal Cognition, CNRS, Universite de Toulouse

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve vários protocolos para a administração de agentes farmacológicos para as abelhas, incluindo métodos não invasivos simples para abelhas de vôo livre, bem como variantes mais invasivos que permitem que o tratamento localizado precisa de abelhas dispositivos de retenção.

Resumo

As abelhas do mel demonstrar capacidades de aprendizagem surpreendentes e comportamento social avançada e comunicação. Além disso, o seu cérebro é pequeno, fácil de visualizar e estudar. Portanto, as abelhas têm sido um modelo preferido entre os neurobiólogos e neuroethologists para estudar as bases neurais do comportamento social e natural. É importante, no entanto, que as técnicas experimentais usadas para estudar abelhas não interferir com o comportamento a ser estudada. Devido a isto, tem sido necessário o desenvolvimento de uma variedade de técnicas para a manipulação farmacológica de abelhas de mel. Neste artigo é demonstrar os métodos para o tratamento de abelhas produtoras de mel contido ou livre de voar com uma vasta gama de agentes farmacológicos. Estes incluem ambos os métodos não invasivos, tais como tratamentos orais e tópicos, assim como métodos mais invasivos que permitem a entrega da droga precisa em qualquer forma sistémica ou localizada. Finalmente, discutimos as vantagens e desvantagens de cada método e descreverobstáculos comuns e como melhor superá-los. Concluímos com uma discussão sobre a importância de adaptar o método experimental para as questões biológicas, em vez do contrário.

Introdução

Desde Karl von Frisch elucidado sua linguagem de dança 1, as abelhas têm permanecido uma espécie de estudo populares para pesquisadores em comportamento animal e neurobiologia. Nos últimos anos uma miríade de novas disciplinas surgiram na interseção desses dois campos, e várias outras disciplinas (por exemplo, biologia molecular, genômica e ciência da computação) surgiram ao lado deles. Isto levou a um rápido desenvolvimento de novas teorias e modelos para a compreensão de como o comportamento resulta de atividade dentro do sistema nervoso. Por causa do estilo de vida único, rico repertório comportamental, e facilidade de manipulação experimental e farmacológico, as abelhas têm-se mantido na vanguarda dessa revolução.

As abelhas do mel estão sendo usados para estudar questões neurobiológicas básicos tais como os de aprendizagem subjacentes e memória 2,3, tomada de decisão 4, olfativas 5 ou 6 processamento visual. Nos últimos anos, o honey abelha sequer foi usado como um modelo para o estudo de temas geralmente reservados para a investigação médica, tais como os efeitos das drogas viciantes 7 - 11, o sono 12, o envelhecimento 13, ou os mecanismos subjacentes a anestesia 14.

Ao contrário dos clássicos organismos modelo genético (por exemplo, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), há muito poucas ferramentas genéticas disponíveis para manipular as funções neurais em abelhas produtoras de mel, embora isso está mudando 15. Em vez disso, estudos de abelhas têm se baseou principalmente em manipulações farmacológicas. Isso tem sido muito bem sucedida; no entanto, a diversidade de pesquisa abelha é tal que uma série de métodos para a administração farmacológica são necessários. A pesquisa com abelhas aborda mais diversas questões, é estudado por pesquisadores de diferentes disciplinas e experiências, e usa uma variedade de abordagens experimentais. muitos reseperguntas arco exigem abelhas para quer ser livre de vôo, interagindo livremente na sua colónia, ou ambos. Isso pode tornar difícil manter o controle de animais experimentais individuais, e faz a restrições ou a punção inviável.

