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Artigo de método

Compreender orgânico dissolvido Matéria Biogeoquímica Através

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⸱

DOI:

10.3791/54704

⸱

29 de outubro de 2016

 ,  , 
1Department of Natural Resources and the Environment, University of New Hampshire

Neste artigo

Resumo

matéria orgânica dissolvida constitui uma importante fonte de energia e nutrientes para transmitir ecossistemas. Aqui demonstramos um método à base de campo para manipular a piscina ambiente de matéria orgânica dissolvida in situ por meio de impulsos de nutrientes facilmente reproduzíveis.

Resumo

A matéria orgânica dissolvida (DOM) é uma mistura altamente diversificada de moléculas que fornece uma das maiores fontes de energia e nutrientes para os ecossistemas de fluxo. No entanto, o estudo in situ do DOM é difícil, pois a complexidade molecular do pool do DOM não pode ser facilmente reproduzida para fins experimentais. As adições de nutrientes aos riachos, no entanto, demonstraram alterar repetidamente o pool DOM in situ e ambiente. Aqui, demonstramos um método baseado em campo facilmente replicável para manipular o pool de ambientes do DOM na escala do ecossistema. Durante os experimentos de pulso de nutrientes, as mudanças na concentração de carbono orgânico dissolvido e nitrogênio orgânico dissolvido podem ser examinadas em uma ampla gama de concentrações de nutrientes. Este método permite que os pesquisadores examinem os controles no pool DOM e façam inferências sobre o papel e a função que certas frações do pool DOM desempenham dentro dos ecossistemas. Defendemos o uso deste método como uma técnica para ajudar a desenvolver uma compreensão mais profunda da biogeoquímica do DOM e como ela interage com os nutrientes. Com mais desenvolvimento, este método pode ajudar a elucidar a dinâmica da MOD em outros ecossistemas.

Introdução

matéria orgânica dissolvida (MOD) fornece uma importante fonte de energia e nutrientes para os ecossistemas de água doce e é definida como a matéria orgânica que passa através de um filtro de 0,7 um. Dentro de ecossistemas aquáticos, DOM também pode influenciar a atenuação da luz e complexação de metais. DOM é uma mistura altamente diversificada e heterogéneo de compostos orgânicos com vários grupos funcionais, bem como nutrientes essenciais, tais como o azoto (N) e fósforo (P). Embora o termo "DOM" descreve toda a piscina, incluindo a sua relação C, componentes de N e P, a sua concentração é medida como carbono orgânico dissolvido (COD). A complexidade molecular inerente da piscina DOM no entanto, cria desafios para o seu estudo. Por exemplo, não há nenhuma maneira directa para medir a fracção do conjunto total de DOM composto de nutrientes orgânicos, tais como o azoto orgânico dissolvido (DON) e fósforo orgânico dissolvido (DOP). Em vez disso, a concentração de nutrientes orgânicos deve ser determinada por diferença ( eg [DON] = [nitrogênio total dissolvido] - [dissolvido nitrogênio inorgânico]).

Adicionando uma alteração DOM realista para um fluxo é difícil devido à diversidade da piscina DOM ambiente. Estudos anteriores acrescentou fontes de carbono simples (por exemplo, glicose, uréia 1) ou de uma fonte específica, como a maca da folha de lixiviados 2 para manipular as concentrações no campo. No entanto, estas fontes não são particularmente representativo da piscina DOM ambiente. Tentando refinar ou se concentrar DOM ambiente para experimentação posterior também é feito com dificuldades, incluindo a perda de certas frações (por exemplo, componentes altamente instáveis) durante o processamento. Como resultado, é difícil de entender os controles da piscina DOM ambiente como nós atualmente não possuem qualquer método para manipular diretamente a piscina DOM ambiente. No entanto, desde a biogeoquímica de DOM está ligada aos nutrientes comumente encontrados no ambiente (por exemplo, nittaxa de [NO 3 -] 3), podemos acrescentar outros solutos para transmitir os ecossistemas e medir a resposta da piscina DOM para essas manipulações. Examinando como a piscina DOM responde a uma ampla gama de concentrações de nutrientes experimentalmente impostas esperamos obter uma melhor visão sobre como DOM responde a variações nas condições ambientais.

