Name: Conformações GPCR G Protein selectivos medida usando FRET Sensores em um Fluorometer Ensaio de células vivas de suspensão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a medir conformações seletivas de GPCR para proteínas G usando sensores FRET em ensaio de células vivas em suspensão. Este método modular permite reengenharia para diferentes combinações de GPCR e peptídeos G alfa.

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RUM foi financiado pela Fellowship da American Heart Association Pré-doutoramento (14PRE18560010). A pesquisa foi financiada pelo Desenvolvimento Scientist Grant American Heart Association (13SDG14270009) e do NIH (1DP2 CA186752-01 &amp; 1-R01-GM-105646-01-A1) para SS

1. Preparação de DNA <ol><li> sensor de projeto constrói usando um esquema de clonagem modular. Por favor, refira o projeto do sensor β 2-AR detalhado anteriormente 1. </li><li> Preparar DNA de acordo com o protocolo do kit miniprep comercial e elui-se em solução 2 mM de Tris-HCl, pH 8, com ≥ concentração de 750 ng / ul, A260 / A280 de 1,7-1,9, A 260 / A 230 de 2,0 - 2.29. </li></ol> 2. Cultura de Células Preparação <ol><li> células de cultura de células HEK-293T-Flp-n em DMEM contendo 4,5 g / L de D-glucose, suplementado com 10% de FBS (inactivado pelo calor) (v / v), 1% de suplemento de L-glutamina, HEPES 20 mM, pH 7,5 a 37 ° C em atmosfera humidificada em 5% de CO 2. Lidar com células em capô de segurança biológica para as etapas subsequentes. </li><li> Permitir que as células cresçam a uma monocamada confluente antes passaging em placas de seis poços. Tempo para atingir confluência depende densidade de revestimento inicial. Utilizar placas quevir até à confluência dentro de 1 - 2 dias de plaqueamento para seis poços chapeamento. Um prato tratados com cultura confluente tecido 10 centímetros tem densidade celular de cerca de 4 x 10 6 culas / ml. Ver Figura 1 para uma imagem de crescimento de cultura de células. </li><li> Lave as células com 10 ml de PBS, e trypsinize com 0,25% de tripsina (ver discussão, parágrafo 2). Placa de 8 x 10 5 células / cavidade em 2 ml de meio de cultura de tecidos tratados com seis pratos e permitem assim a aderir durante 16 - 20 h. </li></ol> 3. Condições de transfecção <ol><li> Escalonar para transfecções construções que podem exigir diferentes quantidades de tempo para conseguir uma expressão óptima (entre 20 - 36 h). Sincronizar condições para um tempo de experiência unificada. Também tem um controlo não transfectadas bem à densidade celular equivalente a ser usado para subtracção do ruído de fundo e de espalhamento durante a análise. </li><li> Traga reagentes de transfecção à temperatura ambiente: meio de soro reduzido, DNA, reagentes de transfecção. </li><li> Em umcobertura de segurança biológica combinar os reagentes num tubo de microcentrífuga estéril, na seguinte ordem: misturar 2 ug de ADN com 100 ul de meio de soro reduzido. Pico de 6 ul de reagente de transfecção na mistura meio / ADN, sem tocar na superfície de mistura ou o lado do tubo. Configure uma reacção de transfecção por poço. condições de transfecção pode ser optimizado (1-4 ug de ADN, 3 - 6 ul de reagente de transfecção) para alcançar níveis de expressão consistentes. Ver Tabela 1 para os rácios mais optimizado. </li><li> Incubar mistura à temperatura ambiente na capa de segurança biológica para 15-30 min. Não use reação se deixado a incubar durante mais de 30 min. </li><li> Adicionar reação a células de uma maneira gota a gota através de bem e agite de seis poços para assegurar uma mistura completa. Adicione uma reacção por poço. </li><li> Após 20 horas de expressão, monitor de fluorescência usando cultura de tecidos microscópio de fluorescência. Avaliar a expressão da população com 10X localização objectivo e proteína numa célula em 40X. Observe para a expressão da proteína na membrana plasmática (PM). Se internalização substancial é observado, monitorar transfecção até expressão significativa é detectada a PM. </li></ol> 4. Reagente e equipamento para preparação <ol><li> Preparar stocks de 100 mm e armazenar a -80 ° C: bitartarato de isoproterenol (100 mM em dH 2 O contendo ácido ascórbico a 300 mM). Faça em gelo / em câmara fria, e flash-congelar imediatamente. As aliquotas podem ser feitas e usadas até um ano. </li><li> Preparar tampão celular (~ 2 ml / condição) e armazenar em um banho de água C 37 °. Faça fresco todos os dias. Tabela