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Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

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DOI:

10.3791/54698

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4 de novembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

Neste artigo

Resumo

Muitos sistemas experimentais foram utilizados para compreender os mecanismos de regulação do desenvolvimento e função de células T numa resposta imunitária. Aqui uma abordagem genética utilizando transdução retroviral é descrito, que é económico, eficiente tempo, e, o mais importante, altamente informativos na identificação de vias reguladoras.

Resumo

O desenvolvimento e a função das células T auxiliares devem ser rigidamente regulados para induzir uma resposta imune apropriada que elimine patógenos específicos, mas evite a autoimunidade. Muitas abordagens envolvendo diferentes organismos modelo têm sido utilizadas para entender os mecanismos que controlam o desenvolvimento e a função das células T auxiliares. No entanto, estudos usando modelos de camundongos provaram ser altamente informativos devido à disponibilidade de sistemas genéticos, celulares e bioquímicos. Uma abordagem genética em camundongos usada por muitos laboratórios envolve a transdução retroviral de células T auxiliares primárias. Esta é uma abordagem poderosa devido à sua relativa facilidade, tornando-a acessível a quase todos os laboratórios com habilidades básicas em biologia molecular e imunologia. Portanto, vários genes em formas selvagens ou mutantes podem ser prontamente testados quanto à função em células T auxiliares para entender sua importância e mecanismos de ação. Otimizamos essa abordagem e descrevemos aqui os protocolos para produção de retrovírus de alto título, isolamento de células T auxiliares murinas primárias e sua transdução por retrovírus e diferenciação para os diferentes subconjuntos auxiliares. Finalmente, o uso dessa abordagem é descrito na descoberta de mecanismos utilizados por microRNAs (miRNAs) para regular as vias que controlam o desenvolvimento e a função das células T auxiliares.

Introdução

A resposta imune deve ser altamente regulada para eliminar infecções, mas evitar ataques ao auto-tecido que levam à autoimunidade. As células T auxiliares desempenham um papel essencial na regulação da resposta imune, e um grande esforço tem sido realizado para entender seu desenvolvimento e função (ilustrado em várias revisões recentes 1-3). No entanto, muitas questões permanecem e muitas abordagens têm sido utilizadas para estudar os mecanismos que controlam o desenvolvimento e a função das células T auxiliares. Estes variaram desde o uso de sistemas de cultura de células in vitro até animais inteiros. Os sistemas de cultura de células, especialmente aqueles que usam linhagens celulares, oferecem o benefício da facilidade de uso e a capacidade de gerar grande quantidade de material para fazer análises bioquímicas sofisticadas. No entanto, eles sofrem de sua capacidade limitada de reproduzir as condições reais que ocorrem em uma resposta imune. Em contraste, experimentos com animais inteiros oferecem o benefício da relevância, mas podem sofrer de dificuldades de manipulação e capacidade de realizar controles precisos, além de seus grandes custos e implicações éticas. No entanto, a grande maioria dos estudos com células T auxiliares hoje ainda requer o uso de experimentos com animais inteiros envolvendo células T primárias devido à incapacidade das linhagens celulares de duplicar as etapas exatas que ocorrem em todo o animal. Portanto, é essencial utilizar abordagens econômicas que sejam altamente informativas.

A genética é uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento e a função das células T auxiliares, mas os métodos tradicionais que envolvem nocautes de genes ou transgenes são demorados e caros, por isso muitas vezes estão fora do alcance de pequenos laboratórios. No entanto, a transdução retroviral oferece uma abordagem genética poderosa, rápida e econômica para estudar os mecanismos de produtos gênicos específicos. Portanto, é comumente usado em artigos que estudam o desenvolvimento e a função das células T auxiliares.

Otimizamos um procedimento para transdução retroviral de células T auxiliares. Ele utiliza o vetor de expressão retroviral pMIG (vírus de células-tronco murinas-sítio de entrada ribossômico interno-proteína fluorescente verde), no qual o gene de interesse pode ser clonado e, assim, expresso a partir da repetição terminal longa (LTR) do retrovírus 4. Além disso, a jusante do gene inserido de interesse está uma sequência de entrada de ribossomo interno (IRES) seguida pelo gene da proteína fluorescente verde (GFP) para que as células transduzidas possam ser facilmente seguidas por sua expressão de GFP. O vetor foi originalmente derivado dos vetores do vírus de células-tronco murinas (MSCV), que contêm mutações nos locais de ligação repressora nos LTRs, tornando-os resistentes ao silenciamento e, portanto, dando alta expressão em muitos tipos de células, incluindo células T auxiliares 5,6. A produção de retrovírus de alto título requer um protocolo simples de transfecção transitória de células 293T do rim embrionário humano (HEK) com o vetor MIG e um vetor de vírus auxiliar que expressa os genes retrovirais GAG, Pol e Env. Para isso, o vetor 7 do vírus auxiliar pCL-Eco funciona bem na produção de retrovírus incompetentes de replicação de alto título.

