detecção de Trypanosoma brucei Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Resumo

Os tripanossomas africanos cultivados in vitro sofrem variação antigênica em uma taxa baixa, de modo que as populações são compostas de parasitas que expressam um tipo de glicoproteína de superfície variante dominante (VSG) e uma pequena população de variantes "trocadas". Este protocolo descreve um método rápido para detectar e quantificar essas populações.

Resumo

Trypanosoma brucei, um parasita protozoário que causa tripanossomíase africana humana e animal (conhecida como doença do sono e nagana, respectivamente) alterna entre um vetor tsé-tsé e um hospedeiro mamífero. Ele escapa do sistema imunológico do hospedeiro mamífero trocando periodicamente a glicoproteína de superfície densa e variante (VSG) que cobre sua superfície. A detecção de variação antigênica em Trypanosoma brucei pode ser complicada e trabalhosa. Aqui, apresentamos um método para quantificar o número de parasitas que 'mudaram' para expressar um novo VSG em uma determinada população. Os parasitas são primeiro corados com um anticorpo contra o VSG inicial e, em seguida, corados com um anticorpo secundário ligado a um cordão magnético. Os parasitas que expressam o VSG inicial são então separados do resto da população, passando os parasitas por uma coluna presa a um ímã. Os parasitas que expressam o VSG inicial dominante são retidos na coluna, enquanto o fluxo contém parasitas que expressam um novo VSG, bem como alguns contaminantes que expressam o VSG inicial. Essa população de fluxo contínuo é corada novamente com um anticorpo marcado com fluorescência contra o VSG inicial para rotular contaminantes e iodeto de propídio (PI), que rotula células mortas. Um número conhecido de contas de contagem absoluta que são visíveis por citometria de fluxo é adicionado à população de fluxo. A proporção de grânulos para o número de células coletadas pode então ser usada para extrapolar o número de células em toda a amostra. A citometria de fluxo é usada para quantificar a população de switchers contando o número de células PI negativas que não se coram positivamente para o VSG inicial dominante. A proporção de comutadores na população pode então ser calculada usando os dados de citometria de fluxo.

Introdução

O parasita protozoário, o Trypanosoma brucei, é um agente causador de doenças que afetam os seres humanos (via Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e animais (via Trypanosoma brucei brucei) em toda a África Sub-Sahariana. Ele é transmitido para o hospedeiro mamífero através da saliva do vector mosca tsé-tsé. Ambos Humana e tripanossomíase Africano Animal causar uma carga económica grave em regiões endêmicas, e poucas drogas são disponíveis ou em desenvolvimento para o tratamento de qualquer doença. Compreender mecanismos de evasão imunitária é crítico para o desenvolvimento de drogas para a tripanossomíase. A variação antigênica do revestimento denso, Variante glicoproteína de superfície (VSG) que cobre o parasita é um dos meios primários pelos quais T. brucei evita a resposta do anticorpo de mamífero. Cerca de 2000 variantes do gene VSG existem no genoma tripanossoma, mas só um é transcrito em qualquer momento a partir de uma de ~ 15 expresSites SION. 'Comutação' da VSG expresso pode ocorrer quer por cópia de um gene de VSG no local de expressão activa, ou por activação da transcrição de um local de expressão anteriormente silenciosos (revisto em ^1).

Embora muito trabalho foi dedicado à compreensão variação antigênica em T. brucei, os fatores que influenciam a freqüência de comutação são ainda pouco compreendidos. Estudos até à data têm sido dificultados pelo fato de que, enquanto a comutação ocorre estocasticamente in vitro, freqüências de chaveamento são muito baixos, da ordem de 1 a cerca de 10 ⁶ células ^2. Isso torna difícil para medir se um fator dadas aumenta ou diminui frequência de comutação, uma vez que a mudança é difícil de detectar, em primeiro lugar. Antes de 2009, os métodos para isolar switchers em uma dada população foram longo e trabalhoso. Estas células Passaging tripanossomas através de ratinhos imunizados contra o VSG dominante e em seguida colhem incluídosum dias mais tarde ^três, contando ou centenas de células por imunofluorescência ^4,5. Outra estratégia baseia-se na seleção para resistência a drogas para isolar switchers ^6. Porque tripanossomas africanos cultivadas in vitro são geralmente composta de uma população grande expressando uma variante importante, e uma população muito menor de switchers que expressam variantes alternativas, referimo-nos à grande variação ao longo deste artigo como o, VSG começando dominante. Ao fazê-lo, nós, de modo algum pretendo afirmar que este importante variante tem maior aptidão do que outras variantes na população.