de Referência 2 para Célula de Armazenamento constituintes. </li><li> Preparar tampão de Drogas (10 ml) e armazenar em temperatura ambiente. Tabela de Referência 2 para constituintes do tampão de Drogas. </li><li> Ácido lavar cuvetes utilizando HCl concentrado. Neutralizar com uma base fraca (1 M KOH), e lave cuvetes com dH 2 O. </li><li> Prepare estação de trabalho em torno de fluorímetro com diversoscaixas de 10, 200 e 1.000 dicas ul pipeta, um temporizador definido com um 10 min contagem regressiva, uma linha de vácuo acessível com dicas para limpeza de cuvetes, toalhetes tarefa delicada, e garrafa de esguicho com ultrapura H 2 O. </li><li> Aqueça banho de água externo para fluorômetro e calor bloco para 37 ° C. </li><li> Ligue fluorômetro; definir programa de coleta de fluorescência para a coleta PCP à excitação 430 nm, passa-banda 8 nm; faixa de emissão de 450 nm - 600 nm, passagem de banda de 4 nm. Para a coleta de YFP apenas como controle de sensor (ver Discussão) Conjunto de excitação a 490 nm, de banda 8 nm, faixa de emissão de 500-600 nm, passa-banda 4 nm. configurações de coleta da PCP serão usados ​​para adquirir um espectro FRET neste experimento. </li><li> Coloque doze tubos de 1,5 ml de microcentrífuga em bloco de aquecimento, como mostrado na Figura 2, abaixo. Esses tubos são suportes para tubos de alíquota de células (microtubos 500 mL). Coloque um pequeno pedaço de tecido em suportes 1 e 7 para amortecer as cuvetes colocados aqui. Nota: Use cuvetes separadas para a condição não tratada e da condição de drogas para evitar a contaminação cruzada. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" /> Figura 2. Micro-tubo Configurar e posição de referência no calor do bloco Cuvette para amostras não tratadas está na posição. 1; tubos de alíquota de células estão em posições 2 - 6. Cuvette para amostras tratadas com droga é na posição 7; tubos de alíquota de células estão em posições 8 - 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="9"><li> Encha detentores 2 - 6 e 8 - 12 com ~ 750 mL de água para criar uma mini-37 ° C Banho de água. </li><li> Coloque dez 500 microtubos ul de alíquotas de células em banhos mini-água (detentores 2 - 6, 8 - 12). Cada tubo será uma individual de repetição do quadro (5 untreated, 5 de drogas tratados). </li><li> células para a expressão Monitor (veja o passo 3.6). </li></ol> 5. Experiência e Recolha de Dados <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" /> Figura 3. Experimental esquemático. Um guia detalhado passo a passo para a montagem experimental e execução. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Referência Figura 3 para o esquema experimental. Quando as células estão prontas para serem colhidas, com base na expressão de proteínas detectadas com microscópio de fluorescência (ver discussão, parágrafo 4): na capa de segurança biológica, remover suavemente ~ 1 ml de mídia, Ressuspender as células em sua cultura com uma P1,000 e transferir ressuspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Nota: Evitar utilizando tripsina, uma vez que podem digerir o N-terminal e /ou no bolso do sensor GPCR vinculativo. </li><li> Contar as células para assegurar a densidade de células apropriada na ressuspensão. Melhorar o volume de ressuspensão para 4 x 10 6 culas / ml. </li><li> Girar em células centrífuga basculante à temperatura ambiente, 290 x g durante 3 min. Remover o sobrenadante, após a centrifugação. </li><li> GENTLY Ressuspender as células em 1 ml de tampão celular (armazenada a 37 ° C) e repetir o passo 5.3. Durante a segunda rodada, reunir 100 mM estoque de drogas alíquota de -80 ° C. Faça diluição 1: 100 em tampão de Drogas imagens trabalhando 1 mM e mantê-RT. </li><li> Após a segunda centrifugação, remover o sobrenadante e as células suavemente ressuspender em 1 ml de tampão celular (4 x 10 6 culas / ml). Medida OD600 da amostra no espectrofotómetro usando 1 ml de células e 1 ml de tampão celular como um branco. Dispense células em uma tina de plástico descartável e transferir de volta para um tubo de microcentrífuga imediatamente após espectrofotometria. </li><li> Para um cel não transfectada controlel espectro de condições, delicadamente ressuspender as células não transfectadas em Tampão 1 ml celular com P1,000 pipeta, adicionar 90 ul de células de Cuvette e adquirir espectro FRET na excitação 430 nm, passa-banda 8 nm, emissão 450-600 nm, passa-banda 4 