Para acomodar a diversidade de pesquisa da abelha do mel, são necessários uma variedade de métodos de administração de fármacos, permitindo a administração robusto e flexível, assegurando ao mesmo tempo que a perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos, invasividade do método, e a sua fiabilidade, adequar o paradigma em questão. Devido a estas necessidades diversas, a maioria dos grupos de pesquisa têm desenvolvido os seus próprios métodos de administração de medicamentos originais. Até agora, esta tem sido uma força da comunidade de pesquisa de abelhas; que tem levado ao desenvolvimento de matrizes de métodos que permitam a administração do mesmo medicamento em diferentes circunstâncias. Nosso objetivo aqui não é desenvolver um método padronizado único para manipulações farmacológicas de abelhas, mas sim para destacar os métodos queprovaram ser particularmente bem sucedidas, e os investigadores ajuda adoptar estes. Discutimos os princípios básicos de como eles funcionam, bem como suas vantagens e desvantagens.

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Protocolo

1. Drug Administration para as abelhas aproveitou

  1. O tratamento oral
    1. Preparar uma solução 1,5 M de sacarose através da mistura de 257 g de sacarose com 500 ml de água (que é mais fácil de dissolver esta quantidade de sacarose em água a ferver). Armazenamento da solução de sacarose a 4 ° C até à sua utilização.
      NOTA: Solução de sacarose fornece um ambiente muito hospitaleiro para certos microorganismos e, portanto, facilmente torna-se contaminado e intragável para as abelhas. solução de sacarose em massa pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -20 ° C até à sua utilização.
    2. Decidir sobre uma dose droga apropriada (como alcançá-lo, é abordado na seção de discussão abaixo), e preparar uma solução tal que a dose droga preferida é dissolvido em 20 mL da solução de sacarose (por exemplo, para fornecer 20 mg, diluir droga a uma proporção de 1 mg / ml). abelhas arnês de acordo com Felsenberg et al. (2011) 16. Faça este passo, pelo menos, 12 horas antes do tratamento de drogas para garantir que as abelhas não são mais estressado out de aproveitamento quando a solução de fármaco é apresentada.
      NOTA: Para obter resultados mais consistentes, o melhor é matar de fome as abelhas (colocando as abelhas aproveitado em uma incubadora a 34 ° C e 70% de umidade) O / N.
    3. Usando uma micropipeta, toque em uma gota de água de sacarose 1,5 M à antena de uma abelha aproveitada. Quando a tromba é estendido, toque em uma gota de 20 mL de 1,5 M de sacarose contendo a droga diretamente para a tromba da abelha. Certifique-se a abelha consome tudo. Como o controle do veículo usar a solução 1,5 M de sacarose sem drogas adicionado.
      NOTA: A quantidade de solução de sacarose pode ter de ser ajustada com base nos planos experimentais. Se appetitive condicionado destina-se, alimentando as abelhas apenas antes do treino irá interferir com a capacidade de resposta das abelhas.
    4. Descarte ou anular as abelhas que não consomem toda a sacarose.
      NOTA: Se um grande número de abelhas deixar de beber a solução de sacarose, o horário de alimentação pode ter de ser ajustada.
  2. Injecção no tórax
    1. Prepare droga em mel de abelha Ringer 17 da seguinte forma:
      1. Misture e autoclave 7,45 g de NaCl, 0,448 g de KCl, 0,812 g de MgCl 2, 0,735 g de CaCl 2, 54,72 g de sacarose, 4,95 g de D-glucose, e 2,48 g de HEPES em 1.000 ml de água. Tenha cuidado ao armazenar Ringer, pois é facilmente contaminado. Alíquotas e armazenamento de Ringer a -20 ° C até à sua utilização.
      2. Dissolve-se o fármaco em solução de Ringer e depois dilui-se de modo a que a quantidade desejada está presente em 5 ul. Como um exemplo, se as abelhas são para ser tratados com 5 ug de um fármaco, um g pode ser inicialmente dissolvido em 1 ml de Ringer, antes de ser diluída a 1: 1000 em solução de Ringer para um final de 1 ug / uL.
        NOTA: Como alternativa, disponível comercialmente de PBS (fosfato tamponado Salin) pode ser usado em vez de solução de Ringer.
    2. Fazer uma microscalpel por romper o canto de uma lâmina de dois gumes com lâminaum suporte de lâmina. Fixe o fragmento de lâmina para um suporte de lâmina para que ele faz um bom lâmina com um ponto de extremidade afiada.
