Descreve-se aqui um novo método para gerar receptores de células T específicas para o antigénio (TCR) por emparelhamento a TCRα ou TCRβ de um TCR existente, possuindo a especificidade do antigénio de interesse, com hemichain complementar do repertório do receptor de células T periféricas. Os TCRs gerados de novo manter-antigénio com especificidade uma afinidade variável.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Gerando
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
receptores de células T (TCR) são utilizados clinicamente para dirigir a especificidade das células T para tumores alvo promissor como uma modalidade de imunoterapia. Por conseguinte, a clonagem de TCR específicos para vários antigénios associados a tumor tem sido o objectivo de muitos estudos. Para provocar uma resposta eficaz de células T, o TCR deve reconhecer o antigénio alvo com afinidade óptima. No entanto, a clonagem, tais TCRs tem sido um desafio e muitos TCRs disponíveis possuem afinidade sub-ótima para o antigénio correspondente. Neste protocolo, descrevemos um método de clonagem de novo de alta afinidade TCRs antígeno-específicas usando TCRs existentes, explorando hemichain centralidade. Sabe-se que para algumas TCR, cada TCRα ou TCRβ hemichain não contribuem igualmente para o reconhecimento do antigénio, e a hemichain dominante é referido como o hemichain centrada. Nós mostramos que, emparelhando o hemichain centrado com contra-correntes diferentes da cadeia contador original, somos capazes de manter o antígeno specificity, enquanto modula a sua força de interação para o antigénio cognato. Assim, o potencial terapêutico de um determinado TCR pode ser melhorada pela optimização do emparelhamento entre as centrais e contador hemichains.
Introdução
receptores de células T (TCR) são receptores heterodiméricos imunes adaptativas expressa por linfócitos T, compostas por uma cadeia TCRα e TCRβ. Eles são gerados por meio de rearranjo somático de V (D) J segmentos de genes, o que produz um repertório diverso altamente capazes de reconhecer configurações virtualmente ilimitado de complexos de HLA / péptido. Clinicamente, as células T manipuladas para expressar clonotípico TCRs específicos para antigénios associados a tumores demonstraram eficácia em uma variedade de cancros 1. No entanto, muitos TCRs clonados para este propósito não têm afinidade suficiente para o antigénio de interesse, o que limita a sua aplicação terapêutica.
Aqui, descrevemos um método para superar esta limitação para TCRs existentes, explorando cadeia de centralidade. Tem sido relatado que um hemichain TCR poderia desempenhar um papel mais dominante no reconhecimento do antigénio alvo 2, aqui denominado centralidade. análises estruturais de cristal têm mostrado que um centradahemichain de um TCR poderia ser responsável pela maior parte da pegada do MHC / péptido complexo 3,4. Utilizando este conceito, já anteriormente demonstrado que a SIG35α TCRα pode emparelhar com um repertório diversificado de cadeias TCRβ e manter a reactividade contra o peptídeo MART1 27-35 apresentado por HLA-A2 5. Resultados semelhantes foram obtidos com o TCR TAK1, onde o hemichain TCRβ centrada emparelhado com várias cadeias TCRα e mantida a reactividade para o péptido WT1 235-243 apresentado por HLA-A24 6. Ambos MART1 e WT1 são antigénios associados a tumores. Chain-centricity também foi aplicado para estudar o reconhecimento do antígeno de TCR CD1d-restritas invariantes natural killer (iNKT), emparelhando a invariante cadeia Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα de TCRs iNKT humanos com diferentes cadeias Vβ11 TCRβ 7.
Em todos os casos, fomos capazes de gerar um repertório de novo de TCR por transdução do hemichain TCR centric às células T do sangue periférico, onde a hemichain introduzido emparelhados com o TCRα endógena ou TCRβ contra-correntes. Em essência, o hemichain centrada serve como um isco, que pode ser usado para identificar as contra-correntes adequadas, as quais quando combinadas em conjunto formam TCRs que mantêm a especificidade do antigénio de interesse, mas variando na afinidade. A partir destes novos repertórios, fomos capazes de isolar TCR clonotípicas com uma resistência melhorada contra a interacção do antigénio alvo em comparação com os TCRs pré-existentes. Portanto, acreditamos que este método irá acelerar o gasoduto de identificar TCRs ideais para aplicação clínica.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparar Retroviral construção que codifica TCR Hemichain de Interesse
- Linearizar pMX vector para permitir a inserção de um gene de TCR em passos subsequentes. Digerir o ADN de plasmídeo com enzimas de restrição EcoRI e NotI a 37 ° C durante 3 horas (Tabela 1) 8.