Um método vulgarmente utilizado em fluxo biogeochemistry é o método da adição de nutrientes. Experimentos de adição de nutrientes têm sido tradicionalmente usado para entender cinética do consumo ou o destino do 4,5,6,7 soluto acrescentou. Adições de nutrientes podem ser de curto prazo na hr 6 a escala dia 4 ou manipulações de longo prazo ao longo de vários anos 8. Adições de nutrientes também podem incluir isotopicamente nutrientes (por exemplo, 15 N-NO 3 -) para traçar nutrientes adicionados através de reações biogeoquímicas. No entanto, estudos baseados em isótopos são frequentemente expensive e exigem análises difíceis (por exemplo, digestões) dos vários compartimentos bentônicos onde os nutrientes isotopicamente marcados podem ser retidos. Experimentação recente revelou a utilidade de impulsos de curto prazo de nutrientes para elucidar os controles não solutos adicionados e ambientais, tais como DOM 9,10, revelando uma nova forma pela qual a analisar em tempo real em reacções bioquímicos in situ. Aqui nós descrevemos e demonstrar os passos metodológicos fundamentais para a realização de pulsos de nutrientes de curto prazo com o objetivo de compreender a biogeoquímica acoplado de C e N e, especificamente, os controles na piscina DOM altamente diversificada. Este método envolve a adição facilmente reprodutível um pulso de nutrientes a um alcance fluxo experimental e medição de alterações na concentração de soluto, tanto o manipulada e variável de resposta de interesse (por exemplo, DOC, DON, DOP). Ao manipular diretamente as concentrações de nutrientes in situ que são capazes de alterar indiretamente o DOMpiscina e examinar como DOM concentração alterações em uma gama dinâmica de concentrações de nutrientes 10.

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Protocolo

1. Identificar e caracterizar o Ideal Experimental Corrente Alcance

  1. Certifique-se que experimentais de transmissão atinge são longos o suficiente para promover a mistura completa dos solutos 11 e longas o bastante para que a absorção biológica pode ocorrer. comprimentos de alcance pode variar entre os córregos e experimentos. Em riachos de cabeceira pequenas de primeira ordem, chegar comprimento pode variar de 20-150 m (ou mais, se o sistema exigir) dependendo de descarga e outras propriedades físicas do riacho.
    1. Excluir grandes piscinas de alcances experimentais, como eles retardar o movimento a jusante de solutos, seções de fluxo mínimo, e afluentes que diluem a solução acrescentou. Períodos de baixa descarga pode exigir redução do período alcance enquanto maior descarga pode exigir um alcance mais longo.
    2. Identificar um local no topo do alcance fluxo experimental acima de uma espingarda para facilitar a mistura dos solutos adicionados. Este será o local de adição. Na parte inferior do fluxo experimentalalcançar, identificar um local, onde o fluxo é constrito e representativa de cerca de 90% do fluxo total (Figura 1). Este será o local de coleta da amostra.

figure-protocol-1
Figura 1:. Exemplo do local de amostragem a jusante Um local de amostragem ideal é onde a maior parte do fluxo é constrito e facilmente acessível, sem perturbação do canal de fluxo e bentos. Aqui um pedaço caído de restos de madeira criou este ponto de amostragem em um pequeno córrego de cabeceira de primeira ordem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Obter concentrações de medição de descarga e de nutrientes fundo dos solutos de interesse antes de experiências, a fim de calcular a massa de solutos necessários para o manipulations. Por favor, veja os cálculos na etapa 2.2.1.
    1. Obter os dados de concentração de fundo para o soluto alvo de manipulação (por exemplo, NO 3 -) e cloreto (Cl -), que é frequentemente usado como o marcador conservadora. Utilizar o traçador conservadora no contexto destas experiências, para controlar as alterações na condutividade, o que indica a chegada do impulso de nutrientes na estação de recolha de amostras e a taxa em que o impulso atravessa. Condutividade ou condutância específica, é um substituto para as mudanças in situ na concentração do traçador conservadora.
    2. Caracterizar as propriedades físico-químicas do alcance experimental pela coleta de dados auxiliares, tais como largura de alcance e profundidade, temperatura, pH e oxigênio dissolvido.
      1. Efectuar as medições que não podem ser feitas com a utilização de uma sonda do ambiente (por exemplo, largura e profundidade), o dia antes ou imediatamente após a experiência, a fim de minimizar qualquer bêntico ór distúrbio químico dentro do canal de fluxo. Divida o alcance experimental em transectos eqüidistantes (por exemplo, a cada 10 m), onde largura e pelo menos 3 medições de profundidade podem ser avaliados (por exemplo, banco, thalweg, e deixou margem direita). Estes dados são valiosos para conectar as propriedades físicas de um fluxo para medições biogeoquímicos e se os pesquisadores também estão interessados no cálculo cinética de absorção de nutrientes e parâmetros 6.