nm. Colete 3 - 5 espectros de repetição com frescos 90 ul de células. Manter o estoque de células a 37 ° C entre especificações, ressuspender suavemente com P1,000 entre cada aliquota de amostra, e enxaguar tina com ultrapura H2O entre as amostras. </li><li> Para as condições experimentais, alíquotas de 90 ul de células transfectadas para cada um dos 500 tubos ul em suportes 2 - 6, 8 - 12 no bloco de calor. Volte a suspender suavemente estoque de células com uma pipeta P1,000 entre cada alíquota. </li><li> Depois as células são aliquotadas, adicionar 10 ul de tampão de drogas aos tubos 2-6 para as amostras não tratadas de condição. </li><li> Comece a experiência, adicionando 10 ml de solução de droga 1 mM no tubo 8, iniciar o temporizador de contagem regressiva de 10 min, e misture delicadamente tubo com P200 pipeta. Fechar tubo e regresso a 37° bloco de calor C. </li><li> imediatamente pegar tubo 2, misture delicadamente com P200 (usar uma nova ponta), adicionar 90 ul de suspensão de células a condição cuvete não tratada, e coloque em fluorímetro. </li><li> Adquirir espectro de FRET em excitação 430 nm, passagem de banda 8 nm, emissão a 450-600 nm, passagem de banda de 4 nm. </li><li> Aos 9 min - 10 seg, spike tubo 9 com 10 ml de solução de droga 1 mM, misture delicadamente com uma P200 (use nova ponta) e tubo para aquecer bloco retornar. </li><li> Repita os passos 5,10-5,11 com o tubo 3 e 5,12 com tubo de 10. </li><li> Repita os passos de 5,10-5,13 em intervalos de 1 min (08:10, 07:10, etc.) até espectros são recolhidos para todas as amostras não tratadas de condição, e de drogas foi adicionado a todas as amostras condição de drogas. Utilizar uma ponteira nova para cada etapa pipeta para evitar a contaminação cruzada. </li><li> Aos 5 min - 10 seg, começar a misturar tubo 8 (condição de drogas) delicadamente com P200 pipeta, adicionar 90 ul de suspensão de células a cuvete separado para amostra da droga tratada e coloque em fluorímetro. </li><li> adquirir Fespectro de RET (veja o passo 5.11 para configurações). </li><li> Repita os passos de 5,15 - 5,16 em intervalos de 1 min (04:10, 03:10, etc.) para restantes amostras condição de drogas (tubos 9 - 12). </li><li> Depois de experiência termina, salvar arquivos de projeto, lave cuvetes com ultrapura H 2 O, e re-stock tubos para o próximo estado. Tome cuidado para evitar a contaminação cruzada na etapa de lavagem. Mudar a ponta sobre a garrafa H2O, bem como na linha de vácuo entre lavagens. </li></ol> Análise 6. Os dados <ol><li> Salve e arquivos de dados de exportação em SPC formato a ser usado para a análise. programas de análise estão disponíveis para download a partir do site de publicação do Sivaramakrishnan Lab. </li><li> Criar arquivos de caminho para o software de análise que incluem os programas de análise (v9, v15), arquivos de amostras untransfected (veja o passo 5.6 para a coleta não transfectada espectro celular), arquivo de dados de saída e arquivos de valores separados por vírgulas (CSV) para entrada de dados. </li><li> Digite seguintes informaçõesem arquivo CSV (ver exemplo na Tabela 3) e designar respectivas condições para cada amostra, incluindo: O nome do arquivo - arquivos de gráficos SPC individuais Receptor - designar quais construção GPCR foi testado (por exemplo, Β2) Binder - designar quais péptido variante da construção foi testada (por exemplo, S) Agonista - designar sem tratamento (N) ou condições tratadas com droga (D) Directory - a pasta do caminho em que os arquivos são salvos SPC, geralmente organizados por data OD - registrou densidade óptica da amostra do espectrofotômetro </li><li> Digite nomes de arquivo para amostras untransfected (passo 5.6) para subtrair tampão e do ruído espalhando a partir de amostras. </li><li> Entre as condições em programa de análise. </li><li> executar programas para analisar amostras em condições individuais (v9) e em diferentes condições (v15). </li><li> Excluir arquivos de amostra que são aparentes outliers no conjunto de dados, ou ajustar para subtração, aumentando ou diminuindo o valor OD de indiviarquivos duais. </li><li> Exportar dados para o arquivo de saída para o acesso à calculada FRET proporções (525 nm / 475 nm). </li><li> Calcule ΔFRET subtraindo-se o rácio médio FRET para a condição não tratada a partir dos rácios de FRET individuais para condições tratados (de drogas). </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

