Um protocolo para rastrear a atividade endócrina em extratos orgânicos de amostras de água, incluindo efluentes de águas residuais tratadas e águas superficiais (receptoras), foi adaptado usando bioensaios de transativação in vitro com prisão por divisão ("congelamento e descongelamento") disponíveis comercialmente.
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Artigo de método
Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em bioensaios de transactivação in vitro mostraram promissores como ferramentas de monitoramento de qualidade da água, no entanto a sua adopção e aplicação generalizada tem sido dificultada em parte devido à falta de métodos padronizados e disponibilidade de tecnologia robusta, fácil de usar. Neste estudo, as linhas celulares, prendeu-divisão comercialmente disponíveis foram utilizados para rastrear quantitativamente para a actividade endócrina de produtos químicos presentes em amostras de água de interesse para os profissionais de qualidade ambiental. Um protocolo único, padronizado, que incluiu garantia de qualidade / controlo de qualidade (QC / QA) controlos foi desenvolvido para actividade de estrogénio e Receptor de Glucocorticóides (ER e GR, respectivamente), utilizando um ensaio baseado em células de Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (TERF). Amostras de efluente tratado municipal de águas residuais e das águas superficiais de sistemas de água doce na Califórnia (EUA), foram extraídos utilizando extração em fase sólida e analisados para a atividade endócrina usando o proto padronizadocol. Antecedentes e dose-resposta para as substâncias químicas de referência específicos do endpoint conheceu diretrizes QA / QC consideradas necessárias para a medição confiável. A resposta de rastreio de bioensaio para as amostras de água de superfície não foi detectável em grande parte. Em contraste, amostras de efluentes de estações de tratamento secundário teve a maior actividade mensurável, com concentrações equivalentes bioensaios estimado (BEQ) até 392 ng dexametasona / L para o GR e 17 ng 17β-estradiol / L para ER. O bioensaio de resposta para uma amostra de efluente terciário foi menor do que o medido para os efluentes secundários, indicando uma residual menor de produtos químicos activos endócrinos após o tratamento avançado. Este protocolo mostrou que em bioensaios de transactivação in vitro que utilizam comercialmente disponíveis, células preso por divisão "kits", pode ser adaptado para o rastreio de actividade endócrina em água.
Introdução
monitoramento da qualidade da água corrente baseia-se na capacidade de medir com precisão e precisamente a ocorrência de contaminantes químicos como um proxy para a exposição a animais selvagens e seres humanos. No entanto, esta monitorização química-by-químicas e paradigma de avaliação não pode manter o ritmo com o universo química em constante mudança que enfrentamos. À medida que aprendemos mais sobre o destino e os efeitos dos produtos químicos sintéticos e naturais, continuamos a procurar instrumentos de medição que tratem esperados impactos biológicos, e que ao mesmo tempo são imunes às mudanças na produção de químicos, uso e entrada ambiental. Tais ferramentas....
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Protocolo
1. Recolha e da Amostra de Água de Processo (Modificado de Escher et al. 9)
- Encha uma garrafa de vidro âmbar 1 L limpo contendo 1 g de azida de sódio e 50 mg de ácido ascórbico ao topo com amostra de água de interesse. amostra Armazenar a 4 ° C e processo dentro de 72 h.
NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico e devem ser manuseados com cuidado. Use equipamento de proteção (para os olhos / rosto, luvas, roupas) e pesar em um fume-hood que funcione correctamente. Não use uma espátula de metal para pesagem. - Fazer passar a amostra através de um filtro de fibra de vidro de 1,6 uM e, em seguida, através de um cartucho de p....
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Resultados
No presente estudo, foram selecionadas amostras de 4x 24 hr compostas de efluentes de águas residuais municipais tratadas, 6 amostras de caçamba de águas de superfície de sistemas de água doce no sul da Califórnia e um campo em branco que consiste em água ultrapura para ilustrar este protocolo. 3 das amostras 4 de efluentes eram de plantas convencionais de tratamento de lamas activadas de águas residuais ( "efluente secundário"), e o quarto a partir de uma estação de tratamento.......
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Discussão
A potência bem documentado de estrogênios ambientais, tais como 17β-estradiol (E2), triagem mandados para esses produtos químicos em / L concentrações ng 23,24. Neste estudo, a resposta ER para os efluentes de águas residuais (gama BEQ: 2,3-17 ng E2 / G) era um pouco mais elevada do que a relatada para o efluente secundário de ETAR Australiana 20, ao passo que os BEQ para as águas superficiais (<0,5 a 4 ng E2 / G ) estavam dentro da faixa relatada para a superfície e águas pluviais em outros lug.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O financiamento foi fornecido pelo Conselho Estadual de Controle de Recursos Hídricos (Acordos nº 10-096-250 e 14-090-270). Agradecemos a S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi e J. Printen. Os autores declaram não haver conflito de interesses, e a referência a nomes comerciais não implica endosso.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de ensaio GeneBLAzer ER alpha DA | O kit ThermoFisher | K1393 | inclui células presas por divisão ER (DA) e kit de carregamento LiveBLAzer FRET. |
| Kit de ensaio GeneBLAzer GR DA O kit | ThermoFisher | K1391 | inclui células presas por divisão GR (DA) e kit de carregamento LiveBLAzer FRET. |
| Reagente de viabilidade celular PrestoBlue | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% em PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Também disponível na ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Embalado individualmente, estéril com tampa |
| Filtros de fibra de vidro Whatman, GF/A, 1.6 µ M | Sigma-Aldrich | ||
| Filme de vedação de alumínio Microplate | E & K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB cartucho de 6 cc, sorvente de 200 mg | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ácido ascórbico | Fisher Scientific | A61-100 | Também disponível na Sigma-Aldrich |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Solventes de grau molecular |
| (acetona, hexano, metanol) | Fisher Scientific | HPLC grau | |
| Azida de sódio | Sigma-Aldrich | S2002 | é altamente tóxico e deve ser manuseado com cautela. Use roupas de proteção e pese sob um exaustor. Também disponível na EMD Millipore. |
| Contador de células automatizado ou hemocitômetro | Vários* | Os fornecedores incluem Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich e ThermoFisher. | |
| Gabinete de segurança biológica Classe II | Vários* | ||
| CO2 incubadora | Vários* | ||
| Congelador criogênico | Vários* | Recomenda-se o armazenamento de nitrogênio líquido. | |
| Leitor de microplacas de fluorescência | vários* | O leitor deve ter recursos de leitura inferior. | |
| * Nenhuma fonte recomendada, a escolha deste equipamento depende do orçamento, frequência de uso e espaço do laboratório. |
Referências
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrin....
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Reimpressões e permissões
Etiquetas
Bioensaio de Transativa o In VitroTriagem de Atividade End crinaMonitoramento da Qualidade da guaEnsaio do Receptor de Estrog nioEnsaio do Receptor de Glucocortic ideTransfer ncia de Energia por Resson ncia de Fluoresc nciaExtra o em Fase S lidaC lulas com Divis o InterrompidaConcentra o Equivalente ao BioensaioGarantia de Qualidade e Controle de Qualidade
