Análise de importação proteína em cloroplastos isolados de plantas estressadas

Resumo

Aqui nós descrevemos um novo método para estudar importação proteína em cloroplastos isolados sob estresse. O método é simples e rápida, e pode ser aplicado para estudar as consequências das diferentes condições de estresse para a importação de proteína do cloroplasto, e os mecanismos de regulação correspondentes.

Resumo

Cloroplastos são organelas com muitos papéis vitais em plantas, que incluem não só as funções de sinalização fotossíntese, mas numerosos outros metabólica e. Além disso, os cloroplastos são fundamentais para respostas de plantas para vários estresses abióticos, como salinidade e estresses osmóticos. Um cloroplasto podem conter até ~ 3000 proteínas diferentes, alguns dos quais são codificados pelo seu próprio genoma. No entanto, a maioria das proteínas de cloroplastos são codificadas no núcleo e sintetizados no citosol, e estas proteínas têm de ser importados para o cloroplasto através translocons nas membranas do invólucro do cloroplasto. Estudos recentes têm mostrado que a proteína de importação dos cloroplastos pode ser regulado activamente pelo stress. Para investigar bioquimicamente tal regulação de importação de proteínas sob condições de stress, foi desenvolvido o método descrito aqui como um procedimento rápido e simples que pode ser facilmente conseguida em qualquer laboratório. Neste método, as plantas são cultivadas sob condici normaisns e, em seguida, expostos a condições de stress em cultura líquida. O material vegetal é coletado, e cloroplastos são, então, lançado pela homogeneização. O homogenato em bruto é separado por centrifugação de gradiente de densidade, permitindo o isolamento dos cloroplastos intactos. rendimento cloroplasto é avaliada por contagem, e intacto cloroplasto é verificada ao microscópio. Para os ensaios de importação de proteínas, os cloroplastos purificadas são incubadas com ³⁵ S radiomarcado em proteínas precursoras traduzido in vitro, e os experimentos de tempo do curso são realizados para permitir comparações de taxas de importação entre os genótipos sob condições de estresse. Apresenta-se os dados gerados utilizando este método, que mostram que a taxa de importação de proteínas em cloroplastos de um mutante reguladora é alterada especificamente sob condições de stress osmótico.

Introdução

Os cloroplastos são organitos altamente abundantes que existem nos tecidos verdes das plantas. Eles são bem conhecidos por seu papel crítico na fotossíntese, um processo que utiliza a energia da luz para converter dióxido de carbono em açúcar e, assim, apoiar quase toda a vida na terra ^1. Além disso, os cloroplastos (e a família mais ampla de organelos relacionado chamado plastídios) desempenham muitas outras funções vitais nas plantas, incluindo a biossíntese de aminoácidos, lípidos, pigmentos, e a detecção de sinais ambientais, tais como a gravidade e desafio patógeno. Fotossíntese gera espécies reativas de oxigênio (ROS) como subprodutos, que em determinadas circunstâncias têm funções úteis, mas se overproduced pode causar efeitos nocivos ou mesmo letais. A superprodução de ROS é particularmente promovida por condições ambientais adversas, e, portanto, os cloroplastos estão intimamente ligados à respostas a estresses abióticos, como salinidade e estresses osmóticos ^2.

CHloroplasts têm uma estrutura complexa. Cada cloroplasto é rodeado por uma camada exterior de dupla membrana chamado de envelope, que consiste em membranas externas e internas. Internamente, há um outro sistema de membranas tilacóides chamado, onde as reacções de luz da fotossíntese ocorrem. Entre os dois sistemas de membrana existe uma chamada compartimento aquoso do estroma, que está envolvido na fixação de carbono. A cloroplasto podem conter até ~ 3.000 proteínas diferentes, e que a grande maioria destas proteínas são sintetizadas no citoplasma na forma precursora e precisam ser importados para a organela através translocons proteína dedicados nas membranas de envelope ^1. Curiosamente, o trabalho recente indicou que a importação de proteína do cloroplasto é regulada activamente, e por isso é capaz de exercer um importante nível de controle sobre o proteoma do cloroplasto. Por exemplo, foi relatado em 2015 que a importação de proteínas pode responder a estresse abiótico através da regulação direta da abundância de the translocon na membrana do invólucro mais externa dos cloroplastos (TOC) por o sistema ubiquitina-proteassoma ^3.