A gama dinâmica apertada de medições FRET neste sistema reforça a necessidade de um controle sensível de qualidade em cada etapa deste protocolo. Os passos mais importantes para assegurar uma experiência de FRET são bem sucedida 1) cultura das células, 2) transfecção 3) a expressão da proteína e 4) oportuna, uma coordenação precisa durante a execução do ensaio. a saúde das células e qualidade de manutenção / chapeamento pode ter um impacto significativo sobre o ruído sinal-do sistema experim...

receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são receptores transmembranares de sete. O genoma humano sozinho contém aproximadamente 800 genes que codificam para os GPCRs, que são activadas por uma variedade de ligandos incluindo a luz, odorantes, hormonas, péptidos, fármacos e outras moléculas pequenas. Quase 30% de todos os produtos farmacêuticos atualmente no GPCRs alvo do mercado porque eles desempenham um papel importante em muitos estados de doença 2. Apesar de décadas de um extenso trabalho feito nesta família de receptores, continua a haver questões pendentes significativas no campo, especialmente no que diz respeito aos mecanismos moleculares que levam interações GPCR-efetoras. Até à data, apenas uma estrutura cristalina de alta resolução foi publicada, fornecendo informações sobre a interacção entre o receptor β 2 -adrenérgico (β 2-Ar) e a proteína Gs 3. Juntamente com uma extensa pesquisa nas últimas três décadas, reitera um componente estrutural específico que é fundamental nesteinteracção: a subunidade Gu C-terminal. Esta estrutura é importante tanto para a activação da proteína G por a selecção de proteínas GPCR 4 e G 5-6. Assim, a Gu C-terminal fornece uma ligação crucial entre a estimulação do ligando de GPCR e a activação de proteína G selectiva. Investigação na última década sugere que GPCRs preencher uma ampla paisagem conformacional, com ligando de ligação de estabilização subconjuntos de conformações GPCR. Embora várias técnicas, incluindo a cristalografia, RMN e espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de massa e estão disponíveis para examinar a paisagem conformacional GPCR, há uma escassez de abordagens para elucidar o seu significado funcional na selecção efectora 7. Aqui, descrevemos uma abordagem baseada Fӧrster transferência de energia de ressonância (FRET) para detectar G conformações GPCR proteína selectivo. FRET baseia-se na proximidade e orientação paralela dos dois fluoróforos com sobreposição de emissão (doador) umND excitação (aceitador) espectros 8. À medida que os fluoróforos dadores e aceitadores aproximar em conjunto, como resultado de qualquer alteração conformacional na proteína ou uma interacção proteína-proteína, a FRET entre eles aumenta, e pode ser medida utilizando uma variedade de métodos de 8. Biossensores baseados em FRET tem sido utilizado extensivamente no campo 9 GPCR. Eles têm sido utilizados para sondar as mudanças de conformação na GPCR através da inserção de dador e aceitador no terceiro laço intracelular e GPCR C-terminal; sensores foram concebidos para sondar GPCR e interações efetoras, rotulando separadamente do GPCR e efetoras (proteína G subunidades / Arrestinas) com um par FRET 10; alguns sensores também detectar alterações conformacionais na proteína G 11. Estes biossensores permitiram o campo para pedir uma série de perguntas pendentes, incluindo mudanças conformacionais na GPCR e efetoras, cinética de interação GPCR-efetoras, e ligantes alostéricos 12. Nosso grupoestava particularmente interessado na criação de um biossensor que poderá detectar G conformações GPCR específicos para a proteína em condições impulsionado-agonistas. Este biosensor se baseia em uma tecnologia desenvolvida recentemente nomeado SPASM (sistemática de afinidade de proteína força modulação) 13. SPASM envolve domínios proteicos amarrar interagir usando um ligante de ER / K, que controla as suas concentrações eficazes. Flanqueando o ligante com um par FRET de fluoróforos cria uma ferramenta que pode reportar o estado da interacção entre proteínas de 12. Anteriormente 1 módulo SPASM foi usada para amarrar o Gu C-terminal a um GPCR e monitorar suas interações com fluoróforos FRET, mCitrine (referido no presente protocolo por sua variante vulgarmente conhecido, Amarelo Proteína Fluorescente (YFP), excitação / emissão de pico em 490/525 nm) e mCerulean (referido no presente protocolo por sua variante comumente conhecido Cyan Fluorescent Protein (PCP), excitação / pico de emissão 430/475 nm). A partir de N- para C-terminal, tseu único polipéptido codificado geneticamente contém: um comprimento total de GPCR, FRET aceitador (mCitrine / YFP), 10 nm ER / ligante K, FRET dador (mCerulean / PCP), e o peptídeo C-terminal Ga. Neste estudo, os sensores são abreviados como GPCR péptido-ligante-Gu comprimento. Todos os componentes são separados por uma desestruturado (Gly-Ser-Gly) 4 ligante que permite a rotação livre de cada domínio. A caracterização detalhada de tais sensores anteriormente foi realizada utilizando dois GPCRs protótipos: β 2-AR e opsina 1. Este sensor é transientemente transfectado em células HEK-293T e viver experiências com células medida espectros de fluorescência baseada fluorómetro do par de FRET, em unidades arbitrárias de contagens por segundo (CPS), na presença ou ausência de ligando. Estas medições são utilizadas para calcular um rácio de FRET entre os fluoróforos (YFP max / PCP no máximo). Uma alteração na TERF (ΔFRET) é então calculado subtraindo-se a proporção média de FRETde amostras não tratadas a partir da razão de ligando de FRET de amostras tratadas. ΔFRET podem ser comparados entre construções (β 2-AR-10 peptídeo nm-Gαs contra p2-AR-10 nm-no peptídeo). Aqui, nós detalhe o protocolo para expressar esses sensores em células HEK-293T ao vivo, acompanhar a sua expressão, e a configuração, execução e análise da célula viva baseada fluorômetro FRET medida para tratamento contra condições de drogas tratados. Embora este protocolo é específico para o péptido do sensor nm-Gαs β 2-AR-10 tratadas com 100 uM de bitartarato de isoproterenol, pode ser optimizada para diferentes pares de ligandos de GPCR e-Ga.