- Realizar a eletroforese do plasmídeo digerido em 1,2% em gel de agarose. Banda especial de consumo de aproximadamente 4.500 pares de base (bps), e eluir em 30 mL de água estéril usando comercialmente disponíveis kits de extração de gel 9.
- Design de 5 'e 3', os iniciadores para o gene de TCR de interesse que também codificam 15-20 pb que se sobreponham ao local digestão com EcoRI e Notl do vector pMX, respectivamente 8.
- Amplificar o gene do TCR com primers. Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1000 pb, tal como descrito na etapa 1.2.
- Clonar o gene do TCR no vector digerido por combinação de cada fragmento linear com o plasmídeo disponível comercialmentemestre montagem reagente mistura e incubando a 50 ° C durante 1 h.
NOTA: Consulte o protocolo do fabricante para os volumes relativos de cada componente. Este método de montagem é baseada na técnica originalmente descrita por Gibson et ai. 10. - (Opcional) Tag gene TCR para marcar as células transduzidas com a forma truncada do receptor do factor de crescimento do nervo humano (ΔNGFR, aminoácidos 1-277) 11 separados por local de clivagem de furina, ligante serina-glicina, e 2A sequências 12,13. sequências de codificação de conceber iniciadores que se sobrepõem as extremidades do fragmento e montar plasmídeo como descrito nas etapas 1,3-1,5.
NOTA: Estas sequências podem ser encontradas nas referências 11-13. - Transformar E. quimicamente competente coli com o plasmídeo montados seguindo o protocolo do fabricante 14. Semente bactérias transformadas sobre placas de agar (20 mg / ml de caldo lisogenia (LB), 15 mg / ml de agar, e 1 ug / ml de ampicilina) e incubar a 37 ° C durante 18 h.
- A cultura de uma colónia única bactéria em 50 ml de meio LB (20 mg / ml de LB e 1 ug / ml de ampicilina) durante 16 horas numa incubadora com agitação a 37 ° C e 200 ciclos por minuto.
- Purifica-se os plasmídeos utilizando estojos comercialmente disponíveis Midiprep seguindo o protocolo do fabricante. Dilui-se o plasmídeo a concentração de cerca de 1 ug / uL.
NOTA: O protocolo de purificação de plasmídeo baseia-se no método de extracção alcalina 15.
Linha celular de empacotamento estável 2. Geração
NOTA: Tanto as células 293GPG e PG13 são aderentes. Células de cultura de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 50 ug / ml de gentamicina. 293GPG células de cultura com 1 ug / ml de tetraciclina antes da transfecção. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 entre todos os passos.
- 293GPG transfectar células de empacotamento 16 em cultura em balão T75 com o vector que codifica hemichain obtido na etapa 1.9, USIng reagente de transfecção disponíveis comercialmente seguindo o protocolo do fabricante 1 7. NOTA: As células transfectar 293GPG a 50-60% de confluência.
- médio aspirado para 293GPG células e adicionar 10 ml de fresco DMEM meio 1 dia pós transfecção.
- Colheita transitoriamente produzidos vírus a partir de células transfectadas 293GPG 2 dias após o passo 2.2 pela transferência de meio de cultura a seringa e que passa através do filtro de 0,45 um.
NOTA: O vírus pode ser utilizada imediatamente ou armazenada a -80 ° C para uso futuro. - Culturas 1 x 10 5 células em PG13 frasco T25. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Após um dia, meio de cultura aspirado e adicionar 1,5 ml de vírus 293GPG derivado a partir do passo 2.3 e 1,5 ml de meio DMEM, juntamente com 8 ug / ml de polibreno.
