Descreve-se um método modificado para o isolamento de fracção de membrana a partir de células humanas e de preparação da amostra para a detecção de -glycosylation SCAP N e proteína total, utilizando Western blot. Nós introduzimos ainda um método de rotulagem GFP para monitorar o tráfico SCAP usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser utilizado em laboratórios de biologia regulares.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A lipogênese elevada é uma característica comum do câncer e das doenças metabólicas. As proteínas de ligação ao elemento regulador de esteróis (SREBPs), uma família de fatores de transcrição ligados à membrana que controlam a expressão de genes importantes para a síntese de colesterol, ácidos graxos e fosfolipídios, são frequentemente reguladas positivamente nessas doenças. No processo de translocação nuclear de SREBP, a proteína ativadora de clivagem SREBP (SCAP) desempenha um papel central no tráfego de SREBP do retículo endoplasmático (ER) para o Golgi e na subsequente ativação da proteólise. Recentemente, descobrimos que a N-glicosilação mediada por glicose de SCAP é uma condição de pré-requisito para a saída de SCAP / SREBP do ER e movimento para o Golgi. A N-glicosilação estabiliza o SCAP e direciona o tráfego de SCAP/SREBP. Aqui, descrevemos um protocolo para o isolamento de frações de membrana em células humanas e para a preparação das amostras para a detecção de N-glicosilação SCAP e proteína total usando western blot. Além disso, fornecemos um método para monitorar o tráfego SCAP usando microscopia confocal. Este protocolo é apropriado para a investigação da N-glicosilação de SCAP e do tráfego em células de mamíferos.
Introdução
A desregulamentação do metabolismo lipídico é uma característica comum de câncer e doenças metabólicas 1-6. Nestes processos, esterol de proteínas reguladoras de ligação ao elemento (SREBPs), uma família de factores de transcrição, desempenham um papel crítico no controle da expressão de genes importantes para a absorção e síntese de colesterol, ácidos gordos, fosfolípidos e 7-10.
SREBPs, incluindo SREBP-1a, SREBP-1c, e de SREBP-2, são sintetizadas como precursores inactivos que se ligam à membrana do retículo endoplasmático (ER), em virtude de dois domínios transmembranares 7. O N-terminal da SREBPs conté....
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Protocolo
1. Detecção de proteína endógena em células humanas SCAP
- Cultura Celular e Tratamento
- Semear as células ~ U87 1 x 10 6 em um prato de 10 cm, com Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS) e incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas antes do tratamento.
- Lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS), em seguida, mudar as células para meio DMEM fresco com ou sem glicose (5 mM) durante 12 h.
- Preparação de Membrana Celular frações e Nucleares Extractos
- Lavar as células uma vez com PBS, raspar em 1 ml de PBS,....
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Resultados
A Figura 1 mostra a detecção da proteína endógena e SCAP forma nuclear de SREBP-1 em células U87 de glioblastoma humanas em resposta à glicose estimulação utilizando Western blot. O SCAP proteína da membrana é detectada no "fracção de membrana". A forma do núcleo (N-terminal) de SREBP-1 é detectada no "Extractos nucleares". O nível de proteína de SCAP (PDI serve como um controlo interno de proteínas de membrana ER) e forma nuclear de SREBP-1 são.......
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Discussão
Neste estudo, descrevemos um protocolo para o isolamento de fracções de membrana de células de origem humana e para a preparação das amostras para a detecção de -glycosylation SCAP N e proteína total, utilizando Western blot. Nós fornecemos também um método para monitorar o tráfico SCAP usando GFP-rotulagem e microscopia confocal. O método é utilizado especificamente para analisar proteína de membrana e é uma ferramenta importante para investigar SCAP N -glycosylation e tráfico.
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Somos gratos aos Drs. Mike S. Brown e Joseph L. Goldstein por sua concordância em publicar este método de acordo com os métodos descritos em suas publicações. Agradecemos ao Dr. Peter Espenshade por compartilhar o plasmídeo GFP-SCAP. Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH NS072838 e NS079701 para D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM para D.G. e OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship para C.C. Também agradecemos o apoio do Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) e do Programa Terapêutico Translacional OSUCCC e fundos iniciais para D.G.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| tripsina | Inibidor | T6567 | |
| Sigma | T9777 | ||
| PNGase F | Anticorpo Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP anticorpo | Roche | 11814460001 | |
| anticorpo SREBP-1 (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Anticorpo (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Anticorpo Lamin A (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| Anticorpo SCAP (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM) sem glicose, piruvato e glutamina | Cellgro | 17-207-CV | Adicione 1 mM de Pyravate e 4 mM de Glutamina antes de usar |
| 22 G x 1 1/2 agulha | BD | 305156 | |
| pepstatina A | Sigma | P5318 | |
| leupeptina | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| TDT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Membrana de nitrocelulose | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0,5 M pH 8,5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0,5 M estéril (pH 8,0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glicerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma | M3148 | |
| azul de bromofenol | Sigma | B8026 | |
| prolonga o ouro anti-reagente anti-desvanecimento com dapi | Life Technologies | P36935 | |
| L-glutamina (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | |
| pirovato de sódio | Life Technologies | 11360-070 |
Referências
- Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. Tumor metabolism of malignant gliomas. Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).
- Moon, Y. A., et al. The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohyd....
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Reimpressões e permissões