<table><tbody><tr><td>Sensor de peptídeo B2-AR-10 nm-Gas</td><td>Addgene</td><td>47438</td><td>https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/</td></tr> <tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Fermentas/Fisher Sci</td><td>FERK0503</td><td>Elue em células de tampão de eluição Tris de 2 mM</td></tr><tr><td>HEK-293T-Flp-n</td><td>Life Technologies</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM- alta glicose</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Quente em&nbsp; 37 &nbsp; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>FBS, certificado, Inativado por calor, origem americana</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>MT25060CL</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Meio de soro reduzido; Leve à RT antes de usar</td></tr><tr><td>XtremeGene HP reagenet de transfecção</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Altamente recomendado por sua consistência. Traga para RT antes de usar</td></tr><tr><td>FluoroMax 4</td><td>Horiba</td><td></td><td>Use com o software FluorEssence V3.8</td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo de comprimento de caminho de 3 mm</td><td>Starna</td><td>NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)</td><td>Pode necessitar de suporte/adaptador de cubeta para uso em Fluorômetro, disponível na Starna</td></tr><tr><td>Sc100-S3 Bomba de água de circulação aquecida</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-874-826</td><td>Quente até 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Thermomixer Heat Block</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td>Warm to 37 & C antes do uso</td></tr><tr><td>Água livre de DNA/RNAse ultrapura</td><td>Life Technologies</td><td>10977015</td><td>Uso em RT</td></tr><tr><td>D(+)-glicose, anidro</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina de pulmão bovino</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>hemissulfato de leupeptina</td><td>EMD</td><td>10-897</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico, grau reagente</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>(-)- bitartarato de isoproterenol (+)</td><td>Sigma</td><td>I2760</td><td>Utilizar alíquota nova em cada experiência</td></tr></tbody></table>

conformações gpcr g protein selectivos medida usando fret sensores em um fluorometer ensaio de células vivas de suspensão