2. Preparação para Experiment

  1. Determinar a massa (kg) de soluto necessária para a manipulação utilizando as equações descritas abaixo.
    Nota: O exemplo a seguir aplica-se a uma experiência de base de nitrato com NO 3 - na forma de nitrato de sódio (NaNO3) e assume um aumento específico do 3x acima do fundo (equações são baseados naqueles de Kilpatrick e Cobb 12). Neste exemplo, os seguintes pressupostos foram feitas com respecto às condições de fundo: A descarga = 10 L / s; [Cl] = 10 mg / L; [NO3 -] = 50 mg N / l. Devido à variação entre experiências, ajustar os dados de entrada necessários.
    1. Calcule o pretendido aumento (Equação 1):
      Targeted [NO 3 - mg N / L] aumento = fundo esperado [NO 3 - mg N / L] aumento * alvejado
      150 ^ g N / L = 50 ^ g N / L * 3
    2. Calcular o fluxo de massa atómica total (Equação 2):
      Total de fluxo de massa atómica (NO 3 - g N) = 30 min 60 seg * * Q (L / s) * alvejado [NO 3 - mg N / L] aumento
      Onde 30 minutos é a duração assumida de pico de soluto 12 e Q é de descarga
      2 700 000 ug N = 30 min 60 seg * * 10 l / s * 150 ^ g N / L
    3. Calcular o fluxo de massa molecular total (Equação 3):
      Total de fluxo de massa molecular (NO 3 - g N) = fluxo de massa atómica total (NO 3 - g N) / massa atómica (14) * nós molecularight (85)
      Onde massa atômica refere-se a N e peso molecular refere-se a NaNO 3.
      16,392,857.14 ug N = 2700000 ug N / (14 * 85)
    4. Calcula-se a massa para adicionar (Equação 4):
      Massa para adicionar (g) = fluxo total massa molecular (NO3 - N ug) / 1000000 g / ug
      16,39 g de NaNO3 = 16,392,857.14 ug N / 1000000 g / ug
      Nota: Seguir os cálculos acima para quaisquer outros solutos, incluindo o marcador conservadora (por exemplo, cloreto de sódio). Certifique-se de ajustar as massas atómicas e moleculares para o soluto de interesse.
  2. Prepare todos os solutos um dia antes da experimentos de campo. Pesar solutos suficientes para aumentar a concentração do ambiente, tanto o marcador biológico e o traçador conservadora três vezes (ou quantidade desejada) acima do fundo. É importante que a quantidade de solutos adicionados provoca uma alteração mensurável acima do fundo concentração que é suficiente para criar AWide gama dinâmica da concentração de nutrientes adicionados.
    1. Pesar solutos usando escalas de análise e, posteriormente, armazenar em frascos de polietileno limpo lavado com ácido e alta densidade com rótulos apropriados. Exemplos de marcadores biológicos incluem: NO 3 -: Nitrato de sódio (NaNO3); NH 4 +: cloreto de amónio (NH4CI); PO 4 -3: fosfato de potássio (K 2 HPO 4). No entanto, a escolha do marcador biológico será uma função da questão biogeoquímico ser perguntado. Opções para marcadores conservativas incluem cloreto de sódio (NaCl) e brometo de sódio (NaBr).
  3. Recolha materiais restantes: caderno de campo, fita rotulagem e caneta, fita de medição de campo, mais frio, medidor de condutividade, ~ 20 L balde e grande vareta (por exemplo cerveja pá, vergalhões, grande stick), cerca de 50 limpas e lavadas com ácido 125 ml alta frascos de polietileno -density. Rotular os frascos de 125 ml # 1-50.
    Nota: LESS de 50 amostras podem ser recolhidas a cada ensaio e as amostras de fundo são incluídos nas 50 frascos totais.
  4. Opcional: Dependendo do número de pessoal de campo, executar a filtragem de amostra no local (ver secção # 5). Se esta opção for escolhida, trazer 50, 60 ml garrafas pré-marcado e lavado com ácido limpas polietileno de alta densidade para o campo. Rotular os 60 ml garrafas # 1-50 para igualar os 125 frascos de coleta ml.