- Mudar a forma como descrito no passo 2.4, uma vez por dia durante 4 dias, para estabelecer que produzem retrovírus estável linha celular de empacotamento PG13 codificando o hemichain TCR de interesse.
- Aspirar médio e substituircom meio DMEM fresco para linhas celulares PG13 24 horas após a última infecção para posterior cultura.
NOTA: congelar ou sub-cultura de células por destacando com solução de tripsina-EDTA 0,05%. - Para produzir vírus de linhas celulares transduzidas PG13, a cultura 2 x 10 6 em células T75 frasco com 10 ml de meio DMEM, e vírus da colheita, tal como descrito na etapa 2.3 três dias após a sementeira das células.
NOTA: Vírus é melhor usado imediatamente, mas pode ser armazenado a -80 ° C durante até dois meses.
3. A activação e Transdução de células T humanas
NOTA: As amostras humanas são obtidas e utilizadas de acordo com os protocolos aprovados da comissão de ética institucionais. células humanas primárias em cultura de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio suplementado com 10% de soro humano em vez de FCS e 50 ug / ml de gentamicina. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 entre todos os passos.
- Isolar células periféricas humanas mononucleares do sangue (PBMC) por densidadeseparação por gradiente seguindo o protocolo do fabricante 18.
- Activar as células T para induzir a proliferação necessário para a infecção retroviral. Cultura de 2 x 10 7 PBMC frescas ou descongeladas por poço em placas de 6 poços, em 5 ml de meio RPMI com 100 UI / ml de recombinante humano IL-2 (rhIL-2) e 50 ng / ml de anticorpo monoclonal anti-CD3 (OKT3 clone).
- Três dias após a estimulação, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 g durante 4 min. Elimine o sobrenadante e sementes de 0,5-1 x 10 6 células T por poço em placas de 24 poços ressuspensas em 1 ml de vírus PG13 do passo 2.7, e de 1 ml de meio RPMI suplementado com 200 UI / ml de rhIL-2. Centrifugar a placa 1000 xg e 32 ° C durante 1 h.
- Após 24 horas, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 g durante 4 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de vírus PG13 do passo 2.7, e de 1 ml de meio RPMI suplementado com 200 UI / ml de rhIL-2. Repita este passo para um total de 6 Infectíons.
NOTA: Número de infecções deve ser optimizada, dependendo título do vírus produzido pela linha celular de empacotamento. Se necessário, as células T por remoção de passagem de 20-30% das células de cada dia para prevenir o crescimento excessivo. - 24 h após a última infecção, recolher as células T por pipetagem e centrifugar a 350 xg durante 4 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI com 100 UI / ml de rhIL-2 para posterior cultura.
- 2-3 dias após a etapa 3.5, as células T com mancha multímero de HLA, a 4 ° C durante 30 min, em seguida, CD3 anti-humano e anticorpos monoclonais do co-receptor (mAb) a 4 ° C durante 15 min. Analisar por citometria de fluxo. Use multímero irrelevante e / ou células não transduzidas como controlos negativos (Figura 1 - 3) 19.
- Se o hemichain centric introduzido é uma cadeia TCRα, analisar o uso Vp dos de novo multimero células positivas utilizando o painel de anticorpos específicos de Vp comercialmente disponível por citometria de fluxo 20.
4. Clonagem De Novo TCR Counter-hemichains
- Ordenar o novo população positiva de multimero no passo 3,6 por separação de células assistida por fluxo.
- Isolar o ARN a partir de células T classificados usando o guanidínio ácido tiocianato-fenol-clorofórmio método de extracção de 2 21,2.
NOTA: o RNA pode ser armazenado a -80 ° C, mas devem ser utilizadas para gerar ADNc tão rapidamente quanto possível. - Sintetizar biblioteca de ADNc a partir de ARN extraído utilizando kits de transcriptase reversa-PCR disponíveis comercialmente seguindo o protocolo do fabricante 23,24.
- Se a clonagem TCRβ contra-correntes, projetar gene Vp e região constante primers específicos TCRβ, conforme determinado na etapa 3.7, e clonar full-length TCRβ genes como descrito nos passos 1,3-1,9. Veja o passo 4.5 se contra-corrente é TCRα, caso contrário, continue para o passo 5.1.