Usando cloroplastos purificados e em proteínas precursoras in vitro sintetizado, a importação de proteínas pode ser reconstituída in vitro ^4,5. Assim, métodos in vitro pode ser utilizado para avaliar as taxas de importação em diferentes plantas mutantes ^6, que tem sido uma abordagem importante para a análise de componentes putativos da maquinaria de importação de proteínas e para descobrir os mecanismos subjacentes a importação de proteínas e sua regulação. Além disso, os cloroplastos podem ser transformados com fraccionamento adicional ou digestão com protease, a seguir importação in vitro, o que pode facilitar estudos sobre a localização sub-organelar e topologia de proteínas de cloroplastos ^7,8.

Para estudar a regulação da importação de proteínas por estresse, modificamos o nosso método de isolamento de cloroplastos de rotina como iremos descreverAqui. Importante, cloroplastos foram isolados a partir de plantas que tinham sido cultivadas em meio Murashige e Skoog padrão (MS) médio de agar durante 8 dias e depois transferidas para meio MS suplementado com líquido estressor, proporcionando, um stress tratamento relativamente curto controlada. O rendimento e competência dos cloroplastos isolados de tais plantas tratadas com o stress são compatíveis com a jusante no ensaio de importação de proteínas in vitro ^3. Para além do protocolo de isolamento do cloroplasto, apresentamos o nosso método de rotina in vitro para a importação de proteínas, o que provou ser robusto e é amplamente utilizado ^3,9-12.

Protocolo

1. Crescimento de plantas de Arabidopsis eo stress tratamento

1. Prepare 1 litro de meio Murashige e Skoog (MS) através da adição de 4,3 g de sal basal MS mistura, 10 g de sacarose, 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) em água desionizada até 1 L, e ajustar o pH para 5,7 com hidróxido de potássio (KOH). Adiciona-se 6 g de phytoagar e autoclave durante 20 min a 120 ° C.
   1. Antes de solidificação, despeje o meio em placas de Petri redondos (diâmetro de 9 cm, altura 1,5 cm, com 20-25 mL de meio MS por placa). Permitir que as placas a secar durante ~ 1 h numa câmara de fluxo laminar antes de fechar as tampas.
2. Coloque as sementes de Arabidopsis thaliana num tubo de ensaio de 1,5 mL para a esterilização da superfície por adição de 1 mL de 70% (v / v) de etanol contendo 0,02% (v / v) de Triton X-100 e agitando continuamente durante 5-10 min. Para cada genótipo / condição, preparar 10 Placas de Petri cada uma com ~ 100 - 150 mudas.
3. Aguarde cerca de 10 s até que as sementes para liquidar ofundo do tubo, e, em seguida, desprezar o sobrenadante por pipetagem. Adicionar 1 ml de etanol a 100%, e agitar o tubo novamente por 10 min.
4. Preparar a câmara de fluxo laminar, enquanto que as sementes são de esterilização. Pegue um pedaço de papel de filtro por amostra, dobre ao meio para facilitar a semeadura, e mergulhe-o em 100% de etanol na capa. Espere até que seque completamente. Note-se que o etanol a 100% é utilizado como se evapora mais rapidamente do que 70% de etanol.
5. Transferir as sementes sobre o papel de filtro usando um pipetando 1 mL ponta da pipeta corte ~ 5 mm da extremidade fina. Deixe secar, o que deve levar cerca de 10 - 15 min.
6. Semear ~ 100 - 150 sementes esterilizadas de forma uniforme em cada prato MS meio de Petri, e selar cada placa com fita cirúrgica.
7. Armazenar as placas de cabeça para baixo a 4 ° C durante 2 - 4 d para incentivar e sincronizar germinação. sementes velhas pode ter de ficar mais tempo (até uma semana) a 4 ° C.
8. Transferir as placas para uma câmara de cultura de tecidos vegetais e deixá-los de cabeça para cima.Deixar crescer as plantas para 8 d sob um ciclo de dia longo (16 horas 100? Mol · m ^{- 2} · s ^{- 1} luz, 8 horas de escuro) a 20 ° C.
9. Para o tratamento de estresse, quando as plantas estão 8 d idade, na capela de fluxo, transferi-los a partir do meio agar, por gentilmente raspagem-los à mão usando luvas esterilizadas com etanol, para um frasco esterilizado de meio MS líquido contendo o estressor (por exemplo, , 200 mM de manitol). Evitar a transição de meio de agar. Cobrir a boca balão com uma folha esterilizada e permitir que as plantas a crescer sob as mesmas condições que no passo 1.8 para um adicional de 2 d num agitador orbital, com agitação suave (~ 100 rpm).

2. Fazendo uma proteína precursora por transcrição in vitro / tradução

Nota: Este protocolo assume a utilização de Arabidopsis fotossistema I subunidade D precursor (pPsaD) como molde / pré-proteína, mas o método é compatível com os outros.

