Artigo de método

Experimentos de campo de Ecologia da polinização: o caso da

DOI:

10.3791/54728

⸱

25 de novembro de 2016

 , 
1Department of Biology, Chiba University

Neste artigo

Resumo

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Para revelar a eficácia polinizador de uma determinada espécie de planta, foram desenvolvidos vários métodos de experimentos de campo. Este estudo demonstra os métodos básicos de experimentos de campo para a ecologia da polinização usando o estudo de caso de Lycoris sanguinea var. Sanguinea e do romance mecanismo de polinização, quebrando-bud polinização.

Resumo

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As interações planta-polinizador têm sido estudadas há aproximadamente cem anos. Durante esse tempo, muitos métodos de campo foram desenvolvidos para esclarecer a eficácia da polinização de cada polinizador para as flores visitadas. As observações de polinizadores têm sido um dos métodos mais comuns para identificar polinizadores, e experimentos de ensacamento e gaiola foram conduzidos para mostrar a eficácia de polinizadores específicos. Em um estudo anterior de Lycoris sanguinea var. sanguinea, seus polinizadores efetivos, as frequências de visitação de cada visitante floral e suas estratégias reprodutivas não foram identificadas. Este estudo relata a observação de que pequenas abelhas visitaram flores que estavam parcialmente abertas (botões quebrando). Até onde sabemos, esse fenômeno não foi relatado anteriormente. Além disso, este estudo investiga a hipótese de que pequenas abelhas podem polinizar nessa fase de floração. Este estudo demonstra os métodos básicos de experimentos de campo em ecologia de polinização utilizando L. sanguinea var. Observações de polinizadores e vídeos digitais mostraram as frequências de visitação de cada visitante floral. Experimentos de ensacamento e gaiola revelaram que essas flores podem ser polinizadas totalmente e que a polinização por brotos pode ser importante para a polinização dessa espécie de planta. As vantagens e desvantagens de cada método são discutidas e desenvolvimentos recentes, incluindo experimentos de laboratório, são descritos.

Introdução

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interações planta-polinizador são exemplos para o estudo da biologia evolutiva e ecologia. As relações mutualistas entre flores e polinizadores são pensados para ter promovido a diversificação das angiospermas 1,2 como resultado da seleção natural, embora outros fatores bióticos e abióticos também exerceram influência 3,4,5. Pensa-se também que os traços florais foram alterados para se adaptar aos polinizadores mais eficazes e para produzir mais frutos e sementes 6. Estas crenças foram construídos embora grandes estudos com base em diferentes índices, como a eficácia da polinização, que envolvem várias interpretações 7.

Plantas com flores que têm generalizadas sistemas de polinização são visitados por vários tipos de polinizadores 8. Aqui, um visitante flor foi definida como uma espécie animal que visitaram para obter uma recompensa floral e polinizadores foram definidos como visitantes florais que polinizam.Alguns desses visitantes transportar grãos de pólen da mesma espécie para os estigmas das flores visitadas e podem ser classificadas como polinizadores. Outros visitantes também podem ter algum pólen intra-específica; eles podem conduzir a menos de polinização devido a desajustes comportamentais ou morfológicas entre os polinizadores e as flores. Estas diferenças comparáveis na contribuição para a reprodução da planta poderia produzir diferentes graus de pressão seletiva sobre características florais 9 e pode causar a divergência adaptativa das plantas com flores. Portanto, embora a composição da comunidade de polinizadores ea abundância das espécies relativa são importantes 10, a avaliação precisa da eficácia de cada visitante também é fundamental para determinar a adaptação e / ou processos evolutivos das plantas.

Neste estudo, as estimativas quantitativas da eficiência dos polinizadores, definida como a produção de frutas e sementes por freqüência de visitas, foram determinados 11. a especificaçãoForam observadas ies e frequência de cada visitante floral, e foram estimados os efeitos reprodutivos nas flores visitadas. A gravação de visitas florais através de observações humanos é um método clássico em ecologia da polinização. No entanto, este método aplica uma grande carga sobre os observadores, que são obrigados a permanecer em frente das plantas e para tomar medições cuidadosas, a longo prazo. Recentemente, as tecnologias de filmagem e gravação têm se desenvolvido rapidamente, e câmeras de vídeo digital de baixo custo permitiram a introdução de gravação de vídeo para observações polinizadores 12,13. Estes métodos podem facilitar a recolha de informações básicas sobre os visitantes florais e poderia ajudar a desenvolver uma compreensão da ecologia da polinização de uma espécie de planta alvo.

