Conformações GPCR G Protein selectivos medida usando FRET Sensores em um Fluorometer Ensaio de células vivas de suspensão

O objetivo geral deste ensaio baseado em transferência de energia de ressonância de Forster de células vivas, ou FRET, é avaliar as conformações do receptor acoplado à proteína G ou GPCR seletivo da proteína G sob diferentes condições agonistas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo GPCR sobre as interações do GPCR com diferentes efetores e o efeito de diferentes drogas na confirmação do receptor. A principal vantagem dessa técnica é que os sensores são modulares e podem ser facilmente reprojetados para diferentes combinações de peptídeos GPCR e G alfa, incluindo a subunidade completa e G alfa.

Embora este método possa fornecer informações sobre a seleção da proteína G e a resposta a diferentes ligenos. Também pode ser aplicado para explorar a consequência fisiológica da ativação diferencial da proteína G. Antes de iniciar o procedimento, cultive as células de interesse em meio completo a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada a cinco por cento de dióxido de carbono até que as culturas atinjam a confluência.

Em seguida, separe as células com tripsina e passe as culturas em oito vezes 10 para a quinta células por célula em dois milímetros de meio em cultura de tecidos tratados com seis placas de poço por dezesseis a 20 horas de cultura. Após 16 a 20 horas, preparar uma reação de transfecção por alvéolo quando as células tiverem aderido às placas de uma cabine de segurança biológica e deixar as misturas de reagentes se equilibrarem por 15 a 30 minutos. No final da incubação, adicione uma reação a cada cultura de células gota a gota no poço.

Agitar suavemente a placa para garantir uma distribuição completa do reagente pelas culturas. Em seguida, retorne a placa para a incubadora de cultura de células. Após 20 horas, analise as culturas quanto à expressão proteica da membrana plasmática e avalie a saúde celular.

Se for observada internalização substancial da proteína, monitore a transfecção até que uma expressão significativa seja detectada na membrana plasmática. Avaliar o nível de expressão da proteína é imperativo para uma configuração experimental ideal. Se as células transfectarem mal ou a expressão da proteína for muito baixa, espere para colher as células.

Caso contrário, o sinal fluorescente pode ser inadequado para análise. Quando as células estiverem prontas para serem colhidas, transfira-as para o gabinete de biossegurança e remova suavemente um mililitro de meio. Usando uma pipeta P1000, ressuspenda as células em um mililitro do meio restante por poço e transfira as suspensões celulares para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro.

Conte as células e pelete as células por centrifugação. Remova o meio do pellet celular. Ressuspender suavemente o sobrenadante num mililitro de tampão celular a 37 graus Celsius e repetir a centrifugação.

Ressuspenda o pellet em uma concentração de quatro vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro em tampão de célula fresca após a segunda centrifugação. Em seguida, adicione 90 microlitros de células de controle a uma cubeta e adquira o espectro FRET de controle. Depois de coletar de três a cinco espectros de controle repetido com 90 microlitros de células para cada medição, repita as etapas de suspensão, centrifugação e lavagem para células transfectadas.

Alíquota 90 microlitros de células transfectadas para cada tubo de 500 microlitros no suporte dois a seis e oito a 12 em um bloco de calor, ressuspendendo suavemente as células entre cada alíquota. Quando todas as células tiverem sido transferidas, adicione 10 microlitros de tampão de fármaco aos tubos de dois a seis para as amostras de condição não tratada. Em seguida, adicione 10 microlitros de um milimolar da solução do medicamento ao tubo oito.

Inicie um cronômetro para contagem regressiva de 10 minutos e use uma pipeta P200 para misturar suavemente o conteúdo do tubo. Feche o tubo após a mistura e coloque-o de volta no bloco de calor. Em seguida, pegue imediatamente o tubo dois.

Misture seu conteúdo delicadamente com uma nova ponta. Adicione 90 microlitros da suspensão de células transfectadas à cubeta de condição não tratada e coloque a cubeta no fluorômetro. Adquira o espectro FRET para a amostra usando os mesmos parâmetros que para os espectros de controle.

Aos nove minutos e 10 segundos, espague o tubo nove com 10 microlitros da solução milimolar do medicamento. Misture suavemente o conteúdo do tubo e retorne o tubo ao bloco de calor. Em seguida, pegue imediatamente o tubo três e misture e meça o conteúdo da cubeta como acabamos de demonstrar para o tubo dois.

Aos cinco minutos e 10 segundos, misture suavemente o tubo oito com uma pipeta P200. Adicione 90 microlitros da suspensão celular a uma cubeta separada para a medição da amostra tratada com o medicamento e adquira o espectro FRET para a amostra da condição do medicamento. Depois que todos os espectros forem adquiridos, salve os arquivos do projeto.

Lave bem as cubetas com água ultrapura e reabasteça os tubos para a próxima condição. Nesta imagem, é mostrada uma monocamada homogênea de cultura de células que é ideal para seis poços de plaqueamento e transfecção. Essas células crescem em padrões agrupados que levam a formas dendríticas, no entanto, não são recomendadas para um plaqueamento consistente e análise precisa da expressão de proteínas ou medição de FRET.

As condições de transfecção também podem ser otimizadas para obter expressão reprodutível. Depois que todos os dados forem coletados e inseridos em um arquivo CSV para análise, os resultados gerados serão semelhantes a esses espectros RAW representativos e FRET médio normalizado. Todos os espectros RAW FRET deste experimento representativo demonstram uma faixa de sinal para ruído suave e suficiente, permitindo uma análise de dados consistente com um pico mínimo de água da amostra.

Quando os dados são normalizados em 475 nanômetros, as contagens por segundo desse valor são definidas como 1,0 e a mudança significativa na leitura de 525 nanômetros entre as amostras tratadas e não tratadas torna-se aparente. Se a expressão da proteína for baixa ou houver uma baixa eficiência de transfecção ou baixa densidade celular na cubeta para a leitura de fluorescência, os dados RAW podem ser ruidosos, causando um problema na subtração e normalização de fundo, resultando em espectros que não se alinham e não podem ser analisados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 25 minutos se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser gentil ao manusear as células em todas as etapas do experimento. Após este procedimento, a técnica pode ser expandida para testar diferentes sensores FRET receptores, diferentes drogas e efetores e diferentes tipos de células. Após seu desenvolvimento, essa técnica contribuiu para o campo GPCR, onde estudos recentes usando esses sensores lançaram luz sobre o mecanismo molecular da seleção da proteína G.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar confirmações específicas de GPCR usando um ensaio de medição de construção FRET de amarração de célula viva. Não se esqueça de que trabalhar com cultura de células de mamíferos e certos medicamentos experimentais pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar o equipamento de proteção individual apropriado devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.