3. Dia de Set Up

  1. Implantar o medidor de condutividade de campo no local de coleta. Colocar o aparelho a montante (aproximadamente 0,5-1,0 m) de amostras onde vai ser feita de modo recolha da amostra não interfere com a leituras de instrumentos. O medidor irá permanecer no local durante todo o experimento. Um medidor de campo condutividade é melhor, pois proporciona leituras de condutividade em tempo real, que são necessários para determinar a taxa de amostragem (veja o passo 5.2) e filtração e da ordem de análise (passos 5.3 e 6.1).
  2. Recolher 125 ml sampl fundoES em triplicado no local de adição e, no local de recolha do alcance experimental antes da adição da solução. Estes dados serão utilizados para verificar-dia de concentração ambiente e para determinar a variação na concentração de soluto ao longo do alcance de fluxo. Esses dados também são valiosos para conectar química dos riachos ambiente: - para as medições biogeoquímicos de interesse (por exemplo DOC NO 3 rácios 13.).
  3. Anote o tempo e condutividade de amostras de fundo recolhidas.
  4. Grave a condutividade da corrente de fundo, antes da adição das soluções.

4. Os solutos Adicionando

  1. Despeje todos os reagentes (16,39 g NaNO3 e 1,483 g de NaCl) em um recipiente grande (por exemplo, 20 L de balde) e adicionar água corrente suficiente para dissolver completamente os solutos. Lavar vasos de reagentes três vezes com água fluxo adicional e despeje em um recipiente lavar solução. Mantenha o controle de quantidade de água adicionada.
    1. Por exemplo, usar uma garrafa de 500 ml para derramar água corrente para dentro do recipiente. Agita-se solução até que todos os reagentes tenham sido completamente dissolvido.
  2. Recolha de 60 ml de alíquota da solução de adição. Mantenha esta amostra altamente concentrado separado (por exemplo saco zip-lock) de todas as outras amostras para minimizar a contaminação cruzada. Tais amostras são importantes se o cálculo de nutrientes cinética de captação 6 é um objectivo adicional do projecto de investigação como estas amostras pode ser utilizado para determinar a massa exacta de solutos adicionados.
  3. Despeje solução no local de adição. Faça isso por verter a solução em um movimento suave e rápida para minimizar o tempo de atraso de viagem e salpicos que poderia reduzir a quantidade de reagentes adicionados. Enxaguar o recipiente e a agitação da vara três vezes no fluxo imediatamente após a adição de garantir que todos os reagentes foram adicionados à corrente.
    1. Anote o tempo foi adicionado a solução: hr: min: seg.
    2. Grave as massas de marcadores adicionados(Por exemplo NaNO3 e NaCl).
    3. Depois que a solução foi adicionada, não perturbe o fluxo. Certifique-se de que todas as viagens ao longo do córrego ocorre nas margens para garantir que o bentos córrego e da própria solução não sejam perturbados.

Amostragem 5. Campo

  1. Hora garrafas de amostragem, em ordem crescente, enquanto espera para solução para chegar ao local de amostragem. O tempo de viagem será uma função de descarga e atingir o comprimento e pode ser determinada antes do tempo (um dia antes) quer com uma injecção única de NaCl ou corante rodamina (que pode ser utilizado para estabelecer o tempo de viagem 14).
    Nota: Se estiver trabalhando em um projeto DON-temático, evitar o uso de corante rodamina, pois é um tipo de DON e, portanto, alterar o ambiente DON piscina se os restos do alcance estudo.