No entanto, as frequências de visita dos polinizadores não estão necessariamente correlacionados com a sua eficácia polinização 7,14, e é importante para avaliar os efeitos qualitativos de cada polinizadorsobre a aptidão flor. Efetividade da polinização foi estimado através do número de grãos de pólen sobre os estigmas 15,16, 17,18 crescimento do tubo polínico e frutas e / ou produção de sementes 19,20. Ensacamento experimentos, conduzidos utilizando sacos de visitante exclusivo, são os métodos típicos para testar auto-compatibilidade, autogamia 21,22, ea presença de apomixia 23. Além disso, a avaliação da eficácia da polinização por um determinado polinizador na assemblage visitante tem sido frequentemente realizado em ambientes onde outros visitantes florais foram limitados (ou seja, uma gaiola de arame, rede, ou um saco com uma malha pequena o suficiente para excluir polinizadores maiores, que é set em plantas com flores). Por exemplo, experiências de ensacamento com pequenos sacos de malha foram conduzidos para revelar a capacidade polinização das formigas ou tripes 24,25. Além disso, as experiências de exclusão pássaro usando uma gaiola de arame ou rede têm mostrado os polinizadores efetivos da taxa Aloe26-28.

Os objetivos deste estudo foram: 1) para introduzir os métodos utilizados em trabalho anterior e 2) para melhorar estes métodos para o uso geral em outros estudos sobre os visitantes florais, as suas frequências de visita, e seus efeitos sobre a aptidão da planta Lycoris sanguinea var.. sanguinea é uma das espécies incluídas no gênero Lycoris, que é distribuído amplamente em todo o Japão e por pouco na Coreia 29 e tem em forma de funil laranja-avermelhado flores (Figura 1a). Um estudo anterior revelou que L. sanguinea var. sanguinea foi visitada por várias espécies de insetos, incluindo um não identificadas espécies de abelhas pequenas e as espécies maiores Amegilla florea 29. No entanto, não foram identificados a frequências de visitação e polinização eficácia destes visitantes. observações de polinizadores para a identificação de visitantes florais foram realizadas em primeiro lugar. Visitação por pequenas abelhas foi OBSErved em flores que não tinha ainda completamente abertos (quebrar gomos; Figuras 1b, c). Pequenas abelhas mudou rapidamente em torno das anteras undehisced nos botões da quebra e recolhido pólen usando suas mandíbulas. A hipótese foi de que as abelhas pequenas poderia ser polinizadores na fase de quebra-bud porque os intervalos entre as anteras e o estigma nas flores foram menores do que o comprimento do corpo das abelhas. Portanto, as experiências foram conduzidas de ensacamento para testar a capacidade de polinização das abelhas pequenas na fase de quebra-gema, e, adicionalmente, para examinar as estratégias de reprodução de L. sanguinea var. sanguinea. Estes botões foram ensacados após as pequenas abelhas visitados, o que permitiu uma estimativa da capacidade de polinização das abelhas. Os indivíduos foram enjaulado com botões fechados. Uma pequena gaiola de malha foi usada, através do qual apenas pequenas abelhas poderia passar, permitindo uma estimativa da eficiência de polinização de abelhas pequenas ao longo de todo o floestágio anel.

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Protocolo

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NOTA: Este artigo é baseado em nosso trabalho anterior 30. Algumas partes são reimpressas com permissão da Sociedade Botânica do Japão e Springer Japão.

