Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Resumo

Um método para medir a difusão de proteínas em membranas de células imunes primárias usando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é descrito. Neste artigo, o uso de anticorpos para marcação fluorescente é ilustrado.

Resumo

espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma técnica poderosa para o estudo da difusão de moléculas dentro de membranas biológicas com elevada resolução espacial e temporal. FCS pode quantificar a concentração e coeficiente de difusão molecular de moléculas marcadas fluorescentemente na membrana da célula. Esta técnica tem a capacidade de explorar as características de difusão molecular de moléculas na membrana plasmática de células do sistema imunológico em estado estacionário (isto é, sem processos que afectam o resultado durante o tempo de medição real). FCS é adequado para o estudo da difusão de proteínas que são expressas em níveis típicos para mais proteínas endógenas. Aqui, um método simples e robusto para determinar a taxa de difusão de proteínas da membrana celular em linfócitos primários é demonstrada. Uma forma eficaz de realizar medições em células vivas marcadas com o anticorpo e observações que ocorrem comumente após a aquisição são descritos. Os avanços recentesno desenvolvimento de corantes fluorescentes foto-estável pode ser utilizada através da conjugação dos anticorpos de interesse de se apropriar corantes que não lixívia extensivamente durante as medições. Além disso, esta permite a detecção de entidades difundem-se lentamente, o que é uma característica comum de proteínas expressas em membranas celulares. O procedimento de análise para extrair parâmetros de concentração e difusão molecular a partir das curvas de autocorrelação gerados é realçado. Em resumo, um protocolo de base para medições de FCS é fornecida; ele pode ser seguido por imunologistas com uma compreensão de microscopia confocal, mas com nenhuma outra experiência anterior de técnicas para a medição de parâmetros dinâmicos, tais como taxas de difusão molecular.

Introdução

Muitas funções células imunitárias dependem de difusão molecular e interacções dentro de membranas. As membranas biológicas são complexas, e muitos factores que podem ser importantes para a função de células imunes pode influenciar a velocidade de difusão de translação de proteínas dentro das membranas celulares ^1. Recentemente, mostrou que as células assassinas naturais (NK), os linfócitos que pertencem ao sistema imune inato, exibem difusão diferencial de duas proteínas estudadas na membrana celular, dependendo do estado de activação da célula NK ^2.

espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma técnica que é capaz de quantificar as taxas de difusão molecular dentro de membranas biológicas. Ela reporta a taxa média de difusão de moléculas marcado por fluorescência em um volume fixo, tipicamente o foco de um microscópio confocal. Ele baseia-se na medição das flutuações em fluorescência que ocorre quando do movimento molecular emum sistema em estado estacionário. FCS tem sido amplamente utilizada para o estudo da difusão de corantes fluorescentes e de proteínas, tanto em solução como em membranas lipídicas. Outros parâmetros de saída afectam a taxa de difusão também pode ser indirectamente estudada dessa forma (por exemplo, mudanças de conformação das proteínas ou interacções das moléculas em membranas celulares) ^{3, 4.} FCS se destaca em comparação com outras técnicas, devido à sua alta sensibilidade, permitindo a possibilidade de detecção de uma única molécula. Ele funciona bem para concentrações moleculares na gama nanomolar a milimolar, o que é típico para os níveis de expressão endógenos da maioria das proteínas ^5. Além disso, FCS pode dar uma aproximação do número absoluto de proteínas dentro do volume estudadas, enquanto a maioria das outras técnicas só dão informação relativa sobre os níveis de expressão da proteína. Outros métodos para medir as taxas de difusão molecular em membranas incluem fluorecuperação rescência após a fotodegradação (FRAP), rastreamento única partícula (SPT), múltiplos pinhole FCS, e correlação imagem métodos. Métodos FRAP e correlação de imagem são técnicas de ensemble, que geralmente não dão informações sobre o número absoluto de moléculas ^10. Comparado a SPT, a taxa de transferência de FCS é maior em relação à caracterização da média da população. A análise também é menos exigente desde que a taxa média de difusão das moléculas presentes no foco do laser é medido, em vez da taxa de moléculas individuais. Além disso, a menos que microscópios especializados estão disponíveis ^11, SPT não pode dar qualquer informação sobre as concentrações, uma vez que a rotulagem padrão SPT deve ser muito baixa para permitir a identificação de moléculas individuais. Por outro lado, exige que as moléculas de FCS em estudo a ser móvel. Ele simplesmente não vai detectar eventuais frações ou moléculas imóveis putativos se movendo muito lentamente. A taxa de difusão das moléculas queresidir no foco mais do que cerca de um décimo do tempo de aquisição não serão correctamente representada nas medições FCS ^{3, 12.} Portanto, coeficientes de difusão gravadas por FCS tendem a ser mais rápido do que as taxas de difusão relatados a partir de técnicas como FRAP e SPT, onde as frações próxima do imóvel e muito lentas são levados em conta também. SPT também dará uma descrição mais pormenorizada da variação das taxas de difusão dentro da população molecular de FCS.