1. Clonar a sequência codificadora (CDS) de pPsaD no local de clonagem múltipla (MCS) do vector pBluescript II SK (ou qualquer outro vector similar com um promotor de T7 a montante) ^13. Purifica-se o plasmídeo (pBSK-pPsaD) usando um kit de isolamento de ADN e a sequência de verificar por sequenciação de ADN.
   NOTA: Todos estes passos empregam técnicas padrão de clonagem molecular.
2. Determinar a concentração de ADN de plasmídeo pBSK-pPsaD utilizando um espectrofotómetro ajustado para medir a absorvância a 260 nm. Dilui-se o plasmídeo para uma concentração final de 10 ng / mL.
3. Executar um 20 ul de PCR (para 35 ciclos) utilizando o plasmídeo diluída como molde. Preparar a reacção da seguinte forma: 2 ul de tampão 10 × polimerase, 2 ul de dNTPs 2 mM, 1 mL de 5 mM de iniciador directo M13 (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 uL de 5 mM de iniciador reverso de M13 (5 '-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 uL diluído plasmídeo pBSK-pPsaD, 1 U de Taq polimerase, e água destilada para perfazer o volume total de reacção até20 uL. Utilizar um programa de PCR padrão, como se segue: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de [95 ° C, 30 seg; 56 ° C, 30 seg; 72 ° C, 30 seg); e 72 ° C, 5 min.
4. Executar 5 uL do produto de PCR em um 1% (w / v) em gel de agarose em tampão TAE (Tris-HCl, pH 7,6, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM) para verificar a amplificação correcta do ADNc, e quantificar a relevante banda em relação aos padrões para confirmar a concentração. Armazenar o resto do produto à temperatura de -20 ° C para outras aplicações.
5. Prepara-se uma reacção de 50 uL utilizando um sistema de reticulócitos de coelho lisado com base livre de células de transcrição / tradução compatíveis com o ADN de PCR, como se segue: 40? L de lisado de reticulócitos de o sistema de transcrição / tradução, 2,5 mL radiomarcado ^[35S] metionina, 11 uCi / ml (actividade específica:> 1000 Ci / mmol), água destilada estéril 2,5 mL, e 5 uL do produto de PCR pPsaD (100-800 ng).
   Cuidado: Use luvas, roupas de laboratório e glas de segurançases ao manusear material radioativo. Monitorar e descontaminar a superfície de trabalho e equipamentos. Eliminar todos os resíduos radioactivos numa recipiente de resíduos aprovado.
6. Incubar a mistura reaccional durante 90 min num banho de água a 30 ° C. Parar a reacção colocando a amostra em gelo.
7. Retirar 1 mL de reacção como uma amostra de ensaio (o mesmo volume também podem servir como um controle de entrada para o passo 5.7) para a verificação padrão em electroforese em dodecil sulfato de sódio poliacrilamida gel (SDS-PAGE) seguido por autorradiografia, ou fluorografia de imagem de fósforo. Um bom resultado é indicado pela observação de uma banda distinta e forte correspondente ao peso molecular de pPsaD (~ 23 kD). Armazenar o resto da reacção a -80 ° C para outras aplicações.