- Comercialmente os anticorpos específicos-Va disponíveis estão limitados, assim, o uso de genes Va não podeser determinada por citometria de fluxo. Clone TCRα contra-correntes através de amplificação 5'-rápida de extremidades de cDNA (RACE) 25, utilizando comercialmente disponível 5 kits RACE «6.
- Sintetizar 5 'RACE de cDNA compatível partir de RNA extraído no passo 4.2, seguindo o protocolo do fabricante.
- Execute 1º PCR rodada, conforme descrito na Tabela 2.
- Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1100 pb, tal como descrito na etapa 1.2.
- Realizar 2 ND ciclo de PCR como descrito na Tabela 3, utilizando-se um produto de PCR como molde redondo r.
NOTA: As sequências dos iniciadores mostrados sob Tabela 3 foram desenhados para clonagem EcoRI e NotI digerido vector pMX. - Efectuar a electroforese do produto de PCR e eluem banda de aproximadamente 1000 pb, tal como descrito na etapa 1.2.
- clonar genes TCRα em EcoRI e Notl vector digerido pMX e puriplasmídeos fy como descrito nos passos 1,5-1,9.
Clones de TCR antígeno-específica 5. Reconstituting Novel
NOTA: Cultura de Jurkat 76 células e linhas celulares subsequentes em meio RPMI suplementado com FCS a 10% e 50 ug / ml de gentamicina. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 entre todos os passos.
- Transduzir células Jurkat 76 26 (ou equivalente TCR - / - linha de células T humana) com hemichain TCR centrada utilizando vírus 293GPG produzido no passo 2.3. Para Jurkat 76, semente de 5 x 10 4 culas por po em placa de 24 cavidades com 1 ml de vírus e de 1 ml de meio RPMI. Centrifugar a placa 1000 xg e 32 ° C durante 1 h.
- 24 h após a infecção, recolhe hemichain Jurkat transduzidas 76 células por pipetagem e centrifugar a 350 xg durante 4 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender em meio RPMI fresco para posterior cultura.
- Purificar células transduzidas se o hemichain é molecularmente marcado 2-3 dias após o passo 5.2, por coloraçãoing com fluoróforo conjugado anti NGFR-mAb seguido por assistida por fluxo ou célula magnética assistida classificação (opcional) 27.
- Seguindo os passos 2.1 a 2.3, produzem vírus 293GPG que codifica uma cadeia contador de TCR clonado a partir de passos 4.4 ou 4.5.
- Para reconstituir integralmente a TCR, transdução de linha de células T expressando estavelmente o hemichain TCR centric gerado nas etapas 5,1-5,3 utilize o vírus a partir do passo 5.4. Realizar transdução como descrito nos passos 5,1-5,2.
- Purificar CD3 + transfectantes utilizando anti-CD3 separação de células magnética assistida seguindo o protocolo do fabricante, 2-3 dias após o passo 5.5 27.