FCS quantifica a flutuação da intensidade de fluorescência ao longo do tempo dentro do volume animado. No caso das medições de membrana, isto traduz-se na área iluminada da membrana. Neste trabalho, nós utilizamos o fato de que essas flutuações são induzidas por moléculas que exibem difusão browniano e são, assim, mover dentro e fora do volume de excitação. Há também várias outras fontes possíveis para o fluctuações no sinal de fluorescência, tais como a piscar ou a presença de um estado tripleto nas fluoróforos, os efeitos ambientais, de ligação-unbinding do ligando, ou movimento da membrana da célula inteira. Estas fontes de erro putativos precisam ser levados em consideração ao projetar um experimento FCS, a fim de interpretar com precisão os resultados ^{12, 13.} Normalmente, as taxas de difusão lateral em membranas biológicas são baixos devido à aglomeração e interações, tanto entre as proteínas da membrana e entre proteínas e citoesqueleto. Historicamente, a utilização de FCS em membranas tem sido, assim, dificultada pela falta de fluoróforos foto-estáveis, que são necessárias para evitar o branqueamento durante os tempos de trânsito estendido através do foco de excitação ^14. No entanto, hoje em dia, há uma abundância de opções para corantes foto-estável adequados. melhorias significativas em detectores e outros equipamentos também permitem a detecção de prote fluorescenteins e corantes de brilho mais baixo. Aqui, um protocolo de base para a aplicação de FCS utilizando linfócitos primários de murino, em que a proteína de interesse é marcado com um anticorpo fluorescentemente marcado, é descrito. Uma abordagem para ajustar as curvas de autocorrelação, a fim de extrair o coeficiente de difusão e a densidade molecular também é mostrada. O protocolo visa ser facilmente seguido por imunologistas sem experiência prévia de técnicas para estudar a difusão de moléculas. No entanto, é esperado um entendimento básico de microscopia confocal (para ganhar esse entendimento básico, ver referência ^15). Este protocolo pode ser facilmente adaptado relativamente a outras células em suspensão, ambas linhas celulares e células primárias. Para os utilizadores mais experientes FCS, existem métodos de análise mais refinados, alguns dos quais são descritos na discussão.

Protocolo

1. A coloração para FCS

1. Isolar células NK de murino a partir de linfócitos do baço utilizando rotulagem esférulas magnéticas, de acordo com o protocolo do fabricante ^16. Use 2-3 x 10 ⁵ culas por amostra para os passos seguintes.
   NOTA: Use de selecção negativa para enriquecer a população de células alvo, deixando-a intacta, de modo que as células podem ser marcadas utilizando anticorpos primários sozinho. Ver referência ² para obter informações mais detalhadas sobre o isolamento de células de camundongos ^2.
2. Para as células de murino que expressam receptores de Fc, bloquear os receptores de Fc com o clone 2.4G2 anticorpo a 5 mg / mL em 25 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e soro fetal de bovino a 1% (FBS) por amostra. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
3. Preparação de mistura de anticorpo.
   1. Utilizar anticorpos directamente conjugados com um fluoróforo foto-estável. Se dois anticorpos contra duas proteínas diferentessão utilizados, fluoróforos de uso que têm espectros de emissão bem-separados para minimizar o cross-talk (por exemplo, animado com os 488 e 633 lasers ^2, no final do protocolo referido como os lasers e fluoróforos "verdes" e "vermelhos", respectivamente ).
      NOTA: Se os anticorpos comerciais marcadas com fluoróforos foto-estável não estão disponíveis para os biomarcadores seleccionados, conjugados anticorpos não marcados para os fluoróforos de acordo com as instruções do fabricante. Ver Tabela Materiais para os anticorpos utilizados neste estudo.
   2. Prepara-se uma mistura de anticorpo por diluição de anticorpos marcados fluorescentemente contra a proteína ou proteínas de interesse em PBS + 1% de FBS. Adicionar a mistura de anticorpo para cada amostra a um volume final de 50? L por amostra. Incubar em gelo durante 45 min no escuro.
      NOTA: Optimizar a concentração dos anticorpos previamente para assegurar que o anticorpo é utilizado a uma concentração saturante, tipicamente1-10 ug / ml.
4. Após a incubação, lavar as células por adição de 250 ul de PBS e centrifugar a 150 xg los durante 3 min. Descartar o sobrenadante.
5. Repita o passo 1.4.
6. Ressuspender as células em 200 ul de PBS + 1% de FBS. Manter no gelo e no escuro até aquisição.
   NOTA: As células de murino NK podem ser mantidos em gelo durante até 10 h.