3. Isolamento cloroplastos

1. Prepare as seguintes soluções de:
   1. Preparar tampão de isolamento cloroplastos (CIB, 2x): 0,6 M de sorbitol, 10 mM de cloreto de magnésio_(MgCl2), Etileno Glicol 10 mM de ácido tetra-acético (EGTA), ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (EDTA), bicarbonato de sódio 20 mM (NaHCO _3), 40 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico (HEPES) ; acertar a pH 8,0 com KOH. Preparar 2 L de 2x CIB, fazer alíquotas e mantê-las a -20 ° C para armazenamento a longo prazo, ou a 4 ° C para armazenagem de curta duração. Para fazer 1x CIB, diluir a 2x CIB 1: 1 com água destilada; este pode ser preparado de fresco no dia do experimento de isolamento dos cloroplastos.
   2. Prepare HEPES-tampão _MgSO4 -Sorbitol (HMS, 1x): HEPES 50 mM, sulfato de magnésio 3 mM (MgSO _4), 0,3 M de sorbitol; acertar a pH 8,0 com hidróxido de sódio (NaOH). Preparar 400 mL de tampão, fazer alíquotas e mantê-las a -20 ° C para armazenamento a longo prazo, ou a 4 ° C para armazenagem de curta duração.
2. Realizar todos os seguintes procedimentos na sala de frio ou em gelo. Precool todas as soluções, dispositivos, equipamentos e rotores antes starting.
3. Prepara-se uma gradiente de densidade contínuo através da mistura de 13 mL de Percoll, 13 mL de tampão 2x CIB, e 5 mg de glutationa em um tubo de centrífuga de 50 mL, e centrifugação da mistura a 43000 × g durante 30 min (freio desligado) a 4 ° C. Após centrifugação, o tubo lidar com o cuidado de evitar a perturbação do gradiente e mantê-lo em gelo para uso posterior.
4. Transferir 100 mL de 1x CIB por genótipo / condição para uma proveta de 1 L.
   1. Retire as mudas a partir do meio líquido por depósito-los em uma peneira, e transferi-los para outro recipiente contendo CIB; em seguida, lavar o tecido com o CIB para remover qualquer meio líquido residual antes de a substituir com 100 mL de CIB fresco.
5. Para homogeneização, use um total de 100 mL de 1x CIB por amostra em cinco rodadas consecutivas de homogeneização, cada rodada utilizando 20 mL de CIB fresco realizada em um copo de 50 mL.
   1. Para a primeira rodada de homogeneização, transferir o tecido da planta para o copo de 50 mL à mão, permitindo que otampão exploração anterior a escorrer por entre os dedos. Tente usar a maior parte do tecido na primeira rodada, mas certifique-se que está imerso com tampão; se isso não for possível, apresente o tecido restante no segundo turno.
6. Coloque sonda do homogeneizador de tecidos no tecido e homogeneizar com dois impulsos de 1 - 2 s cada. Filtra-se o homogenato através de duas camadas de pano de filtração em um tubo de 250 ml de centrífuga por compressão gentil. Reter o filtrado, e transferir o tecido de volta para a proveta de 50 ml.
7. Coloque um segundo 20 mL CIB alíquota para o copo de 50 mL, adicionando qualquer tecido restante não utilizado na primeira rodada de homogeneização, e repita os passos de homogeneização e filtração. Assim, repetir os passos 3.5 e 3.6, até que toda a 100 mL de CIB foi usado para cima (isto é, 5 alíquotas de 20 ml) e combinam-se os filtrados resultantes.
8. Centrifugar o homogeneizado reunidas em 1000 x g durante 5 min (freio em) a 4 ° C, e deitar forao sobrenadante imediatamente após a conclusão da centrifugação, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Ressuspender o sedimento no sobrenadante residual deixado no tubo suavemente se agita o tubo em gelo. Não ressuspender vigorosamente por pipetagem ou vórtex.
9. Suavemente transferir o homogeneizado para o topo do gradiente de densidade contínuo pré-construídos, utilizando uma pipeta de Pasteur para aplicá-lo através da parede do tubo de recepção. Evitar perturbar o gradiente. Centrifugar em um rotor de balde a 7800 × g durante 10 min (freio desligado) a 4 ° C.
   NOTA: Duas bandas verde pode ser visto no gradiente após centrifugação: a banda inferior contem de cloroplastos intactos, e a banda superior contém cloroplastos quebradas.
10. Descartar a banda superior por pipetagem, e, em seguida, transferir a banda inferior com uma pipeta de Pasteur, para um novo tubo de centrífuga de 50 ml, mantendo um volume de até 8 mL por gradiente.
11. Adicionar ~ 25 mL de 1x tampão HMS para dentro do tubo e inverter o tubo, duas vezes tO lavar o Percoll a partir dos cloroplastos. Colocar o tubo de novo no rotor de balde e centrifugar a 1000 x g durante 5 min (freio em) a 4 ° C.
12. Decantar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento em cloroplastos HMS residual deixado no tubo suavemente se agita o tubo em gelo. Adicionar um adicional de 100 - 300 ul de HMS, se necessário (com base no tamanho do grânulo e a contagem no ponto 4), mas não tente para diluir a amostra muito.
    1. Mantenha os cloroplastos no gelo. Cada vez antes que os cloroplastos são usados ​​para aplicações a jusante, agite o tubo para ressuspender-los. Sempre use uma ponta de corte pipeta (com um pore ampliado) para transferir os cloroplastos.