Aqui nós descrevemos um método que pode medir de forma confiável o número de tripanossomas expressando um VSG não dominante numa dada população em 3-4 horas. Este método é particularmente útil para quando se quer determinar se um dado manipulação genética ou tratamento medicamentoso aumenta o número de células ligadas em uma população. Em vez de libertar a população de células que expressam a fazerminant, começando VSG através de drogas ou por meios imunológicos, estas células são eliminadas por primeiro revestindo-os com pérolas magnéticas acopladas a anticorpos contra a VSG dominante e em seguida isolá-los sobre uma coluna magnética. A população ligado é então recolhido no fluxo de passagem e coradas novamente com um anticorpo marcado com fluoróforo anti-VSG para a identificação de contaminantes. A quantificação é conseguida através da adição de um número definido de pérolas de contagem absoluta de cada amostra de modo que a razão de pérolas para células pode ser determinada e utilizada para quantificar o número de comutadores na população ^7.

Protocolo

NOTA: Durante o procedimento, é necessário manter as células no gelo. media frias também devem ser utilizados por toda parte.

Colheita 1. Amostra

1. Crescer Lister 427 tripanossomas tensão da corrente sanguínea até uma densidade de 0,5 - 1 milhão / ml. É melhor iniciar culturas com um pequeno número de parasitas. Girar 50 X 10 ⁶ células / amostra durante 10 min a 1500 x g. Certifique-se de deixar 1 x 10 ⁶ células em cultura para mais tarde usar controles de anticorpos como positivos e negativos.
   NOTA: Este protocolo também pode ser usado em tripanossomas isolados de sangue animal (ver discussão para mais detalhes).
2. Pipeta ou deitar fora a maior parte do sobrenadante (deixar cerca de 750 mL). Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Girar as células a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg numa microcentrífuga e remover o sobrenadante.

2. Etiquetagem Magnética

1. Ressuspender as células em 150 ul de meio de cultura (HMI-9 with soro, por exemplo) + anticorpo anti-VSG primário na diluição apropriada.
   NOTA: O anticorpo anti-VSG é feita em casa e usado numa diluição de 1:50. É importante a utilização de um anticorpo anti-VSG primário que não é marcado com um fluoróforo.
2. Vortex células utilizando um vórtice adaptador-60 a uma velocidade de 6 - 8 numa sala fria a 4 ° C durante 10 min. Lavar com 800 - 1.000 l fria HMI-9 com soro.
3. Centrifugação a 4 ° C durante 4 min a 5200 xg e o sobrenadante aspirado. Lava-se com 1 ml de HMI-9 com soro e rodar como acima. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 100 ul de HMI-9 com soro.
4. Adicionar 110 ul de células magnético ativado triagem microesferas (MSC). Use anti-rato, anti-coelho, ou grânulos anti-biotina, conforme apropriado para o anticorpo anti-VSG primária. Misture bem. células de vórtice em uma sala fria a 4 ° C durante 10 min.
5. Enquanto as células são vortex, configure uma separação coluna / amostra magnética ativado em um ímã separação. Certifique-se de ter um receptacle (usamos um tubo de centrífuga de 15 ml) na coluna para recolher o fluxo de passagem. Configurar o aparelho em uma sala fria.
6. Adicionar 2 ml de HMI-9 com soro à coluna prime. Após o condicionamento lugar um tubo de centrífuga de 15 ml, sob a coluna para recolha de escoamento a partir de cada amostra.
7. Após os 10 minutos de incubação na etapa 2.4, adicione 800-1.000 ul frio HMI-9 com soro. Centrifugação a 4 ° C durante 4 min a 5200 x g e remover o sobrenadante para remover o anticorpo não ligado. Lava-se com 1 ml de HMI-9 com soro e repetir deixando 100 l de sobrenadante.
8. Flick o tubo de centrífuga vigorosa e inspeccionar visualmente o tubo a certeza de que o pelete é ressuspenso completamente. Adicionar 1 ml de HMI-9 com soro e pipeta-se para baixo e para certificar-se que as células ressuspensas são bem.

3. Separação Magnética

1. Certifique-se de que as colunas são preparados como descrito acima. Aplicar células de coluna. Recolha de fluxo com células que expressam o VS não-dominanteG. 1 ml de meio + tripanossomas tipicamente leva 6-7 min a fluir através da coluna.
2. Lavar 2x com 1 ml de HMI-9 com soro e recolher o fluxo através do mesmo tubo como no passo 3.1.
3. Divide escoamento (3 mL) em dois tubos de microcentrifugação de 1,5 ml.
   NOTA: Estes podem ser combinados mais tarde ou meia pode ser usado para isolar o ARN, etc.
4. Remover coluna de ímã. Adicionar 3 ml de HMI-9 com soro à coluna e mergulhar coluna para um tubo de centrífuga de 15 ml para se obter células que expressam a partida, VSG dominante. Retirar 300 ul de material fluido para análise posterior. Manter essas células em gelo.
5. Para utilização como um positivo e um controlo negativo, demora aproximadamente 1 milhão de células a partir da cultura inicial de células de controlo em crescimento a 37 ° C (aqueles não esperado para mudar frequentemente) e pipeta-os para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: células de controlo positivo serão coradas com anticorpo marcado com fluoróforo na etapa 4.1. As células de controlo negativo Remana imaculada em todo o resto do protocolo.
6. amostras de spin fluxo e amostra de controlo de anticorpos positivo a 4 ° C durante 4 min a 5200 xg e remover o sobrenadante.
   NOTA: Outra alíquota de 300 ul de células eluídas pode ser utilizado como um controlo positivo para a coloração anti-VSG.