2. Preparação de Microscópio Chambered lamela Slides

NOTA: Use os slides lamela câmaras ou pratos com a espessura tampa de vidro que o microscópio foi otimizado para, seja # 1 ou # 1.5. Se o microscópio não está alinhado para uma determinada espessura, ou se é desconhecida, o anel microscópio colar tem de ser optimizada para a corrente de espessura lamela ^17.

1. Dilui-se a poli-L-lisina com água destilada numa proporção de 1:10. Adicionar 200 ul de diluiu poli-L-lisina para as câmaras e incubar durante 20 min.
2. Remova oPoli-L-lisina por aspiração e deixe a câmara de ar seco, deixando-a sem uma tampa à temperatura ambiente durante pelo menos 20-30 minutos.

3. Iniciar o Sistema FCS

NOTA: Este protocolo refere-se a um sistema de microscópio e software específicos (ver Materiais / Reagentes Tabela), embora outras configurações microscopia e pacotes de software também pode ser usado.

1. Ligue o microscópio confocal de varrimento laser com o correlator FCS. Abra o software no modo "Expert". Selecione a lente de imersão em água 40X.
2. Sob a guia "Adquirir", pressione o botão "Config" e os botões de "Scan" para abrir o "Control Configuração" e as janelas "Controle de Digitalização" (janelas A e B na Figura 1, respectivamente). Sob a guia "ConfoCor", pressione "Measure" para abrir a janela "Medição" (janela C na Figura 1).
3. Crie uma pasta para salvar o FCSmedições. Iniciar um novo banco de dados de imagem, clicando em "New" na guia "Arquivo".
4. Usando o botão "Laser", ligue a lâmpada de halogéneo e os lasers relevantes para excitar o fluoróforos (por exemplo, 488 nm para o laser de excitação "verde" e de excitação 633 nm para o laser de excitação "vermelho").
5. Escolha filtros de excitação e emissão adequados e ativar os detectores correspondentes.
   1. Especificar as configurações para captura de imagem, incluindo os filtros de laser de excitação, excitação e emissão, caminho da luz e detectores para ser usado, na janela "Controle de Configuração".
   2. Da mesma forma, especifique as configurações correspondentes para as medições FCS na janela "Medição", na aba "Configuração do Sistema". Use as configurações mais semelhante possível para a imagem latente e FCS.
   3. Ative os canais de detecção para gravações de FCS, marcando a caixa "Ch1" para o channe verdel e "Ch2" para o canal vermelho na janela "Medição".
      NOTA: As definições devem ser optimizados para o fluoróforo (s) utilizados, como através de uma experiência de imagem confocal padrão. Em experiências posteriores, as mesmas configurações FCS podem ser reutilizados através da abertura de um arquivo de FCS de idade, usando o menu pull-down "ConfoCor" na parte superior da interface do usuário, e escolher "Abrir arquivo". Pressione "Reutilização" na janela de aquisição emergente. Da mesma forma, as configurações de aquisição de imagem pode ser carregado através da abertura de uma imagem salva e pressionando "Reutilização".
6. Espere até que o laser é estável antes de realizar medições FCS. Isso pode levar até 30 minutos para lasers de gás, enquanto lasers de diodo estabilizar mais rapidamente. Ajuste o pinhole enquanto espera.

