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Summary

avaliação não-invasiva da função endotelial em humanos pode ser determinado pela técnica de dilatação mediada pelo fluxo. Apesar de milhares de estudos têm utilizado esta técnica, nenhum estudo realizado esta técnica não-invasiva em ratos. O seguinte artigo descreve a medição não invasiva de dilatação mediada pelo fluxo no braquial e artérias femorais superficiais de ratos.

Abstract

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of endothelial function can be achieved by employing the flow-mediated dilation technique, typically performed in the brachial or superficial femoral artery. Briefly, a blood pressure cuff placed distal to an ultrasound probe is inflated to a suprasystolic pressure, which results in limb ischemia. After 5 min of occlusion the cuff is deflated, resulting in reactive hyperemia and increases in wall shear rate that signal vasodilatory molecules to be released from the endothelium eliciting vasodilation. Despite the thousands of studies performing flow-mediated dilation in humans, surprisingly, no studies have performed this technique non-invasively in living rats. Considering the recent shift in focus to translational research, the establishment of guidelines for non-invasive measurement of flow-mediated dilation in rats and other rodents would be extremely valuable. In the following article, a protocol is presented for the non-invasive measurement of flow-mediated dilation in brachial and superficial femoral arteries of rats, as those sites are most commonly measured in humans.

Introduction

O endotélio vascular é uma monocamada celular que reveste o lúmen das artérias e é um importante regulador da função vascular. Existem numerosas moléculas libertadas do endotélio que resultam na modulação do diâmetro do vaso sanguíneo. Entre estas moléculas, o óxido nítrico (NO), parece ser a molécula vasodilatadora primário libertado do endotélio vascular em resposta a estímulos (por exemplo, insulina, acetilcolina, ou mudanças na tensão de corte) ^1. No endotélio vascular, o NO é produzido pela enzima NO-sintase endotelial (eNOS) e é subsequentemente libertado a partir de células endoteliais ^2. NO difunde-se para o músculo liso vascular, onde causa o relaxamento e aumento da embarcação diâmetro ^3.

A disfunção endotelial pode ser avaliada de forma não invasiva em seres humanos, utilizando a técnica de dilatação ^4,5 mediada pelo fluxo (FMD). Febre aftosa foi proposta para representar de um bioensaio funcional para endotélio-derivadoBiodisponibilidade em humanos, e é normalmente avaliado em de artéria braquial ou femoral superficial em resposta à hiperemia reativa na sequência de um ~ 5 min oclusão de membro ^6. Hiperemia reativa aumenta forças laminar de cisalhamento que são transduzidas para a célula endotelial ^7, sinalizando a liberação de NO ^8. Apesar de nos últimos anos, a proporção de vasodilatação iniciado pela libertação de NO foi debatido ^9,10, febre aftosa é indicativo de dilatação dependente do endotélio e consistentemente foi demonstrado prevenir eventos cardiovasculares ^11-13.

Até à data, milhares de estudos têm utilizado a técnica da febre aftosa para medição não invasiva da função endotelial em humanos. Considerando a recente mudança de foco para pesquisa translacional, diretrizes para a medição não invasiva da febre aftosa em roedores seria extremamente valioso. Mantendo-se com uma abordagem translacional, este protocolo foi estabelecido para a medição de febre aftosa em braquial e supeartérias femorais rficial de ratos, como esses sites são mais comumente medida em seres humanos. Este protocolo resulta em uma resposta robusta e reproduzível febre aftosa em ratos, no entanto, a medição da febre aftosa em ratos é tecnicamente exigente e pode ser difícil para outros pesquisadores para replicar sem demonstração em vídeo. Portanto, o seguinte artigo irá demonstrar um método para a medição não invasiva da febre aftosa no braquial e femoral superficial de ratos.