    3. Sob um microscópio estereoscópico, use cuidadosamente o microscalpel para cortar um buraco 2 milímetros pouco acima do escutelo, ao lado do processo de asa posterior do tórax de uma abelha. Evitar o corte muito profundo, pois isso poderia prejudicar músculos de vôo, e ter cuidado para evitar as dobradiças laterais. Idealmente, só reduzir três lados, de modo que a aba de cutícula pode depois ser dobrada para trás para fechar o local da lesão.
    4. Usando uma micropipeta, depósito 5 ml·l Ringer (ou PBS) que contém o fármaco no topo do orifício no tórax. monitorizar cuidadosamente sob microscópio para assegurar que toda a gota é absorvida pela hemolinfa. Use campainha (ou PBS) como um controlo do veículo.
    5. Se possível, coloque a aba cutícula para trás por cima do buraco. Após 5-10 horas, ele vai recolocar e selar.
      NOTA: Como uma alternativa a esta técnica, injectam-se 1 ul directamente no tórax usando uma seringa de vidro, depois de abrir uma SMALL buraco no meio do freio (linha transversal na região posterior do escutelo) com uma agulha de seringa (diâmetro: 0.6 mm L: 23). Isto evita a necessidade de cortar primeiro o tórax com um bisturi e o local da injecção é menor, mas este método vai deixar o local de injecção exposta.
  3. injeção ocellus
    NOTA: Este é um método adequado para a entrega de moléculas em toda a cápsula cabeça, na hemolinfa.
    1. Prepare drogas como em 1.2.1, mas ajustar as concentrações de fármaco de tal modo que a dose desejada irá ser contida em 1 mL de Ringer ou PBS (menos de volume pode ser absorvida através do orifício ocelo do que através do tórax).
    2. Prepara-se uma microscalpel como em 1.2.2. Sob um microscópio estereoscópico, bloquear a cabeça de uma abelha aproveitado no lugar preenchendo a fenda no pescoço com cera. Use cera de fusão a baixa temperatura (por exemplo, cera, cirurgia dentária) de modo a evitar os receptores olfactivos antenal nocivos ou outras células que podem ser important para avaliar o comportamento (por exemplo, a aprendizagem olfactiva). Em seguida, remover cuidadosamente a lente do ocelo mediana através da inserção da ponta do microscalpel sob a lente e a lente suavemente quebrar livre a partir da cápsula cabeça.
      NOTA: É também possível colocar cera cuidadosamente através da antena para evitar o movimento.
    3. Cuidadosamente pipeta de drogas para o buraco ocellus. Espere até que tudo seja levado para dentro da cápsula cabeça. Remova a cera dental da antenas e permitir que a abelha para descansar um pouco antes de continuar o procedimento experimental. Use campainha (ou PBS) como um controlo do veículo.
  4. Injecção no trato ocelar
    NOTA: O trato ocelar contém fibras grandes, conectando a maioria das regiões do cérebro central 18. Este método de tratamento permite a aplicação de compostos com apenas o cérebro, mas não segmentação sub-regiões específicas do cérebro.
    1. Prepare abelha como em 1.3.2. e remover a lente do ocelo mediana, com o tIP de um microscalpel como em 1.3.3.
      NOTA: Este pode ser feito até 2 horas antes da injecção. Com base em nossa experiência, as abelhas alimentadas são mais capazes de lidar com esta cirurgia que não as abelhas famintos
    2. Encher uma seringa de vidro de 10 mL equipado com um calibre pequeno (por exemplo, 33, diâmetro: 210 mm) da agulha com solução de fármaco preparado como no 1.3.1.
    3. Utilizando um micromanipulador Manual, insira a ponta da seringa através da retina ocelar na cápsula cabeça até uma profundidade de 50 mm e injectar 250 nl de solução.
    4. Após o uso, lavar a seringa de 3 vezes com água destilada, em seguida, 3 vezes com etanol a 75%.
  5. Microinjecção em particular as estruturas cerebrais
    NOTA: Para além dos tratamentos sistemáticos mencionados acima, é possível realizar microinjections em particular as estruturas cerebrais. Isto permite a manipulação farmacológica de uma ou mais regiões do cérebro, deixando outras afectada. Isso funcionamelhor com as regiões do cérebro que são fáceis de reconhecer a partir da superfície do cérebro anterior (por exemplo, lobos antenais, cálices cogumelo corpo ou lóbulos verticais, ou os lobos ópticos), mas outras regiões têm sido alvo. Por favor note que a orientação (anterior / posterior, dorsal / ventral) refere-se ao eixo do corpo, em vez, do que para o neuroeixo 19.