4. Ajuste Pinhole

1. Prepare 0,2-0,5 mM soluções de fluoróforos ou corantes fluorescentes correspondentes à excitação e emissão espectros dos rótulos dos anticorpos. ofluoróforos deve ter sabido coeficientes de difusão ^{18, 19.}
2. Coloque uma gota de 50 ul de solução de fluoróforo excitado pelo laser verde no centro de um poço numa corrediça lamela câmaras. Coloque uma gota de água destilada no objectivo de água 40X e posicionar o slide. Pressione o botão "Mostrar" para iniciar a luz visível e usar o ocular para encontrar e concentrar-se na queda fluoróforo.
   NOTA: Use o mesmo slide como para medições celulares posteriores, uma vez que pequenas variações putativos de espessura de vidro entre os slides podem afetar o alinhamento microscópio.
3. Colocar o foco bem dentro da gota de líquido (10-100 uM a partir do fundo).
4. Na janela "Medição", selecione a guia "Aquisição". Pressione "posição atual" sob o título "Posições" (janela C na Figura 1).
5. Retornar à guia "Configuração do Sistema" na mesma janela. Definir um alto power para o laser verde.
   NOTA: Uma fonte de laser de alta potência refere-se à saturação (isto é, o sinal fluorescente não aumenta de forma linear, se a potência do laser for aumentada ainda mais). Cerca de 1 mW do sistema de configurações de poder, ou 5-10% da potência do laser max, é normalmente suficiente.
6. Testar a estabilidade do sinal com a tecla "Start". Isto irá abrir uma janela separada exibindo o traço do tempo e curva de autocorrelação para a medição atual. Verificar que o sinal fluorescente é alta, estável ao longo do tempo, e que mostram as flutuações no kHz, em vez de a Hz.
7. Selecione o botão "O Ajuste" na janela "Medição". Verifique se está seleccionado o canal de detecção de direito (CH1 ou CH2). Pressione "AutoAdjust X." Se a curva resultante não mostra um máximo clara, ou o máximo é no limite, marque a opção "grosso" e pressione "AutoAdjust X" novamente. Quando a tela, resultando em direção x estiver concluída, faça o saMinha Y pressionando "AutoAdjust Y."
8. De-selecione "grosso" e alternar entre ajustar X e Y pressionando "AutoAdjust" até que ambos têm maxima clara e os valores não estão mudando entre as medições.
9. Se as células são marcados com dois fluoróforos diferentes, mover-se para uma câmara onde foi adicionada uma solução de fluoróforo vermelho. Selecione uma fonte de laser de alta para o laser vermelho e repita os passos de 4,6-4,8 para a excitação e detecção de canal vermelho.
   NOTA: Se os valores de X e Y desviar entre os canais em sistemas onde somente uma pinhole é usado para ambos os canais de detecção, selecione valores intermediários e pressione OK para aceitar as alterações. Aqui, para o laser de 488 nm com máximos a X = 79 e Y = 189 e o laser de 633 nm com máximos a X = 80 e Y = 188, os valores de X = 80 e Y = 189 foram seleccionados. A combinação dos 488 nm e 633 nm para a excitação laser dos dois anticorpos marcados com fluoróforos excitados por 488 nm ou 633 nm é uma boa escolha, uma vez que orisco de cross-talk é minimizado se os espectros de emissão não se sobrepõem ^2.

5. Meça o tempo de trânsito do fluoróforo gratuito

Nota: por determinação do tempo de trânsito através do foco (taud) de um fluoróforo com um coeficiente de difusão conhecidos, o tamanho do volume de detecção, e, portanto, a área da membrana celular que está dentro do foco, pode ser calculada. O cálculo de taud é descrito na etapa 7.2.