figure-protocol-2
Figura 2:Exemplo esquemática da curva de eluição de solutos (BTC). Um BTC representa mudanças na concentração de soluto ao longo do tempo e pode ser usado para explicar o trânsito e ciclo biogeoquímico de um traçador numa corrente. Agarre amostras devem ser tomadas em todo o BTC com uma frequência que dá uma representação igual tanto para o ascendente e descendente membros do BTC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Coleta de Amostras
    Nota: O objectivo dominante da recolha da amostra, é de representar adequadamente alterações na concentração de soluto ao longo de ambos os aumentos e quedas membros da ruptura com curva (BTC) (Figura 2).
    1. Após a chegada da solução (detectado através de um aumento da condutividade), recolher amostras em frascos de 125 ml ao longo do BTC, segurando um frasco de 125 ml para o fluxo principal de água no ponto de amostragem. Rápidoly lavar a garrafa com água corrente e descartar lavar a jusante e em seguida, tomar amostra. amostra Cap e coloque em cooler.
    2. Registar o tempo (horas: min: seg) e a condutividade de cada amostra tirada ao longo da BTC num livro de campo (Tabela 1).
    3. Coletar amostras baseadas no tempo (por exemplo, intervalos de 1 min) ou com base na taxa em que as mudanças de condutividade. Por exemplo, se a condutividade está mudando rapidamente, provar a cada 30-60 segundos até que as mudanças na condutividade lento, no qual amostras de tempo podem ser tomadas a cada 5-10 min. Para intervalos com base na condutividade, recolher amostras a cada 15-30 unidades dependendo da taxa à qual a condutividade está mudando.
    4. Amostra até condutividade retorna para o fundo ou dentro de 5 microsiemens / cm de condições de fundo. Intervalos de coleta de amostra pode ser ajustada durante o experimento, enquanto o BTC está bem representada nas amostras de agarrar.
garrafa # Condutância específica Tempo notas
1 hr: min: seg por exemplo fundo (downstream)
2 por exemplo fundo (downstream)
3
4
5 por exemplo, amostra a condutância de pico
.
.
.
Maior Bottle #

tabela 1PFieldlivro: Exemplo da página do Lab Livro e Informação Necessária

  1. Filtragem de amostra
    Nota: A filtragem das amostras pode ocorrer tanto no campo ou ao retornar para o laboratório.
    1. amostras de filtração do membro subindo em ordem crescente de condutividade específica até o pico de condutividade específica. Aguarde até que o experimento para acabar e amostras de filtro do membro caindo em ordem crescente de condutividade específica (ou seja, começar com a última amostra e trabalhar para trás em direção a condutividade específica de pico).
      Nota: Esta ordem de amostras minimiza a contaminação cruzada entre as amostras e permite que o mesmo filtro, a seringa, e suporte de filtro a ser utilizado, desde que o filtro, a seringa e suporte de filtro são enxaguados apropriadamente entre cada amostra (ver passos 5.3.2- 5.3.4).
    2. Remova o êmbolo de uma seringa de 60 ml e depois fechar a válvula de segurança. Pour ~ 10 ml da amostra para a seringa e retornar ao êmbolo da seringa. Agitar seringa de modo que a amostralavagens paredes internas da seringa. seringa ligada ao porta-filtro e stop-cock aberto. Empurre amostra através de porta-filtro e descartar enxaguar.
    3. Remover êmbolo e fechar a válvula de segurança. Despeje ~ 30 ml de amostra para a seringa e voltar êmbolo para seringa. Abrir estoque-pau e expulsar ~ 10 ml por meio de porta-filtro e em 60 ml garrafa de amostragem. Tampe o frasco, agitar com filtrado e descarte. Repita este passo para um total de 3 lavagens. Isto irá assegurar que todas as impurezas foram removidas a partir do frasco de amostra de 60 ml e que as paredes são revestidas com a amostra.
    4. Remover êmbolo e fechar a válvula de segurança. Despeje ~ 60 ml de amostra para a seringa e voltar êmbolo para seringa. Empurre a amostra através de suporte do filtro e no frasco da amostra de 60 ml. Encher garrafas até o ombro para evitar rachaduras de garrafas quando congelado. garrafa de tampa e coloque em cooler.
    5. Repita os passos 5.3.2-5.3.4 para todas as amostras restantes. Trocar o filtro entre ascendente e descendente amostras de membros para minimizar a contaminação.
    6. amostras transporte de volta para o laboratório no mesmo dia e no gelo.