    1. Prepara-se o fármaco em PBS ou da campainha da mesma maneira como em 1.2.1, adicionando um fluorescente (por exemplo, 0,5 mg / ml de dextrano, Alexa Fluor 546 ou 568) ou de um corante não fluorescente (por exemplo, 1 mM de metileno azul).
      NOTA: A adição de um corante fluorescente vai permitir a verificação do local de injecção após o experimento é longo (usando microscopia confocal, após dissecção do cérebro), enquanto que corantes não fluorescentes permitem o monitoramento direto durante o experimento.
    2. Para tornar pipetas de vidro para injeção, insira capilares de vidro do diâmetro correto em grampos titular de um puxador de eletrodo (1,0 mm para o porão padrãoer incluído para o microinjetor mencionado na lista de materiais). Ajustar as configurações de tração e de calor para produzir uma ponta de cerca de 0,5 cm de comprimento (definições serão diferentes para cada extrator, mesmo se o mesmo modelo é utilizado).
      NOTA: Idealmente, as duas pipetas puxado a partir de um vidro devem ter o mesmo comprimento e forma, de modo que tanto pode ser utilizado.
    3. Sob um microscópio estereoscópico, quebrar as pontas para obter um diâmetro exterior de cerca de 10-15 uM, com base na estimativa visual utilizando uma escala de uma retícula inserido na ocular. Os passos na escala são definidas pelo fabricante e podem ser corrigidos para a ampliação usada.
    4. Em seguida, preencha as pipetas de vidro com a solução para injetar. Se são utilizados capilares de vidro com filamentos, encher a pipeta, colocando o lado de trás para dentro da solução de droga, de outro modo preencher ponta utilizando pontas microloader.
    5. Inserir a pipeta de vidro cheio no suporte do capilar de um microinjector, a qual é controlada por um mi manual ou electrónicocromanipulator.
    6. Calibrar o microinjector para injectar o volume desejado (0,5-2 nl, dependendo do tamanho da estrutura do cérebro alvo). Para isso, injectar directamente para uma pequena placa de Petri contendo óleo mineral e medir o diâmetro da gotícula com a retícula. Alterar as configurações até que o volume desejado seja alcançado.
    7. Fixar a cabeça de uma abelha aproveitada usando cera dental macia como em 1.3.2, antes de cortar uma abertura na parte anterior da cápsula cabeça, usando um microscalpel, com três cortes: um pouco abaixo do ocellus mediana (ventral), um de a fronteira da direita ou olho esquerdo e um acima da antena hastes (dorsal). Use um pedaço de cera dental para segurar a aba aberta no lugar.
    8. empurre cuidadosamente glândulas e traqueia deitado em cima do cérebro de lado usando uma pinça fina, em seguida, fazer uma pequena ruptura no Neurilema (membrana muito fina em torno do cérebro) acima da estrutura do cérebro alvo.
      NOTA: Se muitas abelhas estão a ser tratados ao mesmo tempo, este procedimentopode ser realizada mais cedo; no entanto, ter cuidado para não deixar abelhas neste estado por muito tempo (não mais de 30 min), como seus cérebros pode desidratar.
    9. Inserir a ponta na região do cérebro desejado, e ajustar a profundidade perpendicular à superfície do cérebro (por exemplo, 60 uM para cálices corpo de cogumelo). Injectar o volume pré-definido. Para as regiões cerebrais laterais, injetam bilateralmente (ou seja, fazer uma injecção para cada hemisfério). Se um corante não fluorescente é usado, garantir a injeção ocorreu na região direita sobre a observação enquanto está a injectar. Se um corante fluorescente é usado fazer o mesmo sob luz fluorescente usando um estereomicroscópio com um sistema de visualização de fluorescência.
    10. Em seguida, coloque a tampa traseira aberta sobre a cabeça da abelha. Derreter um cristal de eicosano, que é de aproximadamente 1 mm de diâmetro, usando um fio fino enrolado em torno da ponta do ferro de soldar micro (temperatura de fusão é 35-37 ° C) e selar os cortes. Isto irá reduzir significativamente a mortalidade.
    11. Liberte oabelha do arnês para a análise comportamental (mas ver discussão), ou manter o arnês para experimentos com abelhas contido - por exemplo, a extensão probóscide reflex (PER) testando 20.
    12. Se foi utilizado um corante fluorescente, assegurar que a injecção de atingir a área de interesse, após a experiência acabou usando um microscópio de varrimento laser confocal (Figura. 1).
      NOTA: Isto é particularmente útil quando o direcionamento áreas cerebrais mais profundas (onde seria difícil ver corante não fluorescente durante a fase de injecção).