1. Utilizando as mesmas soluções utilizadas para o ajuste pinhole, defina o tempo de aquisição a 30 seg x 2 repete sob a guia "Aquisição" na janela "Medição" (Figura 1, a janela C).
2. Iniciar uma medição clicando em "Iniciar" na janela "Medição" (Figura 1, a janela B).
   1. Executar uma série de potência de laser de cada laser de excitação e a correspondente fluoróforo em solução, a partir de ou pertosaturando de energia e diminuindo pela metade para cada medição. Alterar a potência do laser na aba "Configuração do Sistema" da janela "Medição" (Figura 1, a janela C). Pressione o botão "Iniciar" para iniciar uma medição.
      NOTA: Incluir a potência do laser para as medições de células próximas na faixa inferior (por exemplo, medir a 16, o poder de 8, 4 e 2 mW, antes do objetivo) ^20. regulações de laser do sistema estão em geral mais elevado do que a excitação de saída e pode variar largamente, dependendo do microscópio e a qualidade de alinhamento. Neste sistema, a faixa de potência acima corresponde a cerca de 60-500 mW de configurações do sistema de energia. É aconselhável usar um medidor de potência para medir a potência de saída antes que o objetivo da primeira vez que um novo microscópio é usado. A potência máxima atual do laser é encontrada sob o botão "Info" da janela "Medição".
   2. Anote as contagens por molecule (CPM, unidade: kHz) de cada medição de energia laser.
   3. Se forem utilizados dois canais de detecção, verifique a janela que mostra a curva de autocorrelação para cross-talk. Usar uma solução contendo apenas fluoróforos verdes para medir detectado autocorrelação FCS no canal de detecção e uma solução vermelha apenas com fluoróforos vermelhos para avaliar a detecção no canal de detecção verde. Como regra geral, manter o CPM detectado a partir do fluoróforo "errado" abaixo de 5% do sinal específico do fluoróforo apropriado.
   4. Verifique se os valores dimensionar linearmente com a potência do laser utilizado. Saturação de CPM na maior potência de laser (isto é, valores ligeiramente mais baixos do que o esperado a partir de uma relação linear) é aceitável.
      NOTA: CPM deve ser bem acima de 10 para a potência mais elevada do laser por quase todos os sistemas de microscópio e fluoróforos comuns e pode ser significativamente maior para sistemas sensíveis. A primeira vez que é utilizado um anticorpo fluorescente recém-conjugada, realizar umamedição de FCS do anticorpo difundir livremente na solução para quantificar o CPM esperado. Antes da medição, o revestimento da câmara de medição com 200 ul de poli-L-lisina enxertados com polietileno-glicol (diluída a 0,5 mg / ml em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente. Remover o líquido com uma pipeta e permitir que a câmara de ar seco. Salve a solução estoque na geladeira (até 2 semanas) e o estoque de pó no congelador. Ao microscópio, diluir o anticorpo a 1-10 ug / ml em PBS. Siga os passos de 4,2-4,4 e 6,7 neste protocolo. Se a superfície não é revestida com uma solução de anti-aderente, os anticorpos interagem com a superfície do vidro e ser rapidamente consumido a partir da solução.