1. Observação de flores Visitantes

  1. Seleção dos Campos de observação
    1. Pesquisar as áreas onde os materiais vegetais são distribuídos, e selecionar os locais de estudo candidato usando recursos confiáveis, tais como livros ilustrados, revistas acadêmicas, etc. Ajuste o número de locais de estudo para atender os objetivos da pesquisa (por exemplo, uma grande variedade de locais para a comparação dos visitantes florais em todo o Japão).
    2. Confira os locais das populações candidatos selecionados e as distâncias de pontos de partida relevantes, tais como institutos de pesquisa e acomodações, se for necessária investigação a longo prazo.
    3. Estimar grosseiramente cada tamanho da população por contagem do número de indivíduos de plantas numa área de unidade. Escolha grandes populações para a experiência manipuladas usando muitos indivíduos de plantas.
    4. Pré-observação dos visitantes florais
      1. Decidir que têm como alvo indivíduos em cada área será observado durante o mesmo intervalo de tempo, dependendo das densidades populacionais. Escolha 5-10 flores recém-abertas ou quebrando botões como flores-alvo, e rejeitar aqueles degradadas que já abriram.
      2. Comece a observação visual para o período de um dia inteiro, porque as flores pode ser visitado por vários polinizadores em tempo diferentes gamas 31,32.
      3. Nas folhas de registo, gravar o nome da espécie dos visitantes florais eo tempo de cada visita por hora por flor.
      4. Observar atentamente se os visitantes florais tocar as anteras e / ou estigmas; se o fizerem, gravar os visitantes como polinizadores. Se os visitantes florais só visitar as flores e não toque os órgãos reprodutivos, gravá-los como visitantes.
      5. Usando uma rede de insetos ou aspirador feitos à mão, capturar os visitantes florais para identificar epreservá-los como espécimes (Figura 1F). Mate os visitantes presas rapidamente com acetato de etilo ou a pressão dos dedos no tórax, e preservá-los em um saco macio ou em um tubo de plástico ou caso com 100% de etanol.
      6. Após a observação, identificar os nomes específicos de amostras utilizando características morfológicas ou, em caso de dificuldades na identificação, solicitar a ajuda de especialistas para cada grupo taxonômico.
  2. Observação no Campo
    1. Escolha sites de pesquisa com base na sua acessibilidade, o tamanho da população e número de visitantes florais. Escolha períodos de tempo que incluem uma amostra representativa dos visitantes florais na época de floração, e determinar os períodos de observação com base em objectivos de investigação (por exemplo, para a pesquisa sobre flutuações visitação frequência de visitantes florais, longos períodos de tempo deve ser definido).
    2. Prepare o equipamento de gravação adequado, tais como câmeras de vídeo digitais (por exemplo, para a gravação noite, câmeras de vídeo com uma função de infravermelho devem ser usados).
    3. Seleccionar as flores alvo da mesma maneira como para 1.1.4.
    4. Fixar as câmeras de vídeo para tripés de alumínio. Defina as câmeras com tripés na frente dos indivíduos visados, aproximadamente 50 cm de distância.
    5. Verificar e modificar a quantidade de luz eo foco dos materiais a tela mostra das câmeras antes de filmar.
    6. Comece a observação visual e filmagens de vídeo ao mesmo tempo para os fusos horários apropriados estimados pelo pré-observações (no caso em apreço, com períodos de observação por mais de seis horas, em média, de aproximadamente 5:00-13:00 pm ).
    7. Identificar os nomes das espécies dos visitantes e polinizadores, e gravar os seus nomes e os tempos de suas visitas nas folhas de registo.
    8. Capturar e identificar os visitantes e polinizadores da mesma maneira como em 1.1.4.5.
    9. Repita os passos 1.2.1 a 1.2.7 para cada observatioperíodo n. Defina os períodos de observação com base nos objetivos da pesquisa e os dados pré-observação.
  3. Análise de Dados Depois de Observação
    1. Identificar os nomes de espécies de espécimes capturados após a observação de polinizadores, da mesma forma como em 1.1.4.6.
    2. Verifique os clipes de vídeo e anote os nomes de espécies e seus tempos visita da mesma forma como para a observação visual.
    3. Calcular as frequências de visitação por flor por hora de cada visitante floral a partir dos dados de observação e gravação de vídeo visuais. Compare estas freqüências estatisticamente entre os locais e anos de cada visitante utilizando métodos estatísticos adequados com base em estatísticas fundamentais e usando o software adequado, tais como R, SPSS, e / ou SAS 33-35 (por exemplo, uma análise de duas vias de variância (ANOVA ) com o teste de Tukey honesto diferença significativa (HSD) em software R).

