Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

Rajiv W. Jain; Amy K. Dang; Steven M. Kerfoot

doi:10.3791/54727

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Artigo de método

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

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DOI:

10.3791/54727

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27 de outubro de 2016

Rajiv W. Jain¹ , Amy K. Dang¹ , Steven M. Kerfoot¹

¹Department of Microbiology and Immunology, Western University

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo simples usando apenas equipamentos básicos de laboratório para gerar e purificar grandes quantidades de uma proteína de fusão que contém glicoproteína de oligodendrócitos de mielina de camundongo. Esta proteína pode ser usada para induzir encefalomielite autoimune experimental impulsionada por células T e B.

Resumo

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica do sistema nervoso central (SNC), que se acredita ocorrer como resultado de respostas autoimunes direcionadas à mielina. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo animal mais comum de doença autoimune do SNC e é tipicamente induzida por imunização com peptídeos curtos que representam epítopos de células T CD4⁺ imunodominantes de proteínas de mielina. No entanto, as células B reconhecem a proteína não processada diretamente, e a imunização com peptídeo curto não ativa as células B que reconhecem a proteína nativa. Como ensaios clínicos recentes de terapias de depleção de células B na EM sugeriram um papel para as células B na condução de doenças em humanos, há uma necessidade urgente de modelos animais que incorporem o reconhecimento de células B do autoantígeno. Para este fim, geramos uma nova proteína de fusão contendo o domínio extracelular da versão de camundongo da glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG), bem como fusões N-terminais de uma marca His para fins de purificação e a proteína tiorredoxina para melhorar a solubilidade (_etiqueta MOG). Um local de clivagem da protease do vírus da corrosão do tabaco (TEV) foi incorporado para permitir a remoção de todas as sequências de marcação, deixando apenas o domínio extracelular MOG_1-125 puro. Aqui, descrevemos um protocolo simples usando apenas equipamento de laboratório padrão para produzir grandes quantidades de_etiqueta MOG pura ou MOG_1-125. Este protocolo gera consistentemente mais de 200 mg de proteína_{MOG tag}. A imunização com_{a etiqueta} MOG ou MOG_1-125 gera uma resposta autoimune que inclui células B patogênicas que reconhecem o MOG nativo do camundongo.

Introdução

A esclerose múltipla é uma doença humana caracterizada pela inflamação crónica e neurodegeneração do SNC, que é pensado para ser impulsionado por uma resposta auto-imune dirigida à mielina. A perda de mielina e axônios ao longo do tempo como resultado a redução gradual da função cognitiva e motora ^1. "Encefalomielite autoimune experimental" é um termo genérico para modelos animais de doença auto-imune dirigida para a mielina do SNC. Como MS humanos, a EAE é tipicamente caracterizada pela infiltração de células imunes do sistema nervoso central e, em alguns casos, ² desmielinização. No entanto, o grau a que um determinado modelo de EAE se assemel....