2. Métodos de administração de medicamentos para as abelhas vôo livre

  1. O tratamento oral
    1. Prepare droga, da mesma forma como nos passos 1.1.1-1.1.2. Adicionar solução de um fármaco a um alimentador e coloque na geladeira para o armazenamento.
      Nota: Qualquer alimentador vai fazer, como uma tampa de garrafa de cabeça para baixo ou um frasco invertido sobre papel absorvente.
    2. Treinar abelhas para um alimentador de gravidade contendo 1 M ou 0,5solução de sacarose M, colocando um alimentador perto da colmeia. Uma vez que as abelhas começar forrageamento no alimentador, movê-lo gradualmente mais longe até que ele esteja a uma distância confortável para evitar ser picado (mínimo 5 m).
    3. abelhas tinta de marca, a fim de manter o controle das abelhas individuais. Faça uma lista de todas as combinações de cores que serão utilizados. Quando uma abelha terras no alimentador, marque cuidadosamente seu abdômen com duas cores, e fazer uma nota na lista que a combinação é tomada.
    4. Trocar o alimentador de gravidade para um alimentador que contém a solução de fármaco / sacarose. Tome nota das abelhas marcadas que visitam o alimentador. Pegar qualquer abelha sem marcação visitar o alimentador como as abelhas são recrutadores prolíficos, e os números de abelhas que visitam o alimentador drogado pode rapidamente sair do controle. Isto é especialmente problemático se a mesma experiência é para ser realizado em dias sucessivos, como abelhas simples pode não ser ingénuos.
      NOTA: Como uma alternativa para treinar abelhas individuais para um alimentador, autor anteriors ter alimentado com sucesso água sacarose-atada drogas a todo um ramo de 21-23.
  2. O tratamento tópico
    NOTA: O objectivo é dissolver o composto de interesse no seio de um solvente que pode penetrar a cutícula cerosa inseto. Diferentes solventes podem ser utilizados para este fim. O mais vulgarmente utilizado incluem acetona, dimetilformamida (DMF) e dimetilsulf óxido (DMSO).
    1. Avaliar quais solvente funciona melhor para o composto em questão. Se um fenótipo forte é esperado a partir de uma sobredosagem (por exemplo, paralisia ou morte), abelhas tratar (passo 2.2.2), com uma dose elevada (por exemplo, 20 ug a cocaína 7) Dissolveu-se em cada um dos diferentes solventes e cuidadosamente monitorar o tempo até paralisia ou morte.
    2. Usando um microcapilar 1 uL (ou uma micro-seringa, que pode ser instalado em um dispensador de repetição apropriado) e titular microcapilar, compre 1 ul da solução do fármaco (por exemplo, 381; g / L de cocaína) para o capilar. Expelir a gota, e pintá-lo com cuidado sobre o tórax de uma abelha marcada. Cubra tão grande de uma área de uma possível com a solução, em vez de deixar uma gota sólida, como a abelha é provável, portanto, para noivo-lo. Tenha cuidado para não permitir que o composto em contato com a asa dobradiças, ou isso pode desenhá-lo fora do tórax e ao longo das asas, onde ele irá evaporar, sem ser absorvido na hemolinfa.
      NOTA: Dependendo do objectivo de investigação, este método também pode ser utilizado para administrar drogas para o abdómen da abelha. No entanto, drogas atingir o SNC e mais rápido em maiores quantidades quando aplicado ao tórax método .Este 24 funciona igualmente bem com aproveitada como com as abelhas de vôo livre.