2. Ensacamento e Cage Experimentos

  1. Os preparativos para o ensacamento e Experiências gaiola
    1. Para os experimentos de ensacamento, preparar sacos que têm tamanhos de malha pequenas (~ 0,5-1 mm) e usá-los para evitar completamente flor visitação (por exemplo, não-tecidos sacos de tecido foram utilizados para os experimentos de ensacamento em 2011 e 2012).
    2. Para os experimentos de gaiola, prepare fio ou malha de plástico placas com um diâmetro que permite aos visitantes o alvo mais pequenos para passar através mas exclui os maiores, e conectar-se estas placas de malha para formar uma gaiola. Assegure-se que não existem lacunas maiores do que o diâmetro da malha. Ajustar o tamanho e a forma de gaiolas com base nas espécies de plantas alvo e números individuais.
  2. Experimentos de ensacamento
    1. Selecione 30 indivíduos por tratamento que não têm danos causados ​​por herbívoros ou de um ambiente severo. Para o tratamento, escolher uma única flor de cada planta individual ou usar flores individuais em uma única planta.
    2. saco tele alvo flores no campo após rotulando-os com fita adesiva (número de série e do alfabeto; Figura 1 g). Tenha cuidado para não tocar as anteras ou os estigmas dentro dos sacos para evitar a possibilidade de auto-polinização.
    3. Cuidadosamente corrigir sacos para as flores usando uma corda suave ou fio (Figura 1d).
    4. definir com cuidado flores individuais na posição vertical com suportes usando a corda suave ou fio para apoiar os indivíduos contra inclinação ou o colapso sob o peso dos sacos ou o vento, se necessário. Torcer ou enrolar um fio ou arame suavemente em torno da haste de uma pessoa alvo, de modo a não criar danos.
    5. Tratamentos em experimentos de ensacamento
      1. Para o tratamento "Control", anexar os rótulos para as flores alvo e realizar nenhum tratamento. Permitir que os visitantes florais de visitar livremente.
      2. Para o tratamento "de cruzamento", cobrem os seus botões até que eles flor, e em seguida, remover as anteras das flores ensacadas. Ponha um pouco de Pollen grãos de vários indivíduos sobre os estigmas.
      3. Para o tratamento "Selfing", cobrem os seus botões até que as flores abertas, e colocar pólen das mesmas flores em sua estigmas. Cobrir estas flores tratados novamente.
      4. Para o tratamento "Auto-auto", cobrir os botões com os sacos até o final do período de floração.
      5. Para o tratamento "bud Partir", identificar os botões de quebra que foram visitados e observar a entrada ou saída de pequenas abelhas (Figuras 1b, c). Retirar as anteras dos botões quebrando para evitar deposições de pólen repetida na mesma flor depois de visitação por pequenas abelhas, e saco estes botões rapidamente para evitar mais visitas.
      6. Para o tratamento "floração", saco dos botões até a etapa de abertura para evitar visitações na fase de quebra-bud. Depois disso, retire os sacos e permitir que os visitantes para coletar néctar e pólen.
      7. Para o tratamento "Bud",remover as anteras de botões fechados e outcross-los artificialmente. Saco estes botões rapidamente para evitar visitas de flores.
  3. Experimentos gaiola
    1. Cobrir os indivíduos planta alvo com gaiolas preparadas. Ajustar as posições de flores enjaulados à mão para evitar deposições de contato e de pólen entre estigmas diferente (Figura 1e).
    2. Para o tratamento "Cage", selecionar os indivíduos com botões fechados e colocar rótulos sobre eles para a identificação de flores selecionadas. Gaiola os indivíduos com botões marcados para rejeitar as influências desde antes da criação de gaiolas (ou seja, insectos florais não pode visitar botões fechados, e apenas os efeitos de insetos que visitam após a colocação de gaiolas pode ser estimado).
    3. Prenda as gaiolas firmemente no chão usando postes de ferro para impedir a entrada de visitantes entre a base gaiola e no chão.
  4. Análise de Dados After o ensacamento e Experiências gaiola
    1. Recolha todas as flores marcados no final do período de floração (Figura 1 g) por corte e separando-os dos indivíduos maternos. Preservar cada amostra marcada separadamente para evitar a sua contaminação.
    2. Verificar a presença ou ausência de frutificação em cada rotulados flower.Record os números de sementes de cada fruta em caso de configuração de frutas.
    3. Calcular a proporção de número de frutos por flor (proporção definida de frutos, definida como o número de frutas, dividido pelo número de flores) e do número de sementes por fruto maduro (razão de semente-conjunto, definido como o número de sementes dividido pelo número de óvulos) usando todos os números gravados.
    4. Estatisticamente comparar os rácios de fruto e semente-estabelecidas entre os tratamentos, utilizando métodos adequados e software, tais como os enumerados no 1.3.3 (por exemplo, one-way ANOVA com HSD de Tukey ou teste exato de Fisher no software R 33).
    5. As investigações sobre os materiais, utilizando os resultados das experiências de ensacamento
      1. Para testar a necessidade de animais polinizadores, estatisticamente comparar os resultados entre "Control" e "Auto-auto" tratamentos.
      2. Para estimar o grau de limitação de pólen, compare o "Control" e "tratamentos de fecundação cruzada".
      3. Para testar a auto-compatibilidade, compare o "Outcrossing" e tratamentos "autofecundação".
    6. As avaliações das influências do quebra-bud polinização
      1. Compare o "controle" e tratamentos "botão" para determinar se os estigmas das gemas quebrando são reprodutivamente maduros e se o valor do tratamento "Control" pode ser usado para o controle na fase de quebra-bud.
      2. Compare o "Auto-auto" e tratamentos "Quebrando Bud" para determinar se o sucesso reprodutivo de flores polinizadas com pequenas abelhas na quebrafase -bud é estatisticamente maior do que o das plantas que executam autogamia (isto é, para testar a existência de polinização quebrar broto-). Depois disso, comparar esses dois tratamentos com o "Control" para estimar as eficiências de polinização de polinização quebra-bud.
      3. Compare o "Breaking bud", "Gaiola", e "" tratamentos de floração para estimar as influências reprodutivas de polinização quebra-bud.