4. Análise do Rendimento e intacto dos cloroplastos

1. Adicionar 5 uL de cloroplastos isolados de 495 ul de tampão de 1x HMS em um tubo de 1,5 ml, e, em seguida, misturar suavemente por inversão do tubo para obter uma diluição de 1: 100.
2. Place uma tampa de vidro na parte superior da câmara de contagem de hemocitómetro. Lentamente pipeta ~ 40 - 60 mL da suspensão diluída de cloroplasto para dentro do intervalo entre o vidro de cobertura e a câmara de contagem. Usando um microscópio de contraste de fase com uma objetiva de 10X ou 20X, cloroplastos intactos olhar em volta e luminosos e estão rodeadas por um halo de luz.
   NOTA: Sob o microscópio, há uma área de ² 1 mM de contagem com 25 quadrados grandes, cada uma contendo 16 quadrados pequenos no centro da câmara de contagem.
3. Contar o número de cloroplastos em 10 grandes praças. O número de cloroplastos por grande praça deverá média entre 10 e 30. Se for muito poucos ou muitos cloroplastos estão presentes, ajustar o fator de diluição (passo 4.1 acima) nesse sentido, e repita o procedimento.
4. Calcular o número de cloroplasto por mL (concentração) como se segue: N (o número médio de cloroplastos por quadrado grande calculado no passo 4.3) x 25 (número total de quadrados grandes) × 100 (o factor de diluição) x 10 ⁴ (fator de escala para expressar os dados por 1 ml, uma vez que o volume acima dos 25 quadrados é de 0,1 mm ^3).
5. Calcular o rendimento real de cloroplastos multiplicando a concentração por o volume de suspensão de cloroplastos obtido no passo 3.12. Normalmente, mais de 50 × 10 ⁶ cloroplastos pode ser obtido.

5. cloroplastos Import Protein

1. Prepare as seguintes soluções de:
   1. Preparar tampão 10x HMS: HEPES 500 mM, MgSO ₄ 30 mM e sorbitol 3,0 M; acertar a pH 8,0 com NaOH. Preparar 50 ml deste tampão, alíquota, e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo e a 4 ° C para armazenagem de curta duração.
   2. Prepare Import tampão de paragem: EDTA 50 mM dissolvido em tampão 1x HMS. Prepare 50 mL deste tampão, alíquota, e armazenar a -20 ° C.
   3. Prepare 2x tampão de carga de proteína: Tris-HCl a 60, pH 6,8, 10% (v / v) de glicerol, 2% (w/ V) de SDS, 0,005% (w / v) de azul de bromofenol. Adicione 50 ml e armazenar a 4 ° C. Imediatamente antes da utilização, adicionar 100 mL de 1 M de 1,4-ditiotreitol (DTT) a 900 uL de tampão.
2. Para executar um tempo de curso com 3 pontos de tempo, preparar 3 tubos contendo cada uma alíquota de 130 mL de tampão de paragem de importação, e deixá-los no gelo. Prepare uma reação de importação de 450 mL em um tubo de 2 mL (por genótipo / condição). Descongelar todos os ingredientes, imediatamente antes de usar.
   1. Para uma reacção de importação, geralmente usam 10 × 10 ⁶ cloroplastos num volume mL; Por exemplo, se a concentração do cloroplasto é de 2,5 x 10 ⁸ / mL, usar 40 ul de suspensão de cloroplastos. Três pontos de tempo terá 3 × Um mL (ou seja, 120 mL em nosso exemplo).
   2. Misturar os componentes reacções em gelo na seguinte ordem: água destilada (para perfazer o volume total de 600 mL), tampão B pL de 10x HMS (em que B = [600-3 × A] / 10; isto é, 48 no nosso exemplo), 12 mL1M de ácido glucónico (sal de potássio), 6 mL de 1 M NaHCO _3, 6 mL de 20% (w / v) BSA, 30 ul de adenosina 100 mM de 5'-trifosfato de sal de magnésio (MgATP), 24 uL de metionina 250 mM (não marcado radioactivamente ), e 30 mL precursor da proteína. Imediatamente antes de iniciar a reação de importação, adicionar 3 × Um mL de cloroplastos e misture delicadamente tocando no tubo.
3. Incubar o tubo de reacção a 25 ° C num banho de água a menos de 100 umol · · m ^{- 2} s ^{- 1} luz. agite ocasionalmente os tubos para voltar a suspender cloroplastos.
4. Para realizar um tempo de curso, retirar 130 mL alíquotas a partir da reação no momento de pontos necessários dentro da faixa linear de importação, o que para pPsaD é de até ~ 12 min (4, 8 e 12 mínimo de pontos de tempo são adequados nesse caso). O período de intervalo linear pode variar para diferentes proteínas ^14. Assim, sugere-se a pré-proteina testar cada indivíduo antes para optimizar tEle aponta tempo.
5. Imediatamente após a retirada, transferir cada alíquota de 130 ul a um tubo de tampão de paragem de importação gelada, misture delicadamente tocando no tubo, e manter todos os tubos em gelo até que o tempo de curso foi concluído.
6. Centrifugar as amostras durante 30 segundos a 12.000 x g numa microcentrífuga, descartar o sobrenadante por pipetagem, e peletes de ressuspender em 15 ul de 2x tampão de carga de proteína por vórtice.
7. Analisar todas as amostras mais o controlo de entrada pPsaD (contendo pPsaD equivalente a 10% da quantidade adicionada a cada reacção de importação, a partir do passo 2.7) pelo padrão de SDS-PAGE e auto-radiografia, ou fluorografia de imagem de fósforo ^15. Usar a imagem de software de análise de quantificar e analisar os resultados. Para fornecer uma indicação da eficiência da importação, a quantidade de proteína importada em diferentes genótipos / condições pode ser avaliado medindo-se a radioactividade associada a cada banda madura.