  3. tratamento volatilizado
    1. Dissolve-se a droga (anteriormente este método foi usado para entregar cocaína para abelhas 10) em 100% de etanol. Para garantir a solubilidade, não use um cloridrato ou outras formas de sal dodroga se possível. Ao fazer uma diluição prepará-lo de modo a que a quantidade a ser entregue a um abelha está presente em 100 ul. O uso do etanol puro como um controlo do veículo.
    2. Para criar um filamento, utilizar o mesmo procedimento como McClung e Hirsh 25.
      1. Resumidamente explicou: acabar fio de nicromo firmemente em torno de um prego e anexar a dois fios elétricos (um em cada extremidade do filamento). Remover o prego. A bobina de nicrómio restante é referido como o filamento.
      2. Passe os dois fios através de orifícios perfurados no cuidadosamente a tampa de um tubo de centrífuga de 50 ml, o que deve ser resistente à temperatura escolhida. Cole os fios no lugar com silicone líquido.
        NOTA: Isto fará o hermético tubo. Isto é essencial para evitar a exposição secundária ao experimentador e assegurar que as abelhas são tratados com a dose apropriada.
    3. Anexar os fios que conduzem ao filamento a uma fonte de energia. Usando um termopar para medir a temperatura deo filamento, experiência com diferentes combinações de tensão / corrente até que aquela que resulta em um perfil de temperatura adequado para a droga em questão, de preferência, uma que permite a 10 s de aquecimento ou menos. Isto é muito importante, referem-se a literatura relevante (por exemplo, a fim de cocaína para volatilizar precisa de ser aquecida a pelo menos 200 ° C, mas a temperaturas superiores a 350 ° C, ele é dividido em compostos secundários 26).
    4. Cuidadosamente Pipetar 100 ul de droga que contém uma solução de etanol para o filamento. Espalhe o líquido sobre a superfície do filamento, tanto quanto possível, pois isso irá aumentar a eficiência da evaporação. Deixar o filamento exposto à temperatura ambiente até todo o etanol se ter evaporado.
      NOTA: Se o etanol não é suficientemente evaporada, abelhas vai ser tratada tanto com a droga de escolha e etanol. As abelhas são extremamente sensíveis ao etanol, e alguns fármacos têm interacções sinérgicas com etanol, o que vai viés exresultados rimentais.
    5. Uma vez que o etanol foi completamente evaporado (geralmente precipitado droga pode ser visto sobre o filamento seco sob um microscópio), apanhar um abelha de vôo livre em um tubo de 50 ml. Cuidadosamente fechar a tampa contendo o filamento.
    6. Ligue a alimentação durante 10 segundos, desligar o gravador, e esperar mais 50 segundos (para permitir que o composto volatilizado para esfriar e, assim, condensar ou depósito). Solte a abelha.
      NOTA: Embora este método de tratamento funciona de forma excelente para as abelhas de vôo livre, ele pode ser usado apenas como eficazmente com as abelhas aproveitado. Basta conectar a abelha aproveitada dentro de um tubo de 50 ml. Recarregar o filamento tal como descrito no 2.3.4 entre abelhas. Para um maior rendimento, vários filamentos podem ser usados ​​em paralelo.