- Para validar a especificidade do antigénio, manchar os transfectantes que expressam TCR clonotípicas compostos da hemichain TCR centrada emparelhado com vários contra-correntes, com os mAbs co-receptor de anti-CD3 e / ou, e multimero de HLA, 3-5 dias após a purificação CD3. Analise as células por citometria de fluxo (Figura 4-5) 19.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Sem o conhecimento prévio de que hemichain cadeia é centrada, a cadeia TCRα e TCRβ deve ser clonadas separadamente e transduzidos para células T de sangue periférico, o que foi feito no caso do HLA-A24 / WT1 reactivo TAK1 TCR (Figura 1). Transdução de TAK1β produziram uma frequência notavelmente mais elevada de células T específicas de antigénio. Por outro lado, a transdução de um hemichain não centrada não produziria de novo as células T positivas multímero, co...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O primeiro requisito para a aplicação bem sucedida deste método é alcançar a eficiência de transdução suficiente de células T primárias com o hemichain de interesse. Na nossa experiência, a combinação de PG13 utilizando como linha celular de empacotamento e pMX como resultado o vector retroviral na expressão estável e eficiente do gene introduzido em células T humanas primárias. células de empacotamento PG13 pode ser clonado de uma única célula para seleccionar para células de empacotamento de título elevado para melhor...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
A University Health Network registrou uma patente relacionada a essa metodologia, na qual N.H., M.N. e T.O. são nomeados como inventores. Os demais autores não têm conflitos de interesse financeiros.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela concessão R01 CA148673 (NH) do NIH; o Prêmio de Investigador Clínico IA-039 (NH) do Instituto de Pesquisa do Câncer de Ontário; Subsídio de Catalisador BioCanRX (NH); A Fundação do Câncer Princesa Margaret (MOB, NH); Bolsa de Pós-Graduação (TG) do Canadian Institutes of Health Research Canada; Bolsa de Pós-Graduação (TG) do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá; Província de Ontário (TG, MA); e Prêmio Guglietti Fellowship (TO). Os monômeros HLA e CD1d foram gentilmente fornecidos pela instalação central de tetrâmeros do NIH.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% de tripsina-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG células | geradas por Ory et al. (ref 8) | ||
| Ágar | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose | Wisent Bioproducts | 800-015-CG | |
| Sal de ampicilina sódica | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| Clorofórmio | BioShop | CCL402 | |
| Desoxinucleotídeo (dNTP) Solução Mix | New England Biolabs | N0447L | |
| DMEM, glicose alta, piruvato | Technologies | 11995065 | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| EZ-10 Kit de Extração de Gel DNA de Coluna de Rotação | BS353 | ||
| Soro Fetal Bovino | Life Technologies | 12483020 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Filtro | Corning | 431220 | Membrana SFCA de poro de 0,45 mm Membrana |
| anti-CD271 humana conjugada com FITC (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | clone ME20.4 |
| Clone anti-humano conjugado com FITC CD3 mAb | Biolegend | 300440 | clone UCHT1 |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750078 | |
| Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2611L | usado para montagem de DNA de várias peças |
| Pentâmero HLA-A2 | Proimmune | depende do peptídeo antigênico | O multímero HLA-A2/MART1 usado aqui foi comprado de |
| monômeros HLA/CD1d | NIH Tetramer Core Facility | multimerizar monômeros de acordo com o protocolo fornecido pela instalação central de tetrâmero do NIH | |
| Soro AB humano | Valley Biomedical | HP1022 | |
| microesferas CD3 humanas | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTest Beta Mark TCR V beta Kit de repertório | Beckman Coulter | IM3497 | |
| Jurkat 76 células | Gerado por Heemskerk et al. (ref 10) | ||
| LB Caldo | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS coluna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alfa Competente E. coli | New England Biolabs | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | usado para digestão EcoRI e NotI |
| New England Biolabs | R0189S | ||
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | usado para purificação de plasmídeo |
| PC5 conjugado anti-humano CD8 mAb | Beckman Coulter | B21205 | clone B9.11 |
| Células PG13 | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF Buffer Pack | New England Biolabs | B0518S | |
| Phusion DNA polimerase de alta fidelidade | New England Biolabs | M0530L | |
| pMX vetor retroviral | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| Proleucina (interleucina-2 humana recombinante) | Novartis | by Rx apenas | produto equivalente pode ser adquirido da Sigma-Aldrich |
| Anticorpo anti-CD3 humano purificado | Biolegend | 317301 | clone OKT3, usado para estimulação de células T |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | usado para multimerizar monômeros da instalação central de tetrâmero do NIH |
| SMARTer RACE 5'/3' Kit | Clontech | 634858 | |
| Água estéril | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III Sistema de Síntese de Fita Inicial | Invitrogen | 18080051 | para síntese de cDNA |
| Seringa | BD | 301604 | 10 ml, ponta deslizante |
| Cloridrato de tetraciclina | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | usado para transfectar células 293GPG |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
Referências
- Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
- Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097(2013).
- Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
- Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
- Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235(2015).
- Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101(2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556(2011).
- Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253(2007).
- Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
- Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
- Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
- Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673(2011).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848(2011).
- Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34(2011).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470(2009).
- Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
- Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
- Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
- Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
- Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
- Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
- Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
- Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