Resultados

Um exemplo experimento proteína do cloroplasto importação com 3 pontos de tempo é mostrado na Figura 1. PSAD é um componente de ~ 18 kD do fotossistema I exposta ao estroma, com uma forma precursora de 23 kD, ~ ^16. AASI foi selecionado aqui para o ensaio de importação de proteínas in vitro, porque seus níveis de estado estacionário são elevados no mutante SP1, em relação ao WT, sob condições de estresse, sugerindo uma mudança na sua eficiência de importação no mutante ^3. O mutante SP1 carrega um defeito em um importante regulador do cloroplasto máquinas de importação de proteína - a proteína SP1 ^3. Para cloroplastos isolados a partir de plantas crescidas sob condições normais, não havia nenhuma diferença óbvia na importação pSAD entre SP1 e WT (dados não mostrados) ^3. No entanto, utilizando os métodos descritos aqui para avaliar pSAD importação para cloroplastos isolados de osmoticamenteplantas estressadas, foi detectada uma diferença clara. Enquanto nós observada a acumulação da forma da proteína madura de uma forma dependente do tempo com ambos os genótipos, a taxa de importação foi significativamente mais baixa para os cloroplastos WT do que para os cloroplastos sp1 (Figura 1), o que é consistente com os nossos resultados anteriores ^3, e revela um papel importante para a proteína SP1 na regulação da importação para o cloroplasto de pSAD sob condições de stress.

Figura 1. Uma proteína Import Ensaio realizado utilizando cloroplastos isolados de plantas cultivadas em condições de estresse osmótico. Cloroplastos foram isolados a partir de uma WT 10 dias de idade (Col-0) e um SP1 mutantes plantas de Arabidopsis cultivadas sob condições de estresse (manitol 200 mM) durante 2 d. Importação (A) A proteína foi conduzida utilizando ^[35 S] -metpPsaD e deixada prosseguir durante 4, 8 e 12 minutos antes da análise por SDS-PAGE e de imagem de fósforo marcado com hionine. Foi analisada em paralelo, o pPsaD controle de entrada 10% compreendendo a proteína traduzida in vitro (IVT). O precursor (pré) e maduro (MAT) formas de pPsaD estão indicadas, enquanto entre existem duas bandas que provavelmente correspondem a produtos de tradução truncadas ou proteolisada porque a sua intensidade não se alterou durante o curso de tempo (*). (B) Para comparar as taxas de importação para os cloroplastos de plantas WT e SP1 cultivadas sob condições de estresse, a intensidade de cada banda correspondente à proteína madura importado em A foi quantificada. Todos os dados são expressos como percentagens da quantidade de proteína importada nos cloroplastos de plantas WT após 12 min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Recentemente, mostrou que a importação de proteínas de cloroplastos pode ser regulada activamente pelo estresse, que é crítico para a função do cloroplasto e da planta de sobrevivência ^3. Nesse estudo, para monitorar essa regulamentação, modificamos nosso isolamento dos cloroplastos e em procedimentos de ensaio in vitro de importação, a fim de permitir avaliar a capacidade de importação de plantas cultivadas sob condições de estresse. Os resultados indicaram um papel importante para o SP1 na regulação de importação de proteína do cloroplasto.

