Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Resumo

Um método para medir a difusão de proteínas em membranas de células imunes primárias usando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é descrito. Neste artigo, o uso de anticorpos para marcação fluorescente é ilustrado.

Resumo

espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma técnica poderosa para o estudo da difusão de moléculas dentro de membranas biológicas com elevada resolução espacial e temporal. FCS pode quantificar a concentração e coeficiente de difusão molecular de moléculas marcadas fluorescentemente na membrana da célula. Esta técnica tem a capacidade de explorar as características de difusão molecular de moléculas na membrana plasmática de células do sistema imunológico em estado estacionário (isto é, sem processos que afectam o resultado durante o tempo de medição real). FCS é adequado para o estudo da difusão de proteínas que são expressas em níveis típicos para mais proteínas endógenas. Aqui, um método simples e robusto para determinar a taxa de difusão de proteínas da membrana celular em linfócitos primários é demonstrada. Uma forma eficaz de realizar medições em células vivas marcadas com o anticorpo e observações que ocorrem comumente após a aquisição são descritos. Os avanços recentesno desenvolvimento de corantes fluorescentes foto-estável pode ser utilizada através da conjugação dos anticorpos de interesse de se apropriar corantes que não lixívia extensivamente durante as medições. Além disso, esta permite a detecção de entidades difundem-se lentamente, o que é uma característica comum de proteínas expressas em membranas celulares. O procedimento de análise para extrair parâmetros de concentração e difusão molecular a partir das curvas de autocorrelação gerados é realçado. Em resumo, um protocolo de base para medições de FCS é fornecida; ele pode ser seguido por imunologistas com uma compreensão de microscopia confocal, mas com nenhuma outra experiência anterior de técnicas para a medição de parâmetros dinâmicos, tais como taxas de difusão molecular.

Introdução

Muitas funções células imunitárias dependem de difusão molecular e interacções dentro de membranas. As membranas biológicas são complexas, e muitos factores que podem ser importantes para a função de células imunes pode influenciar a velocidade de difusão de translação de proteínas dentro das membranas celulares ^1. Recentemente, mostrou que as células assassinas naturais (NK), os linfócitos que pertencem ao sistema imune inato, exibem difusão diferencial de duas proteínas estudadas na membrana celular, dependendo do estado de activação da célula NK ^2.

espectroscopia de correlação de fluoresc....

Protocolo

1. A coloração para FCS

1. Isolar células NK de murino a partir de linfócitos do baço utilizando rotulagem esférulas magnéticas, de acordo com o protocolo do fabricante ^16. Use 2-3 x 10 ⁵ culas por amostra para os passos seguintes.
   NOTA: Use de selecção negativa para enriquecer a população de células alvo, deixando-a intacta, de modo que as células podem ser marcadas utilizando anticorpos primários sozinho. Ver referência ² para obter informações mais detalhadas sobre o isolamento de células de camundongos ^2.
2. Para as células de murino que expressam receptores de ....

Resultados

Um resultado típico irá gerar uma curva de autocorrelação com um tempo de trânsito no intervalo de 10 ms para 400 ms para proteínas de membrana. O número de moléculas pode variar entre 0,5 a cerca de 200 ^ M por ² para proteínas expressas endogenamente. Verifique cuidadosamente que o CPM não é menor do que o esperado. Isto pode significar que existe uma influência do sinal de fundo. Como regra geral, o sinal de CPM de células que é aceite para a análise não deve ser inferior a.......

Discussão

Este protocolo para o FCS pode ser usada para a avaliação da dinâmica molecular de moléculas de superfície sobre todos os tipos de células do sistema imunológico (murinos, humana, ou de outras espécies). Medidas FCS dinâmica molecular espaço-temporais para baixo a resolução única molécula em células vivas. A densidade molecular, bem como a taxa de difusão e de agrupamento dinâmica das proteínas de interesse, podem ser extraídos a partir das curvas de autocorrelação.

A marcação fluorescente é.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Isolamento de Células NK MACS mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Seleção negativa de células NK
Soro Fetal Bovino	Sigma-Adlrich	F7524	Solução
salina tamponada com fosfato	-	-	Feito em casa
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Meio transparente
Clone de anticorpo 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	para bloquear os receptores Fc.
Anticorpo anti-Ly49A			Anticorpo monoclonal feito internamente e conjugado internamente ao anticorpo Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd	BD Pharmingen	558915	Conjugado internamente com MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Corante fluorescente para conjugação de anticorpos.
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920	Diluído em água destilada (1,10)
Poli-L-lisina (20 kDa) enxertado com polietilenoglicol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3,5]-PEG(2)	Diluído em PBS (pH 7,4) a 0,5 mg/ml.
Cloreto de rodamina 110	Sigma-Aldrich	432202	Coeficiente de difusão conhecido: 3,3 &vezes; 10&menos; 10 m2/seg 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Coeficiente de difusão conhecido: 4,4 &vezes; 10&menos; 10 m2/seg 20
Microscópio confocal	Zeiss	LSM510
: Confocor 3	Zeiss
: Matlab com caixa de ferramentas de ajuste de curva	Versão Matlab	R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 poços, fundo de borossilicato 1,0

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