Descreve-se aqui um novo método para gerar receptores de células T específicas para o antigénio (TCR) por emparelhamento a TCRα ou TCRβ de um TCR existente, possuindo a especificidade do antigénio de interesse, com hemichain complementar do repertório do receptor de células T periféricas. Os TCRs gerados de novo manter-antigénio com especificidade uma afinidade variável.
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Resumo
Resumo
receptores de células T (TCR) são utilizados clinicamente para dirigir a especificidade das células T para tumores alvo promissor como uma modalidade de imunoterapia. Por conseguinte, a clonagem de TCR específicos para vários antigénios associados a tumor tem sido o objectivo de muitos estudos. Para provocar uma resposta eficaz de células T, o TCR deve reconhecer o antigénio alvo com afinidade óptima. No entanto, a clonagem, tais TCRs tem sido um desafio e muitos TCRs disponíveis possuem afinidade sub-ótima para o antigénio correspondente. Neste protocolo, descrevemos um método de clonagem de novo de alta afinidade TCRs antígeno-específicas usando TCRs existentes, explorando hemichain centralidade. Sabe-se que para algumas TCR, cada TCRα ou TCRβ hemichain não contribuem igualmente para o reconhecimento do antigénio, e a hemichain dominante é referido como o hemichain centrada. Nós mostramos que, emparelhando o hemichain centrado com contra-correntes diferentes da cadeia contador original, somos capazes de manter o antígeno specificity, enquanto modula a sua força de interação para o antigénio cognato. Assim, o potencial terapêutico de um determinado TCR pode ser melhorada pela optimização do emparelhamento entre as centrais e contador hemichains.
Introdução
receptores de células T (TCR) são receptores heterodiméricos imunes adaptativas expressa por linfócitos T, compostas por uma cadeia TCRα e TCRβ. Eles são gerados por meio de rearranjo somático de V (D) J segmentos de genes, o que produz um repertório diverso altamente capazes de reconhecer configurações virtualmente ilimitado de complexos de HLA / péptido. Clinicamente, as células T manipuladas para expressar clonotípico TCRs específicos para antigénios associados a tumores demonstraram eficácia em uma variedade de cancros 1. No entanto, muitos TCRs clonados para este propósito não têm afinidade suficiente para o antigénio de interesse, o que limita a sua ....
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Protocolo
1. Preparar Retroviral construção que codifica TCR Hemichain de Interesse
- Linearizar pMX vector para permitir a inserção de um gene de TCR em passos subsequentes. Digerir o ADN de plasmídeo com enzimas de restrição EcoRI e NotI a 37 ° C durante 3 horas (Tabela 1) 8.
- Realizar a eletroforese do plasmídeo digerido em 1,2% em gel de agarose. Banda especial de consumo de aproximadamente 4.500 pares de base (bps), e eluir em 30 mL de água estéril usando comercialmente disponíveis kits de extração de gel 9.
- Design de 5 'e 3', os iniciadores para o gene de TCR de interesse que também codificam 15-2....
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Resultados
Sem o conhecimento prévio de que hemichain cadeia é centrada, a cadeia TCRα e TCRβ deve ser clonadas separadamente e transduzidos para células T de sangue periférico, o que foi feito no caso do HLA-A24 / WT1 reactivo TAK1 TCR (Figura 1). Transdução de TAK1β produziram uma frequência notavelmente mais elevada de células T específicas de antigénio. Por outro lado, a transdução de um hemichain não centrada não produziria de novo as células T positivas multímero, co.......
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Discussão
O primeiro requisito para a aplicação bem sucedida deste método é alcançar a eficiência de transdução suficiente de células T primárias com o hemichain de interesse. Na nossa experiência, a combinação de PG13 utilizando como linha celular de empacotamento e pMX como resultado o vector retroviral na expressão estável e eficiente do gene introduzido em células T humanas primárias. células de empacotamento PG13 pode ser clonado de uma única célula para seleccionar para células de empacotamento de título elevado para melhor.......
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Divulgações
A University Health Network registrou uma patente relacionada a essa metodologia, na qual N.H., M.N. e T.O. são nomeados como inventores. Os demais autores não têm conflitos de interesse financeiros.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela concessão R01 CA148673 (NH) do NIH; o Prêmio de Investigador Clínico IA-039 (NH) do Instituto de Pesquisa do Câncer de Ontário; Subsídio de Catalisador BioCanRX (NH); A Fundação do Câncer Princesa Margaret (MOB, NH); Bolsa de Pós-Graduação (TG) do Canadian Institutes of Health Research Canada; Bolsa de Pós-Graduação (TG) do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá; Província de Ontário (TG, MA); e Prêmio Guglietti Fellowship (TO). Os monômeros HLA e CD1d foram gentilmente fornecidos pela instalação central de tetrâmeros do NIH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% de tripsina-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG células | geradas por Ory et al. (ref 8) | ||
| Ágar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Sal de ampicilina sódica | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Clorofórmio | BioShop | CCL402 | |
| Desoxinucleotídeo (dNTP) Solução Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, glicose alta, piruvato | Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Kit de Extração de Gel DNA de Coluna de Rotação | BS353 | ||
| Soro Fetal Bovino | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filtro | Corning | 431220 | Membrana SFCA de poro de 0,45 mm Membrana |
| anti-CD271 humana conjugada com FITC (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| Clone anti-humano conjugado com FITC CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | usado para montagem de DNA de várias peças |
| Pentâmero HLA-A2 | Proimmune | depende do peptídeo antigênico | O multímero HLA-A2/MART1 usado aqui foi comprado de |
| monômeros HLA/CD1d | NIH Tetramer Core Facility | multimerizar monômeros de acordo com o protocolo fornecido pela instalação central de tetrâmero do NIH | |
| Soro AB humano | Valley Biomedical | HP1022 | |
| microesferas CD3 humanas | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Kit de repertório | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 células | Gerado por Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Caldo | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS coluna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alfa Competente E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | usado para digestão EcoRI e NotI |
| New England Biolabs | R0189S | ||
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | usado para purificação de plasmídeo |
| PC5 conjugado anti-humano CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| Células PG13 | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion DNA polimerase de alta fidelidade | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX vetor retroviral | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleucina (interleucina-2 humana recombinante) | Novartis | by Rx apenas | produto equivalente pode ser adquirido da Sigma-Aldrich |
| Anticorpo anti-CD3 humano purificado | Biolegend | 317301 | clone OKT3, usado para estimulação de células T |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | usado para multimerizar monômeros da instalação central de tetrâmero do NIH |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Água estéril | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III Sistema de Síntese de Fita Inicial | Invitrogen | 18080051 | para síntese de cDNA |
| Seringa | BD | 301604 | 10 ml, ponta deslizante |
| Cloridrato de tetraciclina | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | usado para transfectar células 293GPG |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
Referências
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G.....
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Reimpressões e permissões