4. A coloração para a identificação de contaminantes e comutadores

1. amostras de fluxo através Ressuspender as células de controlo positivo e em 100 ul de HMI-9 com soro + primário, anti-VSG anticorpo, marcado com fluoróforo na diluição apropriada.
   NOTA: O anticorpo anti-VSG marcado é feito em casa e usado numa diluição de 1: 1000. A marcado com fluoróforo, anti-VSG pode ser a partir da mesma fonte que o anticorpo não marcado na separação MACS step.There deve ser de 3 ml de amostra por escoamento em dois tubos de microcentrifugação seguintes passo 3.5.
2. Para analisar a totalidade do fluxo através de citometria de fluxo, combinar as pelotas em dois tubos de microcentrifugação durante a re-SUSenquanto se aguardam as amostras em 100 l de HMI-9 com anticorpos séricos + anti-VSG. Misture bem.
3. células de vórtice em uma sala fria a 4 ° C durante 10 min. Adicionar 800 - 1.000 l fria HMI-9 com soro. amostras de rotação a 4 ° C durante 4 min a 5200 x g e remover o sobrenadante para remover o anticorpo não ligado.
4. Lave as células com 1 ml de HMI-9 com soro. amostras de rotação a 4 ° C durante 4 min a 5200 xg e remover o sobrenadante. Durante esta última rotação, girar os-amostras eluídas a partir do passo 3.4 e a amostra de controlo negativo.
5. Ressuspender todos escoamento e amostras eluídas em: 148,5 ul HMI-9 com soro, 25 uL grânulos de contagem absoluta e 1,5 ul de solução de iodeto de propídio (175 ul total) coloração. Ressuspender amostras de controlo de anticorpos positivos e negativos em 175 ul HMI-9 com soro. Certifique-se de anotar o número de contas de contagem absolutos / 25 ul para o lote específico utilizado.
6. Executar todas as amostras através de um citômetro de fluxo e recolher dados. células mortas da mancha o PI ^{+. Contaminantes manchar como PI - VSG +. Switchers manchar como PI - VSG - 8.}
7. Calcular as frequências utilizando citometria de fluxo de dados de comutação.
   NOTA: Para obter instruções sobre como calcular as frequências de comutação, consulte o arquivo suplementar Citometria de Fluxo Calculations.docx e Tabela 1.

Resultados

O método aqui descrito foi utilizado para demonstrar que as quebras de cadeia dupla no interior do local de expressão VSG aumentou o número de comutadores numa população ^8. Aqui, mostramos resultados representativos de uma população de tripanossomas que têm sido igualmente induzidos para gerar uma ruptura de fita dupla no local expressão. Nós comparar estes tripanossomas para aqueles que não tenham sido induzidas a gerar uma ruptura de fita dupla. A Figura 1 m...

Discussão

No que diz respeito à técnica experimental, o componente mais importante do protocolo é manter todas as amostras frias. Tripanossomas internalizar muito rapidamente anticorpo ligado à sua superfície ^9, mas este processo é dependente da motilidade, e não influencia o ensaio, enquanto as células são mantidas a 4 ° C. Todas as amostras devem sempre ser mantidos em gelo, e pipetagem deve ser feito rapidamente para minimizar a exposição ao ambiente C laboratório 25 °. Frio HMI-9 com soro deve estar disponível no i...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anticorpo anti-VSG não marcado	n/a	n/a	O anticorpo VSG é fabricado internamente
Anticorpo anti-VSG marcado com fluoróforo	n/a	n/a	O anticorpo VSG é fabricado internamente
HMI-9 Mídia	n/a	n/a	HMI-9 é fabricado internamente
Iodeto de propídio	BD Pharmingen	556463
CountBright contas de contagem absoluta	Thermofisher Colunas Scientific	C36950
LD	Miltenyi Biotech	130-042-901
Ímã MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
Separador magnético MACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
adaptador de vórtice-60	ThermoFisher citômetro de	AM10014
	Coulter	n/a
software de análise de citômetro de fluxo	FloJo	n/a