Protocol

Todos os procedimentos com animais conformes à Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 14 e foram aprovados pela Universidade de Utah e Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center Animal Care e Use. 1. Preparação de animais Coloque o animal na câmara de indução anestésica contendo 3% de isoflurano em 100% de oxigênio. Deixar o animal na câmara de indução até que não responde a estímulos externos. Remover o animal da câmara de indução e colocá-lo em uma mesa de exame aquecida equipado com eletrocardiograma (ECG) eletrodos. Manter a anestesia em 3% de isoflurano em 100% de oxigénio. artéria femoral superficial braquial e febre aftosa não podem ser realizadas simultaneamente. Por isso, as instruções de preparação para cada medição estão listados abaixo. 2. Preparação da artéria braquial Posicione o supino animais e conter o membro superior esquerdo e cada membro inferior do umimal para a mesa de exame com fita cirúrgica. Restringir o membro superior direito do animal, de modo que a porção inferior do membro superior está ligeiramente elevada (~ 0,2-0,5 cm) acima da plataforma. Aplicar agente depilatório (por exemplo, Nair) para membro superior direito do animal para remover o cabelo. Posicionar um manguito oclusão (10 mm de diâmetro de lumen oclusor vascular standard) na distal do membro superior direito até o cotovelo. Não descanse o oclusor na plataforma, como a inflação / deflação irá mover o membro e perturbar as imagens de ultra-som. Defina a máquina de ultra-som para o modo B utilizando o teclado ultra-som. Aplicar uma pequena quantidade de gel de ultra-som para o membro superior do animal, proximal ao canhão de oclusão. alinhar manualmente um transdutor de ultra-alta frequência linear ligado a um suporte estereotáxica com o membro superior. A artéria braquial deve ser visível 2-3 mm de profundidade. Para confirmar que a artéria braquial, não a veia braquial, está sendotrabalhada, mude para PW-mode usando o teclado ultra-som. A artéria terá fluxo de sangue pulsátil, em oposição à veia adjacente que terá o fluxo sanguíneo contínuo. 3. femoral superficial Preparação Artéria Posicione o supino animais e restringir os membros superiores e do membro inferior esquerdo para a mesa de exame com fita cirúrgica. Restringir o membro inferior direito do animal para uma posição elevada (~ 0,5-1 cm) acima da plataforma usando uma almofada (por exemplo, toalhas de papel dobradas). Aplicar agente depilatório (por exemplo, Nair) para a direita do animal membro inferior para remover o cabelo. Após a depilação a veia femoral deve ser claramente visível na parte interna da coxa superior. Posicionar um manguito oclusão (10 mm de diâmetro de lumen oclusor vascular standard) proximal ao tornozelo direito. Não descanse o oclusor na plataforma, como a inflação / deflação irá mover o membro inferior e perturbar as imagens de ultra-som. Defina a máquina de ultra-som paraB-mode. Aplicar uma pequena quantidade de gel de ultra-som para o membro inferior do animal, proximal ao canhão de oclusão. alinhar manualmente um transdutor de ultra-alta frequência linear ligado a um suporte estereotáxico com a veia femoral, o qual é visível através da pele. A artéria femoral superficial deve ser visível <1 mm de profundidade. Para confirmar que a artéria femoral superficial, não a veia femoral, está sendo trabalhada, mude para PW-mode. A artéria terá fluxo de sangue pulsátil, em oposição à veia adjacente que terá o fluxo sanguíneo contínuo. 4. Linha de Base Fase Otimizar a imagem em modo B, semelhante à forma como seria feito em humanos 15. Certifique-se que uma imagem horizontal, longitudinal do navio com íntima-média visualizadas em ambas as paredes é observado. Otimizar a imagem, ajustando ligeiramente a colocação de sonda de ultra-som para garantir que o máximo da artéria possível é visível na janela de captura. Alternativamente, ajuste as configurações de ultra-som para obter uma melhor imagem, alterando o brilho / contraste, zonas focais, frequência, faixa dinâmica e densidade de linha. Há outras maneiras de otimizar a imagem de ultra-som, mas descrição detalhada daqueles estão fora do âmbito deste protocolo. Após a otimização de imagens da artéria, ligue ECG-gating para exibir apenas as imagens capturadas durante a onda R para garantir que apenas um quadro de diâmetro é coletado são durante cada porção diastólica de um ciclo cardíaco. NOTA: ECG-gating está disponível na máquina de ultra-som usado neste protocolo, selecionando ECG-gating sob a opção de configurações fisiológicas, no entanto, esse recurso pode não estar disponível em todas as máquinas de ultra-som. ECG-gating deve ser ligada depois de que a imagem é optimizada, uma vez que é difícil obter uma imagem a taxas de quadro mais baixas (ou seja, uma vez por onda R). Sem ECG-gating, a combinação de um elevado ritmo cardíaco em ratos e a exigência de um elevado quadrotaxa para capturar a parte diastólica do ciclo cardíaco permite apenas ~ 10-20 clipes segundo. O tamanho pesado e quantidade de dados em cada clipe aumenta a carga análise substancialmente. A ficha 60 segundos de dados de base usando modo-B. NOTA: A máquina de ultra-sons é sempre a gravação, no entanto, nem todas as imagens são armazenadas na máquina de ultra-sons, como há um limite no número de quadros que podem ser gravadas em um clipe de ultra-som. A duração do clipe (ou seja, número de quadros) pode ser ajustado nas configurações. Sugere-se a ser definido para o número máximo de quadros por clipe. Quando a gravação é no final de um clipe (isto é, o número máximo de quadros atingido), a gravação continua, mas o clipe de rolos para a frente capturar os quadros mais recentes. Neste caso, os quadros anteriores que foram capturados fora do limite máximo do quadro são subsequentemente eliminado. Embora estes meandros na gravação diferem entre máquinas, pode ser necessário o ajuste de tempo de gravação. Switch para PW-mode. Colocar o cursor no meio do lúmen. portões de exemplo irá ser automaticamente colocado em referência ao cursor, mas pode ser ajustado para a largura usando o teclado de ultra-som. Manter um ângulo de insonação de ≤ 60 °. Ajustar o ângulo de insonação, alterando o ângulo do feixe de Doppler. Fazer ajustes finos para o ângulo usando o teclado ultra-som. Se nenhuma dessas proporcionar um ângulo apropriado para a medição, ajustar manualmente a sonda de ultra-som através da inclinação da artéria para um ângulo mais ideal. Se é realizado qualquer ajuste do ângulo de ultra-som, recuperar imagens no modo B. Gravar 10 segundos de dados de velocidade. 5. fase de oclusão Inflar a prótese vascular utilizando uma seringa de 10 ml cheia de ar. Para manter constante a pressão de ar na oclusão vascular, dobrar o tubo e colocar a si própria um grampo da pasta no tubo dobrado. Mudar para PW-mode para confirmar a oclusão manguito, como evidenciado pelauma grande redução na velocidade do sangue. Mudar para dados em modo B e recordes em 60 clipes segundo, até que 4:45 min de oclusão. Mudar para PW-mode. Mantenha um registro de frequência cardíaca e o tempo de cada clipe de ultra-som para análise. 6. Fase hiperêmica Solte a braçadeira durante a gravação em PW-mode, removendo o grampo da pasta a partir do tubo dobrado. Grave 5 segundos antes e 5 segundos após liberação do manguito. Mudar para dados em modo B e recordes em 60 clipes segundos até 3 minutos após a oclusão. Mantenha um registro de frequência cardíaca e o tempo de cada clipe de ultra-som para análise. Após a conclusão da febre aftosa remover o animal da mesa de exame e monitorar até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. 7. Análise Para a análise, o ultra-som de exportação como arquivos DICOM a um computador offline equipado com software de detecção de bordas, o que permite imparcial dissuadirminação do diâmetro da artéria em cada quadro. Análise é possível na máquina de ultra-som, no entanto, não é recomendado, porque é extremamente demorada e sujeita a influência do pesquisador. Analisar dados diâmetro da artéria em 60 segundos segmentos durante a fase de linha de base e oclusão, e em 10 segundos segmentos durante a fase de hiperemia. Analisar dados de velocidade do sangue, utilizando as capacidades de análise de fluxo do software de detecção de borda automatizado. Determinar velocidade do sangue média medindo 5 ou mais formas de onda consecutivos de aparência uniforme durante as fases iniciais e oclusão. Determinar velocidade do sangue média durante a hiperemia reativa para velocidades de sangue imediatamente após a liberação do manguito. A forma de onda com a mais alta velocidade do sangue é considerada velocidade do sangue de pico.