Aqui esses protocolos para produção retroviral e transdução de células T murinas primárias são descritos, além de alguns de nossos resultados usando essa abordagem para estudar a regulação de miRNAs da expressão gênica que controla a diferenciação de células T auxiliares. Os miRNAs são pequenos RNAs de aproximadamente 22 nucleotídeos de comprimento que regulam pós-transcricionalmente a expressão gênica, visando sequências homólogas em proteínas que codificam RNAs mensageiros e suprimem a tradução e induzem instabilidade da mensagem 8,9. Os miRNAs desempenham papéis críticos na regulação gênica do desenvolvimento. Eles são essenciais nos estágios iniciais de desenvolvimento, pois os embriões que não conseguem produzir miRNAs morrem em um estágio muito precoce 10. Além disso, os miRNAs são importantes mais tarde no desenvolvimento de muitos tecidos. Acredita-se que eles funcionem ajustando a expressão de genes necessários para programas de desenvolvimento 1. Nas células T auxiliares, os miRNAs desempenham múltiplos papéis e são necessários para o desenvolvimento de células T reguladoras (Treg) 11-14. Usamos a transdução retroviral como meio de dissecar os mecanismos de regulação do miRNA da diferenciação de Treg 15. Por meio de tais estudos, importantes miRNAs individuais foram determinados por superexpressão mediada por retrovírus. Posteriormente, genes relevantes regulados por esses miRNAs foram identificados a fim de entender as vias moleculares reguladas por miRNAs na diferenciação de células T auxiliares.

Protocolo

Todos os trabalhos em ratos realizadas nestes protocolos foi realizada de acordo com os Procedimentos de Animais científicos Act, Reino Unido sob o animal Projeto Licença 70/6965.

1. Retroviral de Produção

Antes de prosseguir obter todas as autorizações necessárias para a produção de organismos geneticamente modificados, e da utilização de retrovírus em células de mamíferos.

  1. Crescimento de Células HEK 293T
    1. Cultivar células 293T HEK em 10 cm placas de cultura de tecidos em meio de HEK 293T (de Dulbecco modificado por Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades / ml de penicilina de 0,1 mg / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina) . Para a passagem de células em geral, dividir células 1:10 quando atingem confluência removendo médio e pipetar as células fora da placa com meio HEK 293T fresco.
      NOTA: As células devem chegar a confluência em 2-3 dias. células 293T HEK anexar frouxamente à placa de modo tripsinização não é necessária.
    2. 24 h antes da transfecção, dividir um conflueNT placa de células de 1:10 a uma placa de 10 cm (uma placa por transfecção), de modo que no dia seguinte as células são ~ 50% confluentes.
  2. Transfecção de Fosfato de Cálcio Precipitação
    1. Cerca de 1 h antes da transfecção, remover o meio a partir de células e cuidadosamente adicionar 9 ml de meio de HEK 293T fresco para evitar que as células destacando a partir da placa.
    2. Prepare 2x salina tamponada com HEPES (HBS 2x) e uma nova solução M de CaCl2 2,5, tal como descrito na Tabela 1. Descongelar estoques de ADN. Para as transfecções de utilização mais eficiente de ADN do plasmídeo de qualidade preparatória.
    3. Num fundo redondo de 6 ml ou tubo de 15 ml adicionam-se 5 ug de ADN retroviral (PMIG) 4, 5 ug de ADN de vírus ajudante (PCL-Eco) 7, e H 2 O para 420 ul. Adicionar 80 ul de 2,5 M de CaCl2, elevando o volume final para 500 mL.
      Nota: Este, juntamente com o próximo passo (adição de 2x HBS) pode ser feito em um banco normal, desde que ster geralile técnica é usada.
    4. Adiciona-se lentamente 500 ul de 2x HBS gota a gota à mistura de DNA acima, enquanto suavemente vórtice para que a solução é continuamente misturado e o CaPO4 precipita em cristais mesmo porte.
    5. Transferir para um capuz de cultura de tecidos e, lentamente, adicionar a mistura de ADN com CaPO4 (1 ml) gota a gota para os 9 ml de meio de cobertura das células enquanto constantemente e agitação suave da placa. Mais uma vez, tome cuidado para não retirar as células a partir da placa. Colocar as células de volta na incubadora.
      NOTA: Nesta altura o precipitado com CaPO4 serão facilmente visíveis ao microscópio como pequenos cristais sobre o tamanho de bactérias. Estes são facilmente visto depois de 30-60 min, quando os cristais de ter tido a chance de resolver a parte inferior da placa.
  3. Coleção de vírus em cultura de sobrenadantes.
    1. O dia seguinte (12-24 em qualquer lugar hr após a transfecção) remover o meio e alimentar as células com 10 mlde meio HEK 293T fresco, mais uma vez tomando cuidado para não desalojar as células a partir da placa.
      NOTA: Este dilui para substâncias inibidoras de linfócitos que as células HEK 293T segregam para o meio durante a transfecção.
    2. Na noite do segundo dia (~ 24 horas após a transfecção) alimentar as células com 3,5 ml de meio HEK 293T fresco. Ter cuidado para que a placa é colocada exactamente nível na incubadora de modo que um lado não é deixado secar.
    3. Recolha meio de ~ 12 horas mais tarde (armazenar a 4 ° C) e alimentar com 3,5 ml de meio de HEK 293T fresco. Repita recolha mais 2 vezes em intervalos de cerca de 12 h de modo a que cerca de 10 ml de meio é colhido. Esta é a reserva de vírus.
    4. Girar para fora quaisquer células HEK 293T residuais e detritos celulares por centrifugação a 600 xg durante 5 min. Alternativamente, filtrar utilizando um, de baixa ligação a proteínas, filtro de seringa de 0,45 um. vírus Armazenar a 4 ° C, e para obter os melhores títulos, usar dentro de um dia ou dois, como o título irá diminuir lentamente a 4 ° C. Não freeze, como isto diminui significativamente a título.

