Conformações GPCR G Protein selectivos medida usando FRET Sensores em um Fluorometer Ensaio de células vivas de suspensão

Resumo

Métodos simples para detectar a ativação seletiva de proteínas G por receptores acoplados à proteína G continuam sendo um grande desafio na sinalização celular. Aqui, os biossensores de transferência de energia de ressonância Fӧrster (FRET) foram desenvolvidos amarrando um GPCR a peptídeos de proteína G para sondar mudanças conformacionais em concentrações controladas em células vivas.

Resumo

Fӧrster transferência de energia de ressonância (FRET) à base estudos têm se tornado cada vez mais comum na investigação de sinalização de GPCR. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um sensor de FRET intra-molecular para detectar a interacção entre subunidades e GPCRs em células vivas após a estimulação agonista Gu. Aqui, nós detalhe o protocolo para a detecção de alterações na TERF entre o receptor adrenérgico β ₂ e o péptido C-terminal Gαs mediante tratamento com cloridrato de isoproterenol 100 uM como previamente caracterizados ^1. O nosso sensor de FRET é um polipéptido único que consiste em série de um GPCR de comprimento completo, um fluoróforo FRET aceitador (mCitrine), um ER / K ESPASMO (afinidade de proteína sistemática modulação força) ligante, um fluoróforo FRET dador (mCerulean), e uma Gu C peptídeo-terminal. Este protocolo irá preparação celular detalhe, condições de transfecção, configuração de equipamentos, execução de ensaio e análise de dados. Este projeto experimental detecta pequena chAnges em FRET indicativa de interacções proteína-proteína, e também pode ser utilizado para comparar a força da interacção entre ligandos de GPCR e emparelhamentos de proteína-G. Para melhorar o sinal-ruído nas nossas medições, este protocolo exige precisão elevado em todas as etapas, e é aqui apresentada para permitir a execução reprodutível.

Introdução

receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são receptores transmembranares de sete. O genoma humano sozinho contém aproximadamente 800 genes que codificam para os GPCRs, que são activadas por uma variedade de ligandos incluindo a luz, odorantes, hormonas, péptidos, fármacos e outras moléculas pequenas. Quase 30% de todos os produtos farmacêuticos atualmente no GPCRs alvo do mercado porque eles desempenham um papel importante em muitos estados de doença ^2. Apesar de décadas de um extenso trabalho feito nesta família de receptores, continua a haver questões pendentes significativas no campo, especialmente no que diz respeito aos mecanismos moleculares que lev....

Protocolo

1. Preparação de DNA

1. sensor de projeto constrói usando um esquema de clonagem modular. Por favor, refira o projeto do sensor β _2-AR detalhado anteriormente ^1.
2. Preparar DNA de acordo com o protocolo do kit miniprep comercial e elui-se em solução 2 mM de Tris-HCl, pH 8, com ≥ concentração de 750 ng / ul, _A260 / _A280 de 1,7-1,9, A ₂₆₀ / A ₂₃₀ de 2,0 - 2.29.

2. Cultura de Células Preparação

1. células de cultura de células HEK-293T-Flp-n em DMEM contendo 4,5 g / L de D-glucose, suplementado com 10% de FBS (inactivado pelo calor) (v / v), 1% de....

Resultados

Um esquema generalizado de a configuração da experiência e execução é detalhado na Figura 3.

A fim de detectar uma mudança FRET na faixa dinâmica estreita do sensor, é fundamental respeitar as nuances do sistema ser respeitados. Qualidade celular é imperativo para a expressão da proteína, assim como a consistência na amostragem. A Figura 1 apresenta imagens de células cultivadas crescem em uma monocamada consistente (10X) que é óptima para seis poços plaquea.......

Discussão

A gama dinâmica apertada de medições FRET neste sistema reforça a necessidade de um controle sensível de qualidade em cada etapa deste protocolo. Os passos mais importantes para assegurar uma experiência de FRET são bem sucedida 1) cultura das células, 2) transfecção 3) a expressão da proteína e 4) oportuna, uma coordenação precisa durante a execução do ensaio.

a saúde das células e qualidade de manutenção / chapeamento pode ter um impacto significativo sobre o ruído sinal-do sistema experim.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sensor de peptídeo B2-AR-10 nm-Gas	Addgene	47438	https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Fermentas/Fisher Sci	FERK0503	Elue em células de tampão de eluição Tris de 2 mM
HEK-293T-Flp-n	Life Technologies	R78007
Tripsina (0,25%)	Life Technologies	25200056
DMEM- alta glicose	Life Technologies	11960-044	Quente em  37   C banho-maria antes do uso
FBS, certificado, Inativado por calor, origem americana	Life Technologies	10082147
Glutamax I 100x	Life Technologies	35050061
HEPES	Corning	MT25060CL
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Meio de soro reduzido; Leve à RT antes de usar
XtremeGene HP reagenet de transfecção	Roche	6366236001	Altamente recomendado por sua consistência. Traga para RT antes de usar
FluoroMax 4	Horiba		Use com o software FluorEssence V3.8
Cubeta de quartzo de comprimento de caminho de 3 mm	Starna	NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)	Pode necessitar de suporte/adaptador de cubeta para uso em Fluorômetro, disponível na Starna
Sc100-S3 Bomba de água de circulação aquecida	Fisher Scientific	13-874-826	Quente até 37 ° C antes de usar
Thermomixer Heat Block	Eppendorf	22670000	Warm to 37 & C antes do uso
Água livre de DNA/RNAse ultrapura	Life Technologies	10977015	Uso em RT
D(+)-glicose, anidro	Sigma	G5767
aprotinina de pulmão bovino	Sigma	A1153
hemissulfato de leupeptina	EMD	10-897
Ácido L-ascórbico, grau reagente	Sigma	A0278
(-)- bitartarato de isoproterenol (+)	Sigma	I2760	Utilizar alíquota nova em cada experiência