6. Medidas celular

1. Adicionar 125 ul de células em PBS + 1% de FCS a partir da suspensão de células marcadas com anticorpo (passo 1.5) e 150 ul de meio transparente de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) para um poço de uma corrediça lamela de 8 poços septadas. Leave as células no escuro a temperatura de medida para, pelo menos, 20 min antes de iniciar as medições de FCS.
   NOTA: Este é o de permitir que as células assentar e anexar ao fundo dos poços e a equilibrar as células e solução para a temperatura de medição.
2. Na janela "Scan Control" (Figura 1, a janela B), ajuste de zoom 1 e começar uma varredura XY rápido, premindo o botão "Rápido XY". Modificar a potência do laser de modo que seja tão baixo quanto possível, enquanto as células são ainda claramente visíveis. O centro da imagem sobre uma célula redonda de brilho médio, onde a membrana está claramente definido e não há nenhum sinal de fluorescência no citoplasma. Zoom até que a célula abrange a maior parte da imagem.
3. Selecione uma nova célula se a célula atual está se movendo ou exibe tentáculos, extrusões, ou pontos extremamente brilhantes. Manter o mesmo zoom e potência do laser para todas as células capturadas durante o mesmo experimento.
   NOTA: Uma membrana agitou também pode ser um sinal de apo próximoptose.
4. Concentre-se no topo da membrana celular. Na aba "Aquisição" do "Medição" janela (Figura 1, a janela C), selecione uma posição para medição FCS ativando "Crosshair". Como alternativa, selecione a guia "LSM Imagem", marcar o ponto de medição queria na imagem LSM, e pressione "Incluir posição."
   NOTA: A parte superior da membrana da célula não será influenciado por anticorpos fluorescentes ou fluoróforos ligados não especificamente para o poli-L-lisina. No entanto, é importante assegurar que a célula não se movem durante a medição (ver os resultados).
5. Na aba "Aquisição" da janela "Medição" (Figura 1, a janela C), definir o número de repetições de 6-10, com a "medir o tempo" fixada em 10 segundos por repetição.
6. Retornar à guia "Configuração do Sistema" da janela "Medição". Ajustar a potência do laser para a medição de FCS no âmbito do "Lbotão aser ". Antes o objetivo, use baixo consumo de energia para medições de células, no intervalo entre 1 e 10 mW ^20.
   NOTA: Os valores recomendados são um trade-off entre a detecção do sinal e photodamage para as células. Veja o passo 5.2.1 Nota a percentagem de potência do laser estes valores correspondem a.
7. Iniciar uma medição FCS pressionando "Iniciar" na "Medição" janela (C). Se os agentes de branqueamento de células de forma significativa no início da medição, como detectado por uma gota no rastreio intensidade por mais de 30% durante os primeiros 10 segundos (um exemplo é mostrado na Figura 3A, painel inferior), mover-se para uma outra célula e inferior a potência do laser para as medições futuras.
   1. Se o sinal é perdido, ajuste a focagem na direcção Z. Após a medição está completa, utilizar a janela "Control Scan" (Figura 1, a janela B) para verificar que a célula ainda está centrada, e que a membrana da célula foi medida. Se the celular mudou, descartar a medição.
   2. Na janela de auto-correlação onde a medição é exibido, exclua manualmente repete individuais que contêm manobras de zoom, branqueamento, grandes aglomerados, ou outros artefatos (ver exemplos na Figura 3). Para fazer isso, marcando-os, clicando com o botão direito e escolha "Excluir". Salve o arquivo final em formato .fcs. Economize pelo menos quatro repetições por célula.
8. Opcionalmente, adquirir uma imagem da célula na secção média (com toda a circunferência da membrana visível) utilizando a janela "Scan Control". Capturar a imagem depois da medição FCS para evitar o branqueamento. Pressione o botão "Single" para iniciar a captura de imagem.
9. Se usando "Adicionar position" para o posicionamento foco FCS, clique em "Remover posição" antes de passar para a próxima célula.
10. Mudar para uma nova aliquota de suspensão de células após um máximo de 2 horas de medição para manter as células viáveis ​​throughout o experimento.