2. Isolamento de células primárias Naïve T CD4 +

  1. Isolamento de leucócitos
    1. Euthanize ratos por deslocamento cervical, CO 2 asfixia, ou outro protocolo humano adequado às regras de manuseio de animais da instituição.
    2. Dissecar ratos recém-sacrificados e remover o baço e linfa desejado nodos 15. Colocar os órgãos em poços de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços contendo meio R10 (meio RPMI com calor a 10% de FBS inactivado, 100 unidades / mL de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 2 mM de L-Glutamina, e 0,1% β-mercaptoetanol) . Use uma capa de cultura de células para dissecção de ratos e todas as manipulações posteriores para minimizar a possibilidade de contaminação em culturas.
      NOTA: Mantenha o meio R10 frio e executar todas as etapas de purificação a jusante, a 4 ° C.
    3. Coloque uma cultura de células de 70 um filtro de 5 um em0 tubo cónico ml contendo aproximadamente 5 ml de meio R10. Use um filtro para os baço e linfonodos de até três ratos.
    4. Adicionar baço e nódulos linfáticos para o filtro de células e macerar usando a extremidade de um êmbolo de seringa de 5 ml. Enxágüe com 1-2 ml de meio R10.
    5. Transferir as células para um tubo de 15 ml e perfazer o volume até 14 ml com R10. Centrifuga-se a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante, derramando-o com um movimento limpo para evitar perturbar o sedimento celular.
    6. Adicionar 2 mL de água fria (4 ° C) Tampão de lise de glóbulos vermelhos (Tabela 1) a cada tubo. Misturar suavemente durante 3,5 min, mantendo o tubo em gelo.
      NOTA: O tempo de lise de glóbulos vermelhos é fundamental para evitar a morte de linfócitos. Por conseguinte, o momento exacto de cada lote de tampão de lise de glóbulos vermelhos terão de ser optimizados.
    7. Adicionar ≈12-13 ml de meio R10. Imediatamente centrífuga e descartar sobrenadante como no passo 2.1.5. Execute as etapas de lavagem 2x mais inteligênciaR10 forma h para remover qualquer tampão de lise de glóbulos vermelhos residuais a partir das células e evitar a morte de linfócitos.
    8. Contagem de células num hemocitómetro diluição 1:20 em azul de tripano para determinar o rendimento de células viáveis. Espere aproximadamente 8-10 x 10 7 células por mouse.
  2. Isolamento de células T CD4 +, utilizando pérolas magnéticas Kit para remover CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC de classe II + e Ter-119 + células.
    1. Aliquota 8-10 x 10 7 células a partir do passo 2.1.8 por tubo de 15 ml e centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante com um movimento limpo para evitar perturbar o sedimento celular. Ressuspender as células em cada tubo em 100? L de FBS inactivado pelo calor, em seguida, adicionar 100 uL de mistura de anticorpo a partir do kit. Incubar durante 30 min a 4 ° C com mistura suave em um rolo.
    2. Enquanto as células acima são a incubação, preparar os grânulos.
      1. Grânulos Ressuspender no frasco por rotação durante> 30 segundos, em seguida, transferir 1 ml de pérolas por 8-10 x 10 7 células preparadas a um tubo de 15 ml. Adicionar 2 ml de meio R10 por ml de esferas e misturar suavemente.
      2. Colocar o tubo no íman durante 1 min, em seguida, desprezar o sobrenadante. Retire o tubo do ímã e voltar a suspender os grânulos em 4 ml de meio R10. Esta quantidade de grânulos é suficiente para dois ciclos de incubação.
    3. Lavam-se as células no final da incubação do anticorpo (Passo 2.2.1) por adição de 10 ml de meio R10 por tubo. Misturar suavemente bem com agitação das células de tubos e centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante com um movimento limpo para evitar perturbar o sedimento celular. Ressuspender as células em 1 ml de meio R10.
    4. Adicionar 2 ml de as esferas lavadas do passo 2.2.2.2 (½ a quantidade preparado para cada tubo) a cada tubo de células tratados com anticorpo e incubar durante 30 min a 4 ° C com mistura suave em um Roller.
    5. Ressuspender a mistura de células-talão com cuidado pipetando 5 vezes com uma pipeta contendo uma abertura de ponta estreita. Evitar a formação de espuma. Colocar o tubo no íman grânulos durante 2 minutos, em seguida, transferir o sobrenadante contendo as células seleccionadas negativamente para um novo tubo. Manter essas células, uma vez que são a população de células CD4 +.
    6. Repetir selecção negativa mais uma vez. Girar as células a partir do passo 2.2.5 a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante como no passo 2.2.3 e ressuspender em 1 ml de meio R10. Siga os passos 2.2.4 e 2.2.5 novamente. Após a selecção final do grânulo magnético, contar as células para determinar a recuperação (rendimentos típicos são de 15-20 x 10 6 células por 10 8 leucócitos).
  3. Isolamento de células Naïve CD4 + T (CD25 - e CD62L alta) Usando Colunas celular de separação
    1. Centrifugar as células T CD4 + a 600 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender em 150-200 ul deMeio de R10 por 10 8 células. Adicionar 2 mL de estoque biotinilado anticorpo CD25 monoclonal (clone 7D4). Incubar durante 30 min a 4 ° C com mistura suave em um rolo.