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Fӧrster transferência de energia de ressonância (FRET) à base estudos têm se tornado cada vez mais comum na investigação de sinalização de GPCR. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um sensor de FRET intra-molecular para detectar a interacção entre subunidades e GPCRs em células vivas após a estimulação agonista Gu. Aqui, nós detalhe o protocolo para a detecção de alterações na TERF entre o receptor adrenérgico β 2 e o péptido C-terminal Gαs mediante tratamento com cloridrato de isoproterenol 100 uM como previamente caracterizados 1. O nosso sensor de FRET é um polipéptido único que consiste em série de um GPCR de comprimento completo, um fluoróforo FRET aceitador (mCitrine), um ER / K ESPASMO (afinidade de proteína sistemática modulação força) ligante, um fluoróforo FRET dador (mCerulean), e uma Gu C peptídeo-terminal. Este protocolo irá preparação celular detalhe, condições de transfecção, configuração de equipamentos, execução de ensaio e análise de dados. Este projeto experimental detecta pequena chAnges em FRET indicativa de interacções proteína-proteína, e também pode ser utilizado para comparar a força da interacção entre ligandos de GPCR e emparelhamentos de proteína-G. Para melhorar o sinal-ruído nas nossas medições, este protocolo exige precisão elevado em todas as etapas, e é aqui apresentada para permitir a execução reprodutível.

Um esquema generalizado de a configuração da experiência e execução é detalhado na Figura 3. A fim de detectar uma mudança FRET na faixa dinâmica estreita do sensor, é fundamental respeitar as nuances do sistema ser respeitados. Qualidade celular é imperativo para a expressão da proteína, assim como a consistência na amostragem. A Figura 1 apresenta imagens de células cultivadas crescem em uma monocamada consistente (10X) que é óptima para seis poços plaquea...

Métodos simples para detectar a ativação seletiva de proteínas G por receptores acoplados à proteína G continuam sendo um grande desafio na sinalização celular. Aqui, os biossensores de transferência de energia de ressonância Fӧrster (FRET) foram desenvolvidos amarrando um GPCR a peptídeos de proteína G para sondar mudanças conformacionais em concentrações controladas em células vivas.

Conformações GPCR G Protein selectivos medida usando FRET Sensores em um Fluorometer Ensaio de células vivas de suspensão