Ensaios in vitro de importação convencionais usam plantas cultivadas em MS padrão de meio de agar ^6,17,18. No caso de o mutante SP1 descrito aqui, tais ensaios convencionais não revelou quaisquer diferenças de proteínas em relação a importação para o WT ^3. No entanto, o papel do SP1 na regulação da importação da proteína é claramente revelado quando a importação de proteínas é avaliado sob condições de stress, utilizando os métodos aqui descritos (Figura 1). Embora may não ser possível comparar directamente os dados de importação a partir do ensaio condições de estresse com os obtidos a partir de ensaios convencionais (como os métodos empregam plantas cultivadas em cultura líquida e em meio agar, respectivamente), as comparações entre condições de estresse e não estresse são viáveis, desde que as plantas são cultivadas no mesmo meio de cultura líquido, com ou sem factores de stress.

Comparado com o tratamento de stress em meio de agar, de cultura líquido é mais conveniente para o tratamento de um grande número de plantas necessários para os ensaios in vitro de importação. Além disso, facilita uma aplicação uniforme do estressor a todas as plantas, o que é particularmente importante para os tratamentos de curto prazo do stress. O método aqui apresentado tem sido aplicado para estudar a tensão osmótica usando o tratamento de manitol, mas poderia ser facilmente adaptado para uma vasta gama de outros tipos de stress; por exemplo, estresse salino de curto prazo e estresse oxidativo, para o qual os estressores correspondentes poderia be aplicado da mesma forma através de meio MS líquido. Para outros tipos de estresses, sugerimos o grau de estresse é primeiro otimizado; excessivamente tratamentos graves podem ter efeitos adversos sobre o rendimento e / ou competência de importação das organelas isoladas.

Há vários passos importantes no âmbito do protocolo a que se deve prestar uma atenção especial, como detalhado abaixo.

A concentração óptima de ágar para o meio MS pode diferir (0,6-0,9%, w / v) dependendo do fabricante. Assim, recomenda-se empiricamente para optimizar a concentração de ágar antes de iniciar as experiências. O meio não deve ser tão suave que ele adere ao tecido na etapa de colheita (passo 1.9), também não deve ser tão difícil que inibe o desenvolvimento das raízes das plantas. A concentração de sacarose também pode ser ajustada de acordo com as plantas utilizadas. Quando se trabalha com os mutantes particularmente doentes, meio MS suplementado com 2-3% (w / v) de sacarose pode ajudar as plantas a crescer melhor. quando appencontrando-se os tratamentos de estresse, não é bom para transferir plantas muito antigas ao meio líquido (por exemplo,> 14 dias de idade). Isso ocorre porque as raízes mais desenvolvidas de plantas mais velhas são mais facilmente danificados durante a transferência.

No que diz respeito ao sistema de transcrição / tradução, existem 2 sistemas principais: os baseados no germe de trigo, e aqueles que se baseiam em reticulócitos de coelho. Esses kits podem utilizar diferentes modelos, tais como os plasmídeos linearizados, plasmídeos unlinearized, ou produtos de PCR. Os kits também são específicos para os promotores T3, T7, SP6 e. Note-se que o kit recomendamos aqui só é adequado para utilização com produtos de PCR e o promotor de T7. No entanto, por razões desconhecidas, alguns pré-proteínas radiomarcadas feitas com este sistema pode não funcionar de forma eficiente no ensaio de importação; Em tais casos, pode-se considerar um sistema de tentar extracto de gérmen de trigo ou de um sistema de lisado de reticulócitos de significado para modelos de plasmídeo. Também se pode melhorar o resultado da transcrição / tradução reação, modificando as condições de reacção de acordo com o manual do fabricante.

É importante para iniciar o isolamento dos cloroplastos de manhã cedo (ou no início do ciclo de luz da câmara de crescimento), a fim de evitar a acumulação de amido no interior dos cloroplastos devido à fotossíntese, que pode dificultar o isolamento de organelos intactos. O processo de isolamento cloroplasto tem de ser feito rapidamente, sem atrasos desnecessários, e os cloroplastos isolados devem ser mantidos sempre frio. Esta é a atenuar a observação de que cloroplastos isolados perderá gradualmente a sua viabilidade, o que não é bom. Se estiver usando CIB recém-descongelado ou tampão HMS, certifique-se de misturar o tampão antes de usar para obter uma solução homogénea. As condições óptimas para a homogeneização do material vegetal foram estabelecidas empiricamente, e pode variar se um homogeneizador de tecidos diferente é usado.