    2. Lave as células por adição de 10 ml de tampão da coluna de separação de células (Tabela 1). Centrifuga-se a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover tanto sobrenadante quanto possível e estimar o volume de tampão / células restantes. Ressuspender a um volume final de cerca de 90 ul por 10 7 células.
    3. Adicionar 20 ul de contas de estreptavidina por 10 7 células e misture com movimentos suaves. Incubar durante 15 min a 4 ° C.
    4. Enquanto as células são a incubação, preparar as colunas de separação de células média (MS) para a abordagem manual. Cada coluna MS retém 10 7 células, e uma vez que CD25 + tipicamente representa cerca de 10% do total de células CD4 + células, utilizar uma coluna de 8 por 10 células T CD4 +. Adicionar 500 ul de tampão da coluna de separação de células para a colunae deixe fluir. Repita mais 2 vezes.
    5. No final da incubação de células / grânulo, lavar as células por adição de 10 ml de tampão da coluna de separação de células e centrifugação a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 500 ul de tampão da coluna de separação de células por 10 8 células, mas ainda utilizar 500 ul Se há menos células.
    6. Aplicar 500 ul de suspensão de células / grânulo para a coluna e recolher o fluxo através. Passar esta sobre a coluna 1 mais tempo e recolher o fluxo através de uma vez. Lavar a coluna 3 vezes com 500 ul de tampão da coluna de separação de células, a adição de cada fluxo através destas lavagens para as células colhidas. Estes são o CD25 - células. Contagem de células para determinar o rendimento.
    7. Se Tregs (CD25 +) são desejado, isolar como se segue.
      1. Remova a coluna do separador e mantê-lo acima de um tubo de cuidar universal aberta para manter a esterilidade. pipeta rapidamente 500 mL de tampão de separação de células para o colUMN e firmemente expulsar a fracção positiva, utilizando o êmbolo fornecidas com a coluna.
      2. Repita o procedimento de lavagem mais 2 vezes. Passe a fração positiva através de uma coluna fresca de separação de células MS e descartar este flow-through. Firmemente expulsar as células positivas de três vezes, tal como antes e centrifugação as células a 600 xg durante 5 min a 4 ° C as células ressuspender em 1 ml de meio R10 e contagem para determinar o rendimento.
    8. Para obter CD25 - células T de alta CD62L, centrifugar a CD25 - células T isoladas acima no passo 2.3.6 a 600 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender em 150-200 ul de meio de R10 por 10 7 células. Adicionam-se 5 uL de anticorpo monoclonal de CD62L estoque biotinilado (clone MEL-14) e incubar durante 30 min a 4 ° C com mistura suave num rolo como antes.
    9. Execute lavagem, estreptavidina talão de ligação, e preparação coluna de separação de células, como descrito para protocolo de isolamento Treg (2.3.7). Este uso do tempoa coluna de separação de células grandes (LS), que tem uma capacidade de 10 8 células.
      1. Como as células T alta CD62L normalmente representam cerca de 60-70% de CD25 - células, use 1 LS coluna de separação de células por 10 8 células. Adicione a mistura de células / talão para LS coluna de separação de células, como descrito na etapa 2.3.6 - desta vez de descartar o fluxo final através de e coluna lavagens. Recolher as células T alta CD62L, tal como descrito no passo 2.3.7 para a recolha de células CD25 +.
      2. células centrifugar a 600 xg por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 1 ml de R10 e contam para determinar o rendimento. Diluir a 0,75-1 X10 6 células por ml em meio R10.
  4. Analisar Pureza de células, classificando celular Fluorescent-ativado (FACS).
    1. estratégia de coloração FACS
      1. Para as células pré e pós todas as fases de isolamento, mancha com CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (células helper e T citotóxicos), e MHCII-PE (MHC de classe II que expressam as células).
      2. Para as células pré e pós isolamento CD25, mancha com CD4-FITC e CD25-PE (Tregs em relação a outras células T helper).
      3. Para as células pré e mancha isolamento pós CD62L com CD4-FITC, CD62L-PE e CD44-APC (naïve contra células de memória e efetoras T helper).
    2. Para cada local de análise 10 5 células em um poço de uma placa de fundo em U de 96 cavidades. Centrifuga-se a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Deitar fora o meio e lavar as células uma vez com 200 ul DPBS. Centrífuga como acima e despeje DPBS.
    3. Adicionar 50 ul de DPBS por poço e 0,5 ul de cada anticorpo (tal como indicado em 2.4.1) e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos no escuro para evitar o branqueamento de marcador fluorescente.
    4. Lave as células 2x com DPBS como em 2.4.2 e analisar imediatamente em um citômetro de fluxo, utilizando protocolos e diretrizes específicas para o instrumento na mão.
      NOTA: Após o passo final de isolamento de uma boa preparação, 90-95% das células iráser CD4 + CD25 - células T alta CD62L.