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

O objetivo geral deste ensaio baseado em transferência de energia de ressonância de Förster em células vivas, ou FRET, é avaliar conformações de receptores acoplados a proteínas G seletivas para proteínas G sob diferentes condições de agonista. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de receptores acoplados a proteínas G sobre as interações dos receptores com diferentes efetores e o efeito de diferentes fármacos na conformação do receptor. A principal vantagem desta técnica é que os sensores são modulares e podem ser facilmente reengenharados para diferentes combinações de receptores acoplados a proteínas G e peptídeos G alfa, incluindo a subunidade completa e a subunidade G alfa.Embora este método possa fornecer informações sobre a seleção de proteínas G e a resposta a diferentes ligantes, ele também pode ser aplicado para explorar as consequências fisiológicas da ativação diferencial de proteínas G. Antes de iniciar o procedimento, cultive as células de interesse em meio completo a 37 graus Celsius, em atmosfera umidificada com cinco por cento de dióxido de carbono, até que as culturas atinjam confluência.Em seguida, desprenda as células com tripsina e subcultive as culturas em oito vezes 10 à quinta células por célula em dois mililitros de meio em placas de seis poços tratadas para cultura de tecidos, durante 16 a 20 horas de cultivo. Após 16 a 20 horas, prepare uma reação de transfeção por poço quando as células tiverem aderido às placas, em uma cabine de segurança biológica, e deixe as misturas de reagentes equilibrarem por 15 a 30 minutos. Ao final da incubação, adicione uma reação a cada cultura celular gota a gota ao longo do poço.Agite suavemente a placa para garantir uma distribuição completa do reagente por todas as culturas. Em seguida, retorne a placa ao incubador de cultura celular. Após 20 horas, analise as culturas quanto à expressão proteica da membrana plasmática e avalie a saúde celular.Se for observada uma internalização acentuada da proteína, monitore a transfeção até que uma expressão significativa seja detectada na membrana plasmática. Avaliar o nível de expressão da proteína é essencial para uma configuração experimental ideal. Se as células forem mal transfectadas ou a expressão da proteína for muito baixa, aguarde antes de colher as células.Caso contrário, o sinal fluorescente pode ser inadequado para análise. Quando as células estiverem prontas para serem colhidas, transfira-as para a cabine de segurança biológica e remova cuidadosamente um mililitro do meio. Usando uma pipeta P1000, ressuspenda as células em um mililitro do meio remanescente por poço e transfira as suspensões celulares para tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Conte as células e faça um pellet das células por centrifugação. Remova o meio do pellet celular. Resuspenda suavemente o sobrenadante em um mililitro de tampão celular a 37 graus Celsius e repita a centrifugação.Resuspenda o pellet em uma concentração de quatro vezes 10 à sexta células por mililitro em tampão celular fresco após a segunda centrifugação. Em seguida, adicione 90 microlitros de células controle a uma cubeta e obtenha o espectro de FRET controle. Após coletar de três a cinco espectros controle repetidos, utilizando 90 microlitros frescos de células para cada medição, repita os passos de suspensão, centrifugação e lavagem para as células transfectadas.Aliquotar 90 microlitros de células transfectadas para cada tubo de 500 microlitros nos suportes dois a seis e oito a 12 em um bloco térmico, ressuspendendo suavemente as células entre cada alíquota. Quando todas as células tiverem sido transferidas, adicionar 10 microlitros de tampão de droga aos tubos dois a seis para as amostras nas condições não tratadas. Em seguida, adicionar 10 microlitros da solução de droga de um milimolar ao tubo oito.Inicie um cronômetro para contagem regressiva de 10 minutos e use uma pipeta P200 para misturar suavemente o conteúdo do tubo. Feche o tubo após a mistura e devolva-o ao bloco de aquecimento. Em seguida, pegue imediatamente o tubo dois.Misture suavemente o conteúdo com uma nova ponteira. Adicione 90 microlitros da suspensão de células transfectadas ao cubeta da condição não tratada e coloque a cubeta no fluorímetro. Adquira o espectro FRET da amostra utilizando os mesmos parâmetros usados para os espectros controle.Após nove minutos e 10 segundos, adicione à tubo nove 10 microlitros da solução do fármaco de um milimolar. Misture suavemente o conteúdo do tubo e devolva-o ao bloco de aquecimento. Em seguida, pegue imediatamente o tubo três e misture e meça o conteúdo da cubeta conforme demonstrado anteriormente para o tubo dois.Após cinco minutos e 10 segundos, misture suavemente o tubo oito com uma pipeta P200. Adicione 90 microlitros da suspensão celular a uma cubeta separada para a medição da amostra tratada com fármaco e adquira o espectro FRET da amostra na condição com fármaco. Após a aquisição de todos os espectros, salve os arquivos do projeto.Lave minuciosamente as cubetas com água ultra pura e reabasteça os tubos para a próxima condição. Nesta imagem, é mostrada uma monocamada homogênea de cultura celular ideal para placa de seis poços e transfeção. No entanto, essas células que crescem em padrões agregados, levando a formas dendríticas, não são recomendadas para um plaqueamento consistente e para análise precisa da expressão proteica ou medição de FRET.As condições de transfeção também podem ser otimizadas para obter expressão reprodutível. Após todos os dados terem sido coletados e inseridos em um arquivo CSV para análise, os resultados gerados serão semelhantes a esses espectros representativos de FRET bruto e médio normalizado. Todos os espectros de FRET brutos deste experimento representativo demonstram uma relação sinal-ruído suave e suficiente, permitindo uma análise de dados consistente com um pico mínimo de água proveniente da amostra.Quando os dados são normalizados em 475 nanômetros, a contagem por segundo desse valor é ajustada para 1,0 e a alteração significativa na leitura de 525 nanômetros entre as amostras tratadas e não tratadas torna-se evidente. Se a expressão proteica for baixa, ou houver baixa eficiência de transfeção ou baixa densidade celular na cubeta durante a leitura de fluorescência, os dados brutos podem apresentar ruído, o que causa problemas na subtração do fundo e na normalização, resultando em espectros que não se alinham e não podem ser analisados. Após dominada, esta técnica pode ser concluída em 25 minutos, se realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular as células com cuidado em todas as etapas do experimento. Após este procedimento, a técnica pode ser expandida para testar diferentes sensores de FRET de receptores, diferentes fármacos e efetores, bem como diferentes tipos celulares. Após seu desenvolvimento, esta técnica contribuiu para o campo dos RCPGs, onde estudos recentes utilizando esses sensores elucidaram o mecanismo molecular da seleção de proteínas G.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar confirmações específicas de RCPG utilizando um ensaio de medida de construção FRET com células vivas fixadas. Não se esqueça de que trabalhar com cultivo celular de mamíferos e certas drogas experimentais pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