Se os diferentes genótipos de plantas contêm Similar os níveis de clorofila, clorofila quantificação pode ser utilizado como uma forma alternativa para normalizar as amostras antes de conduzir os ensaios de importação. A clorofila pode ser determinada espectrofotometricamente a seguir a extracção de uma amostra dos cloroplastos isolados em 80% (v / v) de acetona aquosa ^19,20. No entanto, se as taxas de plantas de importação que mostra diferentes teores de clorofila (por exemplo, mutantes com fenótipos cloróticas) estão a ser comparadas, utilizar o número de cloroplasto contando para normalizar as amostras de cloroplastos nos ensaios de importação. É particularmente importante para ressuspender os cloroplastos completamente no passo 3.11. ressuspensão insuficiente pode deixar agregados de cloroplastos, o que tornará difícil a contagem números com precisão e, portanto, irá dificultar o carregamento correto em reações de importação. Se a agregação grave é visto sob o microscópio (por exemplo, os agregados com> 10 cloroplasto unidas), continue a agitação da amostra cloroplasto em gelo até o aggregatES são removidos. É mais fácil de ressuspender os cloroplastos em um volume mais pequeno de tampão.

É importante estar ciente de que as reacções de importação de proteínas (Seção 5) deve ser conduzida com as devidas precauções por causa de sua natureza radioativa. precauções necessárias incluem: o uso de luvas descartáveis, roupas de laboratório e óculos de segurança, monitorização e descontaminação da superfície de trabalho e equipamentos, e eliminação de todos os resíduos radioactivos em um recipiente de resíduos aprovado. Também deve ter em mente que a pressão osmótica correcta é crítica para a manutenção da intacto do cloroplastos durante as reacções de importação, e esta é mantida principalmente pelo buffer HMS. Porque 10x HMS é viscoso, ele deve primeiro ser aquecido à temperatura ambiente, e depois bem misturados e aplicados usando uma ponteira de corte para assegurar a medição de volumes precisos. Na reacção de importação, metionina fria é adicionado para inibir a incorporação de metionina radiomarcado livre em chloropl alheiosAST proteínas através da tradução organelar durante o passo de incubação, enquanto BSA é utilizado para minimizar a proteólise, actuando como um substrato para as proteases.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Murashige e Skoog sal basal	Melford	M0221
phytoagar	Melford	P1003
2- (N-morfolino) ácido etano sulfônico (MES)	Melford	B2002
triton X-100	Fisher	BPE151-500
fita cirúrgica (por exemplo< / em>, Micropore, 3M)	3M	1530-1
papel de filtro	Fisher	FB59023
Percoll	Fisher	10607095
Ácido Etilenoglicol Tetracético (EGTA)	Sigma	E4378
ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Fisher	D/0700/53
4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico (HEPES)	Melford	B2001
(Miracloth)	Calbiochem	475855
Tubo de centrífuga de 50 mL	Fisher	CFT-595-040M
Frasco de centrífuga de 250 mL	Fisher	CFT-891-V
Polytron (e.g., Kinematica PT10-35)	Sonda Fisher	11010070
Polytron (e.g., Kinematica PTA20S)	Fisher	11030083
centrífuga (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, para tubos de 50 e 250 mL)	Beckman Coulter	B34182
rotor de ângulo fixo para 250  garrafas de mL (e.g., JLA-16.250)	Beckman Coulter	363930
rotor de ângulo fixo para 50  Tubos de mL (e.g., JA-25.50)	Beckman Coulter	363058
rotor de caçamba oscilante para tubos de 50 mL (e.g., JS-13.1)	Beckman Coulter	346963
metionina marcada radiograficamente [35S]	Perkin Elmer	NEG072002MC
sistema de tradução livre de células baseado em lisado de reticulócitos de coelho (kit TNT T7 Quick para PCR DNA)	Microscópio	L5540
(por exemplo, Nikon Eclipse 80i)	indisponível		da Nikon
(câmara Neubauer BS748 melhorada)	Hawksley Technology	AC1000	0,1 mm de profundidade, 1/400 mm2
cover	óculos VWR	16004-094	22 mm &vezes; 22 mm, espessura 0,13-0,17 mm
1,5 mL tubos de microfífugas	Sarstedt	72.690.001
Tubos de microfífugas de 2 mL Cápsulas de microfífugas	Starlab	S1620-2700
(por exemplo, Eppendorf 5415D)Eppendorf		indisponível
Nanodrop 2000 espectrofotômetro ou similar	Thermo Fisher	SPR-700-310L
ácido glucônico (sal de potássio)	Fisher	22932-2500
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	A7906
MgATP	Sigma	A9187
metionina	Sigma	M6039
azul de bromofenol	Fisher	B/P620/44
glicerol	Fisher	G/0650/17
SDS	Fisher	S/5200/53
Tris Base	Melford	B2005
ditiotreitol (DTT)	Melford	MB1015
software de análise de imagem (por exemplo, Aida Image Analyzer)	Raytest	indisponível