6. Preparação para análise laboratorial

  1. Se a filtragem das amostras deve ocorrer no laboratório, seguir o protocolo, conforme descrito no ponto 5.3.1. Filtrar amostras de ambos os membros ascendentes e descendentes do BTC, a fim de aumentar a condutividade. Mudar o filtro entre o aumento dos membros e queda amostras dos membros.
  2. Congele as amostras filtradas a -20 ° C até à análise.
  3. Garantir que as instalações analíticas estão equipados para lidar com amostras altamente concentradas.
    Nota: Alguns laboratórios não estão equipados para executar amostras altamente concentradas e, portanto, deve ser tomado cuidado. Incorporar padrões preparados que capturam que a maior final de concentrações de soluto esperados. padrões elevados de concentração irá ajudar a garantir uma curva padrão que capta o intervalo esperado de concentrações de soluto manipulados.
  4. analisar amostrasde baixa para alta condutividade em todos os instrumentos analíticos. Pedido de amostras de baixa a alta condutividade específica impede a contaminação de amostras de baixa sal / nutrientes por amostras elevadas de sal / nutrientes. Isto significa que a partir de amostras de subida e de descida membros serão misturados no que diz respeito à sequência.
    1. Analisar amostras de carbono total orgânico dissolvido, nitrogênio total dissolvido, nitrato e amônio, embora a exata combinação de análise de soluto será uma função da questão de pesquisa (veja Wymore et al. 10, por exemplo).

Análise 7. Os dados

  1. Analisar os dados usando regressão linear simples. A variável independente é as concentrações do nutriente adicionado e a variável dependente é a concentração de MOD tanto como DOC ou DON. Cada ponto na figura representa uma amostra aleatória a partir da curva de ruptura e de nutrientes que de amostra e DOC concentração / DON.

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Resultados

figure-results-1
Figura 3: Exemplo. Os resultados de nitrato (NO3 -) Adições com Dissolvido nitrogênio orgânico (DON) como variável de resposta As análises são regressões lineares. Asteriscos representam significância estatística em α = 0,05. Note-se a gama dinâmica em NO3 - concentração que foi conseguida com o método de pulso de nutriente...

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Discussão

O objetivo do método de pulso de nutrientes, como apresentado aqui, é caracterizar e quantificar a resposta da piscina altamente diversificada de ambiente DOM água do córrego em toda uma gama dinâmica de um nutriente inorgânico acrescentou. Se o soluto adicionado suficientemente aumenta a concentração do soluto reactivo, um grande espaço inferencial pode ser criado para compreender como o ciclo biogeoquímico de DOM é ligado a concentrações de nutrientes. Esta abordagem pulso nutriente é ideal, pois envolve nenhuma das m...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Laboratório de Análise da Qualidade da Água da Universidade de New Hampshire pela assistência na análise da amostra. Os autores também agradecem a dois revisores anônimos cujos comentários ajudaram a melhorar o manuscrito. Este trabalho é financiado pela National Science Foundation (DEB-1556603). O financiamento parcial também foi fornecido pelo Projeto EPSCoR Ecossistemas e Sociedade (NSF EPS-1101245), Estação Experimental Agrícola de New Hampshire (Contribuição Científica # 2662), Projeto do Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA (McIntire-Stennis) (1006760), Escola de Pós-Graduação da Universidade de New Hampshire e Centro de Pesquisa de Recursos Hídricos de New Hampshire.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nitrato de sódioQualquerQualquer
cloreto de sódioQualquerQualquerO sal de mesa comprado na loja também pode ser usado, no entanto, contém vestígios de impurezas
Filtros de fibra de vidro Whatman GFFQualquer
Seringa de filtragem BDQualquerQualquer
filtro EMD Millipore SwinnexQualquer
Torneira de parada de seringaQualquerQualquer
sonda multiparâmetro YSIYellow Springs International556-01
Garrafas de HDPE de 125 ml de boca largaQualquerQualquer Garrafas
de HDPE de 60 mlQualquerBalde
de 20 LQualquerQualquer
Fita métrica de campoQualquerQualquer
Fita de rotulagem de laboratórioQualquerAny
Stir stickQualquerCooler
QualquerCaneta
SharpieQualquerCaderno
campoQualquerPinça
QualquerSacos
Zip-lockQualquerQualquer Qualquer
Suportes de de

Referências

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Reimpressões e permissões

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