g-protein-selective-gpcr-conformations-measured-using-fret-sensors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve como imagem de interações proteína-proteína através de um ensaio de proximidade FRET-based.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Empregando um espectralmente resolvido dois fótons sistema de imagens de microscopia, pixel-nível mapas de Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eficiências são obtidas para células que expressam receptores de membrana para formar a hipótese de homo-oligoméricos complexos. Da FRET mapas eficiência, somos capazes de estimar informações sobre o complexo estequiométrico oligômero em estudo.

Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

Aqui, descrevemos os métodos detalhados de células vivas de imagem para investigar quimiotaxia. Apresentamos fluorescência métodos microscópicos para monitorar a dinâmica espaço-temporal dos eventos de sinalização em células migratórias. Medição dos eventos de sinalização nos permite entender melhor como uma rede de sinalização GPCR-alcança gradiente de detecção de quimioatrativos e controles de migração direcional das células eucarióticas.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia é uma técnica poderosa para monitoramento em tempo real de eventos de sinalização em células vivas usando biossensores diversos como repórteres. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagens a partir de componentes disponíveis comercialmente e como usá-lo para FRET experimentos.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

As interações de GPCR-β-prendedor são um campo emergente na descoberta da droga de GPCR. Métodos precisos, precisos e fáceis de configurar são necessários para monitorar tais interações em sistemas vivos. Nós mostramos um ensaio estrutural da complementação para monitorar interações de GPCR-β-prendedor em pilhas vivas do tempo real, e pode ser estendido a todo o GPCR.

Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas

Dado que os GPCRs são alvos atraentes para drogados, a triagem de ligantes GPCR é, portanto, indispensável para a identificação de compostos de chumbo e para estudos de desordeiro. Para esses esforços, descrevemos o PRESTO-Tango, uma plataforma de recursos de código aberto usada para o perfil simultâneo de recrutamento transitório β-arrestin2 em aproximadamente 300 GPCRs usando um ensaio de repórter baseado em TEV.

Interrogatório paralelo de β-Arrestin2 Recrutamento para Triagem de Ligand em escala GPCR usando ensaio PRESTO-Tango

Este estudo apresenta um procedimento detalhado para realizar experimentos de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando marcação site-specific via incorporação de aminoácidos não naturais (UAA). O protocolo fornece um guia passo a passo para a preparação de amostras smFET, experimentos e análise de dados.

Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

O protocolo apresentado neste estudo ilustra a eficácia do Detector de Diferença de AMPc In Situ  na medição do AMPc através de dois métodos. Um método utiliza um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com células HEK-293. O outro método demonstra células HASM individuais sob um microscópio fluorescente.

Dinâmica de cAMP em tempo real em células vivas usando o detector de diferença de cAMP fluorescente in situ

Este protocolo descreve o uso de biossensores baseados em BRAKET para medição em tempo real da ativação da proteína G em células vivas HEK293 após estimulação do ligante do receptor acoplado à proteína G. Aqui, o receptor β2-adrenérgico e o receptor canabinóide tipo 1 servem como exemplos para demonstrar a eficiência dos sensores para vários subtipos de proteína G e em vários GPCRs.

Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas

Aprenda a medir conformações seletivas de GPCR para proteínas G usando sensores FRET em ensaio de células vivas em suspensão. Este método modular permite reengenharia para diferentes combinações de GPCR e peptídeos G alfa.

Conformações GPCR G Protein selectivos medida usando FRET Sensores em um Fluorometer Ensaio de células vivas de suspensão

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