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Resultados

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Cinco populações foram selecionados para observações polinizadores. Na fase de pré-observação, visitas de várias espécies de insetos a flores de abertura e pequenas abelhas ao gomos quebrando foram confirmados. Observações florais visitante revelou que a maioria dos visitantes para todos os cinco locais de estudo eram indivíduos de pequenas espécies de abelhas japonicum Lasioglossum. O registo total de visita mostrou que os rácios de visita desta espécie foram mais do que 90% em...

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Discussão

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observações de flores e experimentos ensacamento foram empregados neste estudo para revelar as frequências de visitação e o sucesso reprodutivo feminino de plantas, respectivamente. Em Dafni (1992) 38, o método videotape foi eficaz porque poderia gravar o momento ea duração de visitantes para análise e evitar viés do observador. No entanto, no momento, este método necessário equipamento caro, e os tempos de observação foram limitados pela vida útil da bateria. Recentemente, o custo do equipamento para produçã...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem aos três revisores anônimos por seus comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Grant-in-Aid for JSPS Fellows (26.11613).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
folha de gravaçãoqualquerde
qualquer
qualquer
qualquerNA
100% Etanolqualquer
qualquer
qualquerNA
macio sacode qualquer
,qualquerde NA
,qualquerde NA
qualquerde NA
ou placas de malha de plásticoqualquerde
NA,qualquerde NA
,qualquer
quaisquermacios de NA
pincette(s)
rede insetos NA pooter NA acetato de etila NA tubo de plástico NA caixa de plástico NA câmera de vídeo digital de NA tripé(s) saco , fio , fio fita de rotulagem suporte de vara de NA cordas ou fios qualquer de NA, qualquer NA

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