Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins

Summary

Este artigo descreve a quantificação de hemocitômetro e micrografias de migração/invasão por meio de dois novos plug-ins ImageJ de código aberto: Cell Concentration Calculator e migration assay Counter. Além disso, descreve os protocolos de aquisição e calibração de imagens, bem como discute em detalhes os requisitos de entrada dos plug-ins.

Abstract

O Instituto Nacional de ImageJ da Saúde é um poderoso disponível gratuitamente suite de software, processamento de imagem. ImageJ tem algoritmos de análise de partículas completas que podem ser utilizadas eficazmente para contar várias partículas biológicas. Ao contar um grande número de amostras de células, o hemocitómetro apresenta um gargalo em relação ao tempo. Da mesma forma, contando membranas a partir de ensaios de migração / invasão com o contador celular ImageJ plugin, embora precisa, é um trabalho excepcionalmente intensa, subjetiva, e famoso por causar dor no pulso. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos dois plugins dentro ImageJ para a única tarefa de hemocitômetro automatizado (ou volume conhecido) e contagem de células migração / invasão. Ambos os encaixes assentam na capacidade de adquirir micrografias de alta qualidade com o mínimo de fundo. Eles são fáceis de usar e otimizado para contagem rápida e análise de grandes tamanhos de amostra com ferramentas de análise de embutidas para ajudar a calibração de contagens. Ao combinar o princípio fundamentals de contador de células com uma análise de algoritmo de contagem e contagem de pós-automatizado, o que aumenta grandemente a facilidade com que os ensaios de migração podem ser processadas sem qualquer perda de precisão.

Introduction

Na contagem de células in vitro é uma técnica básica importante em uma ampla gama de experiências de cultura de tecido. Precisão da determinação do número de células numa cultura é essencial para a reprodutibilidade experimental e ^1,2 normalização. A contagem das células pode ser realizada manualmente utilizando um hemocitómetro, bem como utilizando uma variedade de métodos automatizados, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens ^3,4,5. A maioria dos métodos automatizados para contagem de células pertencer a uma das duas classes, os que utilizam o princípio de Coulter ou citometria de fluxo. contadores Coul....

Protocol

1. Composto Microscópio e Configurar (Calculadora Concentração celular)

1. Aumentar o brilho da lâmpada ao pleno com o botão de ajuste de luz, mudar para a lente objetiva de 4X e garantir filtros de contraste de fase são selecionadas.
   NOTA: Qualquer microscópio de contraste de fase invertida para cultura de tecidos com um fundo escuro, por exemplo, contraste de fase PHP, pode ser usado de acordo com procedimentos de microscópio e câmera padrão.
2. Dentro de software do microscópio, definir configurações de captura de imagem para os valores padrão.
   NOTA: Consulte o manual do usuário do microscópio para encontrar a localização dess....

Results

Calculadora celular Concentração

A Figura 1 apresenta o processo global de calibração CCC e aquisição de imagem contáveis. Figura 1A e 1B mostram a imagem de calibração P-quadrado e cálculo do comprimento P-quadrado em pixels. CCC determina a concentração de células num dado volume utilizando a fórmula:

Discussion

As etapas críticas, solução de problemas e limitações

A própria natureza de métodos computacionais automatizados, especificamente aqueles de análise de partículas, requer a habilidade matemática para definir essas partículas. Consequentemente, a precisão de ambos Calculator celular Concentração e contra ensaio de migração é majoritariamente dependente de fidelidade de imagem, ou seja, o quanto a imagem capturada se assemelha a membrana amostra celular ou ensaio de migração. Por isso, é da maior.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Mídia Líquida Clássica: RPMI 1640 - Com L-Glutamina	Fisher Scientific	SH3002702	Mídia de cultura celular
Soro fetal bovino (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Fornecimento de mídia
Linha celular de trofoblasto HTR8/SVneo	As células foram obtidas do Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Canadá)		O software foi projetado para funcionar com qualquer linhagem celular.
Tripsina	GIBCO BRL	27250-018	Preparado como 0,20% (p/v) em 10 µ M EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Placas de cultura de células de 10 cm	SARSTEDT	833902	Qualquer placa tratada com cultura de tecidos será adequada
Inserções de Membrana de Poliéster Transwell - 8.0  µ m Tamanho dos poros	Costar 3422 encomendado à Fisher Scientific	7200150	Para placas de 24 poços; Tamanho do poro: 8.0 µ m; 6,5 mm de diâmetro; 0,33 cm2 área de crescimento
HARLECO Corantes e reagentes de hematologia, EMD Millipore - Soluções 1, 2 e 3	EMD Millipore e encomendado de VWR	65044A, B, & O	conjunto de corantes C Hemacolor consiste em três frascos de polietileno de 500 ml (16,9 oz.) e inclui um fixador de metanol (Solução 1), um corante de eosina ou ácido (Solução 2) e um corante azul de metileno ou básico (Solução 3)
Aplicador com ponta de algodão	Puritan Medical	806-WC
Lâminas de barbear industriais de borda única	VWR	55411 - 055	Espessura: 0,30 mm (0,012")
Lâminas de microscópio - Pré-limpas/Simples	Fisher Scientific	12550A3	Dimensões: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Retângulos no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Espessura: 0.13 a 0.17 mm; Tamanho: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Microscópio de dissecação estéreo	Leica Microsystems		O microsope está equipado com a câmera de microscópio Leica Modelo MC170 HD e o software da câmera é Leica App. Suite (LAS E2) Versão 3.1.1 [Compilação: 490]. Peças de microscópio:  LED3000 Iluminação de Luz de Spot Modelo: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90  mm Modelo: MOB306 & Objetiva acromática 0.32X, WD=303  mm Modelo: MOB315, Objetiva de Vídeo 0.5X Modelo: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Alemanha		0,100 mm Profundidade - 0,0025 mm2
Olympus microscópio de luz invertida	Olympus Corporation	CKX41SF	O microsope está equipado com Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & software da câmera é Infinity analyze Versão 6.5.2
Gabinete de fluxo laminar 1300 Series A2	Thermo Scientific	Modelo: 1375	Qualquer gabinete de fluxo laminar para trabalho de cultura de células será adequado
Incubadora de cultura celular	Thermo Scientific	Modelo: 370	Qualquer incubadora de cultura de células será adequada - As células foram cultivadas em ambiente umidificado, 5% CO2, 37 ° C
ImageJ	NIH	Versão 1.50e	Versão mínima necessária
Java Runtime Environment	Oracle	Versão 1.8.0_66	Versão mínima necessária