Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Resumo

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Resumo

Mutações hereditárias ou de novo em canais seletivos de cátions podem levar à morte súbita cardíaca. A alteração no tráfego da membrana plasmática dessas proteínas transmembranares multi-spanning, com ou sem alteração no canal Assim, tornou-se crítico desenvolver um método para quantificar a mudança da expressão relativa da superfície celular dos canais iônicos cardíacos em larga escala. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para determinar a expressão relativa total e da superfície celular dos canais cardíacos de cálcio tipo L Ca_V1.2 e subunidades associadas à membrana em células tsA-201 usando ensaios de citometria fluorescente de duas cores. Em comparação com outros métodos qualitativos baseados em microscopia ou immunoblotting, os experimentos de citometria de fluxo são ensaios rápidos, reprodutíveis e de grande volume que fornecem pontos finais quantificáveis em grandes amostras de células vivas (variando de 10⁴ a 10⁶ células) com características celulares semelhantes em um único fluxo. As construções foram projetadas para expressar constitutivamente mCherry no terminal C intracelular (permitindo assim uma avaliação rápida da expressão total da proteína) e expressar um epítopo de hemaglutinina (HA) voltado para extracelular para estimar a expressão da superfície celular de proteínas de membrana usando um anticorpo conjugado de fluorescência anti-HA. Para evitar falsos negativos, experimentos também foram conduzidos em células permeabilizadas para confirmar a acessibilidade e a expressão adequada do epítopo do AH. O procedimento detalhado fornece: (1) projeto de construções de DNA (ácido desoxirribonucléico) marcadas, (2) transfecção mediada por lipídios de construções em células tsA-201, (3) cultura, colheita e coloração de células não permeabilizadas e permeabilizadas e (4) aquisição e análise de sinais fluorescentes. Além disso, os princípios básicos da citometria de fluxo são explicados e o desenho experimental, incluindo a escolha de fluoróforos, titulação do anticorpo HA e experimentos de controle, é discutido minuciosamente. Essa abordagem específica oferece quantificação relativa objetiva da expressão total e da superfície celular dos canais iônicos que podem ser estendidas para estudar bombas iônicas e transportadores de membrana plasmática.

Introdução

Este documento proporciona um ensaio fiável para relatar a expressão na superfície celular relativa das proteínas de membrana, tais como canais de iões expressos em células recombinantes que utilizam a tecnologia de citometria de fluxo existente. canais de iões são proteínas de membrana de poros de formação que são responsáveis ​​por controlar os sinais eléctricos por gating o fluxo de iões através da membrana celular. Eles são classificados pelo mecanismo de ativação, natureza, e seletividade de espécies de íon de trânsito através do poro onde eles estão localizados. Nos níveis celulares e teciduais, os fluxos de iões macroscópicas através de canais iónicos são o pr....

Protocolo

1. construções Duplamente Tagged DNA

1. Inserir o epitopo de HA (YPYDVPDYA) no ligante extracelular de Ca _V α2δ1 entre D676 e R677 por mutagénese dirigida ao local (Figura 3B) ^20. Use gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC Atacante primer e Reverso acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC primer.
2. Subclone da sequência de ADNc da HA etiquetado Ca _V α2δ1 no vector de expressão de mamífero pmCherry-N1 concebido para expressar a proteína fundida com o terminal N de mCherry entre os locais SacI e SalI (Figura 3B) ^20.
   NOTA: A função de canal apropriado precisa ser testado ....

Resultados

Este artigo descreve um protocolo fiável de quantificar a superfície total e células de canais de iões recombinantes expressas em TSA-201cells por um fluxo de duas cores ensaio de citometria. Como um exemplo, a superfície de célula relativa e expressão de proteína total foi quantificada para o _V α2δ1subunit Ca. A fim de executar o fluxo de duas cores citometria de ensaio, Ca _V α2δ1 foi duplamente marcado para expressar um epitopo de HA não fluorescente extracelular .......

Discussão

Este ensaio baseado em citometria de fluxo foi aplicado com sucesso à medição dos níveis relativos de superfície total e celular de formação de poros marcados com fluorescência e subunidades associadas de canais de cálcio dependentes de voltagem^14,22,26. É melhor usado ao investigar o impacto de mutações genéticas e, portanto, requer que a intensidade de fluorescência intrínseca da construção de tipo selvagem marcada com fluorescência seja pelo menos 10 a 100 vezes maior do que a intensidade de fluorescência d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Q5 Kit de mutagênese dirigida ao local	New England Biolabs	E0554S	Pode ser substituído pelo kit de mutagênese dirigida ao local QuickChange (Agilent, # 200523).
Tubos 1.5 ml	Sarstedt	72-690-001
Tubos 15 ml	Sarstedt	62-554-002
Pipetas de Transferência Graduadas Descartáveis	VWR	160001-192
Placa de cultura de 100 mm	Corning	430167	Para cultura padrão de células HEKT.
Placa de cultura de 35 mm	Falcon	353001	Para cultura padrão de células HEKT.
Pipeta sorológica 1 ml	Sarstedt	86.1251.001
Pipeta sorológica 5 ml	Sarstedt	86.1253.001
Pipeta sorológica 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Pipeta sorológica 25 ml	Sarstedt	86.1285.001
Meio de alta glicose Dulbecco	Life Technologies	12100-046	Quente em 37 & Graus; C banho-maria antes de usar.
Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor, origem americana	Life Technologies	16140-071
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
Lipofectamina 2000	Life Technologies	11668-019	Para transfecção lipossomal. Pode ser substituído por transfecção de fosfato de cálcio.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-070	Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
Tripsina-EDTA (1x) 0,05%, vermelho de fenol	Life Technologies	25300-062
microtubos de 1,5 ml	Sarstedt	72.690.001
Solução salina tamponada com fosfato 1x	Fisher	BP661-10	Pode ser "caseiro".
Anticorpo conjugado anti-HA FITC	Sigma	H7411
IgG1− Anticorpo de controle de isotipo FITC	Sigma	F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	Fixação/Permeabilização. Solução de permeabilização/lavagem, conservar a 4 °C.
Hemacitômetro	Fisher	49105161
Trypan Blue	Fisher	15250061	Para acessar a viabilidade celular.
Microcentrífuga Refrigerada, 5430R	Eppendorf
Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora	Fisher	370
Plataforma de Laboratório Rocker	Fisher	545034
Banho-maria	VWR	89032-216
BD FACSARIA III	BD Biosciences	648282	Citômetro de fluxo.
FlowJo Software v10	FlowJo	FlowJo v10 Dongle	Para análise de dados.

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