Representative Results

dilatação mediada por fluxo foi realizada no braquial e artéria femoral superficial de 8 ratos Wistar. Posicionamento de um rato é mostrada na Figura 1. Imagens de ultra-sons representativos da artéria femoral superficial são mostrados na Figura 2. <strong…

Discussion

No presente estudo, a medição não invasiva da febre aftosa foi demonstrado no braquial e femoral superficial de ratos. Semelhantes aos seres humanos ^6, após um período de oclusão de 5 min, houve um rápido aumento na velocidade do sangue (isto é, hiperemia reactiva) aumentando assim a velocidade de corte na parede arterial que resultou na vasodilatação posterior da artéria. Febre aftosa foi observado em ambos os braquial e femoral superficial. Além disso, houve uma forte relação de febre aftosa e…

Materials

Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer – MS-700 30-70 MHz	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Vevo Imaging Station	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Thermasonic gel warmer	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	82-03	Optional
Signacreme electrode cream	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	17-05
Transpore surgical tape	3M, Maplewood, MN, USA	1527-1
Depilatory cream (e.g., Nair)	General supply
Cotton swabs	General supply
Ultrasound gel	General supply
Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	62-0115
10 ml syringe with Luer-Lok tip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Paperclip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Hypodermic needle – 18 gauge	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Medium binder clip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus