Artigo de método
O vírus Zika (ZIKV), um patógeno emergente, está ligado a anormalidades no desenvolvimento fetal e microcefalia. O estabelecimento de um sistema eficaz de cultura de células infecciosas é crucial para estudos de replicação do ZIKV, bem como para o desenvolvimento de vacinas e medicamentos. Neste estudo, vários ensaios virológicos relativos ao ZIKV são ilustrados e discutidos.
Vírus Zika (ZIKV) é um agente patogénico emergente que está ligada a anomalias do desenvolvimento fetal, tais como microcefalia, defeitos oculares, e comprometimento do crescimento. ZIKV é um vírus de RNA da família Flaviviridae. ZIKV é transmitido principalmente por mosquitos, mas também pode ser transmitida por maternal à transmissão vertical fetal, bem como o contato sexual. Até à data, não há nenhum tratamento ou vacinas fiáveis opções disponíveis para proteger as pessoas infectadas pelo vírus. O desenvolvimento de um sistema de cultura de células reprodutível, eficaz Zika vírus infeccioso é fundamental para o estudo dos mecanismos moleculares de replicação ZIKV, bem como o desenvolvimento de drogas e vacinas. A este respeito, um protocolo descrevendo um in vitro Zika sistema de cultura de mamífero com base em células de vírus para análise da produção e crescimento virai é aqui relatado. Os detalhes sobre a formação de placas de vírus Zika numa monocamada de células e ensaio de placa para medição título virai são apresentados. cinética de replicação do genoma virale intermediários replicatory de cadeia dupla do genoma de ARN são determinadas. Esta plataforma de cultura foi utilizado para a tela de encontro a uma biblioteca de um pequeno conjunto de citocinas, resultando na identificação de interferão-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ como potentes inibidores do crescimento virai Zika. Em resumo, um sistema in vitro infecciosa viral Zika cultura e vários ensaios virológicos são demonstrados neste estudo, que tem o potencial de se beneficiar muito a comunidade de investigação para elucidar ainda mais os mecanismos de patogénese viral e a evolução da virulência do vírus. Antiviral IFN-alpha pode ainda ser avaliada como um, profilático pós-exposição, e opção de tratamento profilático para infecções por vírus Zika em populações de alto risco, incluindo mulheres grávidas infectadas.
Virus Zika (ZIKV) é um patógeno humano importante associado à microcefalia e pobres resultados perinatais 1,4. ZIKV pertence ao conjunto de flavivírus clinicamente relevantes que podem causar defeitos neurológicos, tais como o dengue, Nilo Ocidental, e vírus da encefalite de St. Louis. O principal modo de transmissão virai é pelo vector mosquito Aedes aegypti, e, além disso, a transmissão sexual também tem sido relatada 5,6. ZIKV tornou-se um grande problema global de saúde devido à distribuição geográfica expansão do mosquito vetor e sua forte correlação com defeitos de nascimento. ZIKV foi isolado pela primeira vez em 1947 a partir de....
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Nota: Uma representação esquemática do fluxo de trabalho é apresentado na Figura 1.
1. células
2. Zika produção de vírus
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Uma estirpe viral Zika (PRVABC59; número de acesso GenBank KU501215) do genótipo asiático foi utilizado neste estudo 12. Células Vero a 80% de confluência foram utilizadas para investigar Novo infecção viral de Zika. Para a produção viral e posterior caracterização virológica, foi empregado um início passagem de vírus (P3) Zika. As placas virais foram observadas no segundo dia da infecção. Progênies virais Zika libertados a partir da célula inicialmente infec.......
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Aqui, um protocolo simplificado para a cultura de vírus Zika in vitro é apresentado. As etapas críticas incluindo, identificando pontos finais óptimas para a expansão da cultura de vírus, medindo título, e quantificar a replicação do genoma foram fornecidos. vírus Zika é um patógeno humano, por isso, enquanto manuseamento de agentes infecciosos, procedimentos de biossegurança devem ser rigorosamente seguidas. Uma linha de células de rim de macaco, Vero, foi usado para demonstrar vários ensaios virológicos. ciné.......
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Os autores não têm nada a divulgar.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Aaron Brault e à Dra. Brandy Russell, dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), EUA, por fornecerem a cepa viral do Zika PRVABC59. Agradecemos a Nicholas Ten, da Universidade de Yale, pela edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Pesquisa Programática Institucional do Cedars-Sinai Medical Center para VA
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Águia modificada' s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Tripsina, 10x [-] Vermelho de Fenol | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Mancha Azul 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Condessa – Contador de Células Automatizado | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Contagem de células de condessa | lâminas de câmara ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| anticorpo monoclonal anti-dsRNA de camundongo J2 | Inglês & Consultoria Científica Kft. | ||
| IgG anti-coelho para cabras Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Sistema de PCR em Tempo Real | Thermo Fischer | 4471088 | |
| DNase Livre de RNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | Cepa viral ATCC | CCL-81 | |
| Zika PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alfa | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alfa | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alfa A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gama | Peprotech | 300-02 | |
| Centrífuga 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrífuga 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Microscópio de imunofluorescência com Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visita Nikon para Solicitação |
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