7. Análise de FCS

1. Abra os arquivos .fcs em um software com curva de capacidade de encaixe (ver Materiais / Reagentes Tabela para o software usado neste protocolo).
   NOTA: O software FCS que vem com o microscópio é um bom lugar para se familiarizar com montagem básica, mas o software adicional é necessário para caber difusão membrana bidimensional.
2. Em primeiro lugar, determinar o tamanho do volume de excitação através da análise das medições fluoróforo livre. Caber uma curva de difusão livre 3-dimensional com as curvas de autocorrelação ^21.
   (Eq. 1)
   NOTA: Definição de parâmetros: N: número médio de entidades fluorescentes no volume focal, τ (Tau): tempo de correlação, τ _D (taud): tempo de residência médio no volume focal, T 1: probabilidade para os fluoróforos para a o estado tripleto, τ T: tempo de relaxamento para as transições de estado singleto-tripleto, S: relação entre a altura e largura de diâmetro para o volume focal.
   1. Extrair taud, o tempo de trânsito para moléculas de transferir o foco.
   2. Use os coeficientes de difusão observados taud e publicadas (D) de fluoróforos utilizadas para a calibração ^{18, 19} para calcular o raio pinhole (ω).
      (Eq. 2)
3. A análise das curvas de autocorrelação em membranas celulares.
   1. Para visualizar a parte da curva que representa difusão molecular, seleccionar o período de tempo antes de iniciar o declive mais íngreme da curva de autocorrelação e termina após as convergências curva em 1 (por exemplo, 0,001 a 5 segundos para os receptores de superfície de murino; ver Figura 4).
   2. Gerar uma curva média de autocorrelação das repetições individuais i salvosn etapa 6.7.2.
   3. Caber uma curva de difusão de membrana de 2 dimensões para cada média curva de autocorrelação utilizando a Equação 3 ^3.
      (Eq. 3)
      NOTA: os parâmetros de saída importantes são os seguintes: N é o número médio de moléculas que residem no interior da área da membrana animado. Recalcular a densidade (N / ² ^ M). τ _D (taud): tempo médio de residência na zona focal, restringida pelo dois-dimensionalidade da membrana (s). Recalcular o tempo médio de residência para um coeficiente de difusão ⁽² ^ M / seg) através do raio do furo de pino determinado (ω) e Equação 2. T1 é a probabilidade de fluoróforos para estar no estado de tripleto. O brilho (CPM) é calculada dividindo a intensidade global média da medição por N.
   4. Se um bom ajuste não é conseguido na primeira tentativa, alterar os valores de partida e / ou os limites superiores e inferiores para as variáveis ​​até this é alcançado.
      NOTA: limites superior mais baixos típicos para taxas de difusão de proteínas nas membranas celulares primárias são 10-500 ms para taud, 0-100% de T1, e 0,1-5 ms para TauT1. Seleccionar os valores iniciais para o encaixe no meio destes intervalos. A parte da curva que representa variações de fluorescência derivados de difusão está tipicamente localizado entre 1 ms e 1 s (ver Figura 4). Dependendo do fluoróforo, não pode, por vezes, ser um segundo processo presente, dando origem a autocorrelação em escalas de tempo mais curtos do que o parâmetro de difusão. Isso é causado por um estado escuro transiente (tripleto) ou intermitente (como muitas vezes ocorrem em proteínas fluorescentes). Um estado triplete é contabilizado na Equação 3, e o modelo apresentado deve, portanto, também fornecem um bom ajuste nessas situações.

Resultados

Um resultado típico irá gerar uma curva de autocorrelação com um tempo de trânsito no intervalo de 10 ms para 400 ms para proteínas de membrana. O número de moléculas pode variar entre 0,5 a cerca de 200 ^ M por ² para proteínas expressas endogenamente. Verifique cuidadosamente que o CPM não é menor do que o esperado. Isto pode significar que existe uma influência do sinal de fundo. Como regra geral, o sinal de CPM de células que é aceite para a análise não deve ser inferior a...

Discussão

Este protocolo para o FCS pode ser usada para a avaliação da dinâmica molecular de moléculas de superfície sobre todos os tipos de células do sistema imunológico (murinos, humana, ou de outras espécies). Medidas FCS dinâmica molecular espaço-temporais para baixo a resolução única molécula em células vivas. A densidade molecular, bem como a taxa de difusão e de agrupamento dinâmica das proteínas de interesse, podem ser extraídos a partir das curvas de autocorrelação.

A marcação fluorescente é...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Isolamento de Células NK MACS mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Seleção negativa de células NK
Soro Fetal Bovino	Sigma-Adlrich	F7524	Solução
salina tamponada com fosfato	-	-	Feito em casa
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Meio transparente
Clone de anticorpo 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	para bloquear os receptores Fc.
Anticorpo anti-Ly49A			Anticorpo monoclonal feito internamente e conjugado internamente ao anticorpo Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd	BD Pharmingen	558915	Conjugado internamente com MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Corante fluorescente para conjugação de anticorpos.
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920	Diluído em água destilada (1,10)
Poli-L-lisina (20 kDa) enxertado com polietilenoglicol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3,5]-PEG(2)	Diluído em PBS (pH 7,4) a 0,5 mg/ml.
Cloreto de rodamina 110	Sigma-Aldrich	432202	Coeficiente de difusão conhecido: 3,3 &vezes; 10&menos; 10 m2/seg 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Coeficiente de difusão conhecido: 4,4 &vezes; 10&menos; 10 m2/seg 20
Microscópio confocal	Zeiss	LSM510
: Confocor 3	Zeiss
: Matlab com caixa de ferramentas de ajuste de curva	Versão Matlab	R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 poços, fundo de borossilicato 1,0