3. Transdução retroviral de células CD4 + T ativadas e sua diferenciação em específicas T helper Subconjuntos

  1. Transdução retroviral
    NOTA: A integração retroviral e de expressão de genes requer a divisão celular. Portanto, as células T activadas devem ser S / N.
    1. Enquanto isolar as células T ingénuas, revestimento de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades com anticorpos anti-CD28 diluídas em DPBS anti-CD3 e. Juntar 250 ul por poço. Use anti anti-CD3 a 1 ug / ml. Use anti-CD28 a 2 ug / ml se as células em última análise, ser diferenciadas em condições Th0, Th1, Th2 e iTregs. Use anti-CD28 a 10 ug / ml para as condições de Th9 e Th17. Incubar ~ 2 h a 37 ° C num incubador de cultura de tecido.
    2. Imediatamente antes da cultura das células, remover a solução de anticorpos e lavar a placa com ~ 250 mL de DPBS por poço para remover unbouanticorpo nd. Tenha cuidado para não deixar que a placa secar tão processar um máximo de 6 poços de cada vez. Remover DPBS lavar e adicionar 1 ml de células T CD4 + naive em meio R10 em 0,75-1 x 10 6 culas por ml. Ativar as células O / N (14-16 h).
    3. No dia seguinte, as células de centrífuga na placa a 900 xg durante 5 min a 30 ° C para fixar as células ao fundo dos poços.
    4. Recolher e guardar o meio tomando cuidado para não deslocar as células, e substituir com sobrenadante 1 ml da cultura de vírus preparada pelo protocolo de produção de vírus. Não deixe que as células secar tão processar um máximo de 4 poços de cada vez.
      1. A cada cavidade adicionar 1 ml de 8 mg / ml de polibreno e 10 ul de HEPES 1M, pH 7,5 para auxiliar a absorção do vírus e prevenir alcalinização significativa no ambiente de CO 2 durante a após a centrifugação. Centrifugar as células em placas a 900 xg durante 90 min a 30 ° C.
  2. Diferenciação de células em Specific Subconjuntos
    1. Cuidadosamente remover o sobrenadante de cultura de vírus e substitua com 1 ml do meio de cima recolhidos no passo 3.1.4, uma vez que contém IL-2 e de outros factores de crescimento de células T. Adicionar reagentes indicados na Tabela 2 e células de cultura durante 3-4 dias para diferenciar células em subconjuntos específicos.
  3. A análise das células
    1. Para a coloração intracelular de citocinas, o tratamento de células com 1 ug / ml cada de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina durante 4 h. Durante a última estimulação de 2 h, adicionar 1 ug / ml de brefeldina A.
    2. Ressuspender as células a partir do fundo de cada poço, pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transferir aproximadamente 10 5 células para uma placa de 96 poços fundo em U (geralmente 100 uL a partir de 1 ml de cultura de células Th) para fixação e coloração.
    3. Para a coloração de GFP, fixar as células com 100 uL de paraformaldeído a 2% à temperatura ambiente durante exactamente 5 min, como um tempo de incubação mais longo irá branquear a um GFPND interferir com coloração de Foxp3. Lave as células por adição de 100 ul de DPBS a cada poço e centrifugar a 600 xg a 22 ° C durante 5 min. Deitar fora o sobrenadante.
      Cuidado: O paraformaldeído é tóxico. Segurá-lo em um exaustor com a pele e proteção para os olhos.
    4. Fixar as células mais uma vez usando 100 ul de 1x tampão de fixação feita a partir do kit de coloração Foxp3 (1 volume de tampão de Fixação a 3 volumes de diluente). Incubam-se as células durante 45 min à TA ou, alternativamente, incubar a 4 ° C durante 16 horas.
    5. Após a fixação, permeabilizar as células por adição de 100 ul de tampão de permeabilização do mesmo kit. Incubar à temperatura ambiente durante 30-45 minutos e depois centrifugar a 600 xg a 22 ° C durante 5 min.
    6. Para a coloração do anticorpo, remover o tampão de fixação / permeabilização e adicionar 50 ul de tampão de permeabilização fresco. Adicionar o anticorpo necessária diluída em tampão de permeabilização em 0,5 ul por 50 ul de tampão por amostra. Incubar durante 30-45 minutos à temperatura ambiente no escuro para evitar o branqueamento da gripeetiqueta orescent.
    7. Adicionar tampão de permeabilização de 150 ul e centrifugar a 600 xg a 22 ° C durante 5 min. Descarte o tampão de permeabilização e adicionar 200 ul DPBS. Analisar em um citômetro de fluxo, utilizando protocolos e diretrizes específicas para o instrumento na mão.
      NOTA: Certifique-se de incluir controles adequados para a coloração de citocinas tais como coloração com anticorpos de controlo de isotipo, analisando células não activadas ou Th0 activadas, etc.