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Resultados

Uma selecção de resultados representativos para os métodos acima descritos são representados, principalmente para demonstrar que os métodos de permitir que os agentes farmacológicos para chegar ao cérebro e afectar o comportamento das abelhas de mel.

efeitos específicos sobre processos cerebrais podem ser facilmente obtidos após a injecção tórax.

Como os agentes farmac...

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Discussão

Os métodos descritos acima permitir um tratamento simples, eficaz e robusto de qualquer vôo livre ou abelhas aproveitado. Estes métodos são compatíveis com diversos paradigmas experimentais e questões biológicas (Tabela 1). Todos os métodos livre de vôo pode ser facilmente aplicado para as abelhas aproveitado. O inverso é menos bem sucedido, no entanto, uma vez restrição temporária e métodos invasivos de tratamento muitas vezes pode comprometer a capacidade de vôo das abelhas.

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este projeto foi financiado pela DP0986021 de concessão ARC e pela 585442 de concessão do NHMRC. A ABB é apoiada por uma ARC Future Fellowship (FT140100452). O JAP é apoiado por uma bolsa iMQRES concedida pela Macquarie University e por um DAAD-Doktorandenstipendium concedido pelo Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico. O JMD é apoiado pelo CNRS e pela Universidade Paul Sabatier.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
SucroseSigma-AldrichS8501Qualquer fornecedor fará
Cloreto de SódioSigma-AldrichS7653
Cloreto de PotássioSigma-AldrichP9333 
Cloreto de magnésio hexahidratadoSigma-AldrichM2670
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigma-AldrichC8106
Dextrose monohidratadaSigma-Aldrich49159
Tampão fosfato salino (PBS)Sigma-AldrichP4417
Cera de proteçãoDentaurum124-305-00
HEPESSigma-AldrichH3375
dimetilformamidaSigma-AldrichD4551
95% EtanolSigma-Aldrich493511
Capilar de vidroWPI1B100F-3
23 G Agulha NanoFilWPINF33BV-2
Forsceps muito finoDumont0208-55-PO
Eletrodo extratorSRI2001
Microinjetor FemtoJetEppendorf5247 000.01
EicosaneSigma-Aldrich219274
micromanipulador manualBrinkmann InstrumentenbauMM-33
micromanipulador eletrônicoLuigs & Neumann Feinmechanik + ElektortechnikUnidade júnior XYZ
estereomicroscópioLeicaM80
ferro de soldaWellerWESD51
Dextran, Alexa Fluor 546, 10.000 MWThermoFisher ScientificD-22911
Dextran, Alexa Fluor 568, 10.000 MWThermoFisher ScientificD-22912
placa de Petri pequenaÓleo mineral Sigma-AldrichP5481
Sigma-AldrichM5904
50 mlde 339652científica ThermoFisher
Suprimentos
Suporte e disjuntor da lâminaSuprimentos entomológicos australianosE130
Lâminade barbear de dois gumes de penasThermoFisher Scientific50-949-135
de nicromoQualquer fornecedor fará
FiosQualquer fornecedor fará
Tinta modeloTamiya USADepende da cor
Dispensador de repetiçãoEmpresa HamiltonPB-600-1
Seringa de vidroWPINANOFIL
sistema de visualização de fluorescênciaNightseaSFR-GR
gratículaProSciTechS8014-24
microcapilar com suporteDrummond1-000-0010
SiliconeQualquer fornecedor fará
TermoparDigitechQM-1324
MicropipetaEppendorf
Tubo de centrífuga Pinça entomológicos australianosFio elétricos líquido

Referências

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