Resultados

O sucesso deste sistema experimental requer populações altamente pura de células T e preparações retrovirais de título elevado. Os resultados representativos são mostrados aqui como exemplos de experiências bem sucedidas. A Figura 1 mostra o grau de pureza típico das populações pré e pós-seleccionado, em cada fase do protocolo de isolamento de células auxiliares T ingénuas. Figura 2 e 3 ilustram a análise da produção de retrovírus, através da expressão de GFP nas células de HEK 293T transfectadas (Figura 2) e as células T transduzidas (Figura 3). Eficiências de transfecção das células HEK 293T pode variar significativamente com diferentes construções retrovirais, mas isso nem sempre se correlaciona com o nível de produção de retrovírus observados com o número de células GFP + T. Além disso, o número de células GFP + T podem variar dependendo das condições de polarização. Além disso, o MEAN nível de expressão de GFP e o gene inserido pode variar, dependendo do número de cópias de vírus integrado, o efeito do local de integração na transcrição, e mecanismos de regulação pós-transcricional que afectam a transcrição viral.

Finalmente, a Figura 4 mostra alguns resultados típicos que temos observado com a diferenciação das células T auxiliares quando o miARNs miR-15b / 16 são sobre-expressos. Estes resultados mostram um pouco da variabilidade que pode ocorrer dentro de um experimento indivíduo efeitos tão verdadeiro deve ser fundamentada pela análise estatística de múltiplas experiências de repetição usando diferentes preparações de células T auxiliares. Nestas experiências, as respostas de Th2 pode ser difícil observar na / 6 linha C57BL usado aqui, porque eles são propensos a respostas Th1. Do mesmo modo, IL-9 de coloração pode ser difícil de detectar acima do fundo. Portanto, é imperativo fazer controlos isotípicos e configurar uma compensação adequada para garantir ga corretating da expressão das citocinas. Nos nossos resultados verificou-se que o miR-15b / 16 aumenta a indução iTreg através da inibição da via de sinalização de mTOR através da repressão da expressão do Rictor componentes e mTOR 15. miR-15b / 16 pode, por vezes, influenciar Th0, Th1, Th17 e diferenciação em experiências individuais, mas não há nenhum efeito significativo, quando examinado em várias experiências repetidas. Em contraste miR-15b / 16 superexpressão não suprimir significativamente a diferenciação Th9 (ver referência 18).

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Figura 1. pureza típica de células T auxiliares em cada fase de isolamento. Citometria de fluxo representativas resultados dos antigénios indicados são mostrados desde a porta de células vivas designados na dispersão frontal (FSC) e os gráficos de dispersão lateral (SSC). Seleção negativa (A) pré e pós-CD4. perfis de expressão de CD4,CD8a e MHCII são mostrados. Estes ilustram o enriquecimento de células T auxiliares e a perda das células T citotóxicas e MHC da classe II que expressam as células. Uma boa purificação deve resultar em ~ 90% de células T CD4 +, nesta fase. (B) a seleção CD25. À esquerda são os perfis de CD4, CD8a e MHCII expressão, e à direita são a CD4 e expressão CD25 perfis pré e seleção post. Neste ponto,> 95% das células CD25 seleccionadas negativamente deve ser CD4 + CD25 -. (C) CD62L selecção. CD4, CD8a, e MHCII perfis de expressão estão apresentados à esquerda. À direita dos perfis de expressão de CD62L e CD44 são mostrados para células pré e pós-CD62L selecionados juntamente com CD4 e CD62L perfil de pós selecionadas células expressão. Após a seleção CD62L praticamente todas as células de memória (CD44 +) são removidos deixando uma população altamente enriquecido de células T helper ingênuos que contém 10-15% de células efetoras (CD62L baixo). Para todosperfis FACS, configurações equivalentes e balanças de um parâmetro específico foram mantidos por toda parte. Os números representam a percentagem de células dentro de uma população fechado. A ligeira diminuição no tamanho das células após a seleção inicial é presumivelmente devido ao estresse mecânico durante o protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Análise de células HEK 293T transfectadas com retrovírus. Expressão da GFP é mostrado em células HEK 293T que eram ou não transfectadas ou transfectadas e analisados após a colheita dos sobrenadantes de cultura viral. análise GFP foi feito em células vivas a partir do portão do FSC e enredo SSC no primeiro painel. Os números representam a percentagem de GFP + células dentro da região fechada. típico teficiências ransfection variar entre 30-90%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Análise de células T auxiliares retrovirais transduzidas. Expressão da GFP é mostrado em células T auxiliares retrovirais transduzidas após a diferenciação em Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, e as condições de polarização Treg para três dias. A análise foi fechado em células vivas e ativados indicados no painel FSC / SSC. eficiências de transdução pode variar entre 10-75%, dependendo da construção e as condições de polarização. Da mesma forma, a intensidade de fluorescência média de expressão GFP pode variar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Efeito de miR-15b / 16 superexpressão na diferenciação de células T helper em diferentes condições de polarização. Perfis de citocinas representativos são mostrados na GFP + população de células da Figura 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Tabela 1:. Os tampões utilizados nestes protocolos por favor, clique aqui para baixar esta tabela como uma planilha Excel.

Ajudantecondições de polarização de células T
Th0 anti-IL-4 5 ug / ml
anti-IFN-γ 5 ug / ml
Th1 recombinante-IL-12 20 ng / mL
anti-IL-4 5 ug / ml
Th2 IL-4 recombinante 40 ng / mL
anti-IFN-γ 5 ug / ml
Th9 TGF-β recombinante 2,5 ng / mL
IL-4 recombinante 40 ng / mL
anti-IFN-γ 10 ug / ml
Th17 TGF-β recombinante 2,5 ng / mL
IL-6 recombinante 50 ng / mL
anti-IFN-γ 5 ug / ml
anti-IL-4 5 ug / ml
anti-IL-2 5 ug / ml
Tregs TGF-β recombinante 2,5 ng / mL
IL-2 recombinante 5 ng / ml

Tabela 2: subconjunto de células condições de polarização T helper.

Discussão

Retroviral superexpressão de genes mediada é uma maneira poderosa para analisar a função das células T helper, como seu desenvolvimento e função é muitas vezes determinada pelo nível de reguladores chaves expressão. No entanto, a interpretação cuidadosa dos resultados é necessária porque os níveis de expressão significativamente superiores aos do gene endógeno pode introduzir muitos artefatos. Portanto, esta técnica deve ser combinada com outros para verificar a relevância da função. Por exemplo, a sobre-expressão deve ser complementada por uma expressão reduzida usando siRNAs ou nocaute de genes, se disponível. Com miRNAs, nós complementada experimentos superexpressão com os de bloqueio usando vírus que overexpressed miRNA artificial alvejando sites que atuaram como inibidores competitivos para um miRNA 15. células transduzidas retrovirais podem também ser utilizados em ensaios bioquímicos envolvendo ARN e análise de proteínas. No entanto, a principal limitação destas experiências é a eficiência de transdução resulting numa população mista de células transduzidas e não transduzidas. Portanto, estes ensaios irá provavelmente exigir triagem da GFP + população. Finalmente, em ensaios in vitro de diferenciação deverá ser combinado com experiências in vivo, e uma maneira que isso pode ser conseguido é por transferência adoptiva, as células T transduzidas em murganhos e após a sua diferenciação e o seu efeito sobre a resposta imune.

Uma das limitações principais do presente sistema é o tamanho do genoma de ARN que podem ser embalados na cápside retroviral. Em nossa experiência, o tamanho máximo de inserção para o sistema retroviral MIG que dá uma boa produção de vírus é 3-3,5 kb. Portanto, os genes maiores não podem ser analisados ​​com este sistema, uma vez que os títulos de vírus dar pobres. No entanto, a maioria dos genes são menores do que este tamanho de modo que este sistema é útil para uma grande variedade de estudos de genes.

Com a transdução retroviral, várias alternativas dentro destes Protocols têm sido utilizados. Muitos investigadores têm utilizado as linhas de células de empacotamento que expressam de forma estável os genes retrovirais (por exemplo de referência 16). No entanto, temos obtido os títulos mais elevados utilizando células HEK 293T padrão com co-transfecção do vírus auxiliar vector PCL-Eco. Isolamento de células auxiliares T ingénuos também pode ser alcançada através de separação de células, em vez do protocolo coluna de pérolas e a separação magnética de células, mas isto requer o acesso a um seleccionador de células, e os custos de tempo tipo são tipicamente mais elevado do que os reagentes de grânulo. Finalmente, existem variações sobre condições de ativação usados ​​para diferenciar células T helper para os diferentes subgrupos. Por exemplo, a estimulação de TCR de células para muito tempo antes da exposição a condições de indução Treg podem inibir a indução 16. Isto pode ser um problema porque a expressão retroviral requer a divisão celular induzida por estimulação das células. No entanto, descobrimos indução Treg eficiente usando este protocolo com O activ / Nção antes da transdução retroviral.

Dentro destes protocolos, a aplicação bem-sucedida requer vários fatores. preparações retrovírus elevado título precisa transfecção eficiente das células 293T HEK DNA tão alta qualidade e precisão preparado 2x HBS são importantes. Além disso, a densidade de células das células HEK 293T necessita de ser cerca de 50% no ponto de transfecção porque boa expressão do ADN transfectado requer que as células estão a crescer activamente, e este será inibida se as células são demasiado escasso ou densa. Células na densidade ideal durante a transfecção deve chegar a confluência em algum momento durante as etapas de coleta de vírus, mas eles vão continuar a produzir stocks de vírus de título elevado durante todo o tempo para a última coleção. A diferenciação eficiente de células T auxiliares exige uma boa qualidade célula para assegurar que as células são isoladas a pureza ilustrado na Figura 1. De igual modo, a qualidade das células é dependente da FR murganhosom que foram isolados. Para estes estudos, utilizou-se 6-8 semanas de idade C57BL / 6. ratos mais velhos podem ter células menos ingênuos, e outras linhagens podem diferir em sua diferenciação. Por exemplo, ratinhos BALB / c são mais propensas a respostas Th2 do que murganhos C57BL / 6 17, de modo tal como acima referido, C57BL / 6, as células T podem ser difíceis de induzir uma resposta de Th2. Além disso, nenhuma das condições de diferenciação pode variar um pouco, de laboratório para laboratório, e o efeito de sobre-expressão de genes só pode tornar-se aparente em condições sub-óptimas de modo concentrações de citocinas nas diversas condições de polarização pode precisar de ser ajustada. Por fim, os efeitos do gene sobre-expresso ou as condições de polarização na proliferação das células pode influenciar a eficiência de transdução de medição para que os efeitos do gene de interesse pode requerer optimização do tempo e da concentração dos reagentes de polarização. Optimizando todos estes fatores devem levar a resultados informativos com este sistema.

Divulgações

Os autores não têm interesse conflitante na publicação deste trabalho.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BBSRC) (BB/H018573/1) e uma bolsa da BD Biosciences.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RPMISigmaR8758
DMEMSigmaD5671
Solução de penicilina estreptomicinaSigmaP4333
L-glutaminaSigmaG7513
β-mercaptoetanolSigmaM3148
DPBSSigmaD8537
MIG vectorAddgene Plasmid 9094
vetor pCL-EcoAddgenePlasmid 12371
Filtro de célulasBD Falcon352350
Contas magnéticas kit de células CD4 de camundongo Invitrogen (Dynabeads)11415D
Streptavidin Beads Miltenyi Biotech130-048-102
Colunas de separação de célulasMiltenyi Biotech130-042-201
Colunas de separação de células LSMiltenyi Biotech130-042-401
CD25 Biotenilated MAb BD Biosciences85059clone 7D4
CD62L Biotenilated MAb BD Biosciences553149clone MEL-14
Polybrene (Hexadimethrine Brometo)Sigma107689
Anti-CD3eBiosciences16-0031-85clone 145-2C11 
Anti-CD28eBiosciences16-0281-85clone 37.51 
Anti-IL-4BD Biosciences559062clone 11B11
Anti-IFN-gamaBD Biosciences559065clone XMG1.2
Anti-IL-2BD Biosciences554425cloneJES6-5H4
IL-12 p70 recombinanteeBiosciences14-8121
IL-4 recombinanteBD Biosciences550067
TGF-beta recombinanteeBiosciences14-8342-62
IL-6 recombinanteeBiosciences14-8061
IL-2 recombinanteeBiosciences14-8021
PMA SigmaP8139
IonomicinaSigmaI0634
Brefeldin AeBiosciences00-4506
ParaformaldeídoSigma16005O paraformaldeído é tóxico, então use o cuidado apropriado ao manusear 
Conjunto de tampão de coloração Foxp3eBiosciences00-5523
Anti-CD4  FITCeBiosciences11-0041clone GK1.5 
Anti-CD8a perCP-cy5.5eBiosciences45-0081-80clone 53-6.7 
Anti-MHCII PEeBiosciences12-0920  clone HIS19
Anti-CD25 PEeBiosciences12-0251-82  clone PC61.5 
Anti-CD62L PEeBiosciences12-0621-82clone MEL-14 
Anti-CD44 APCeBiosciences17-0441clone IM7 
Anti-IFN-gama FITC eBiosciences11-7311-81clone XMG1.2
Anti-IL-4 PEBD Biosciences554435clone 11B11
Anti-IL-9 PE ou APCeBiosciences/Biolegend50-8091-82/514104clone RM9A4
Anti-IL-17a PEBD Biosciences559502clone TC11-18H10
Anti-Foxp3  APC ou PEeBiosciences17-5773-82/12-5773-80 clone FJK-16s
NaClSigmaS7653
KClSigmaP9333
Na2HPO4-2H2OSigma71643
Dextrose/GlicoseSigmaG7021
HEPES, ácido livreSigmaH3375
NH4ClSigmaA9434
EDTA DissódicoSigmaD2900000
KHCO3Sigma237205
  CaCl2 SigmaC5670
Colunas de separação de células MS LS

Referências

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