O desenvolvimento de dor neuropática envolve alterações patológicas das células gliais medula espinhal. Um sistema de cultura de células gliais de confiança derivados de tecidos de medula espinal adulta e concebido para estudar estas células in vitro é inexistente. Portanto, vamos mostrar aqui como estabelecer culturas gliais mistas primárias de tecido da medula espinhal do rato adulto.
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Artigo de método
Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue
Neste artigo
Resumo
Resumo
foi bem aceite que a medula espinhal respostas gliais contribuir significativamente para o desenvolvimento de dor neuropática. Informações tremenda sobre as atividades da glia nos níveis celulares e moleculares foi obtida através dos sistemas de cultura de células in vitro. Os sistemas in vitro utilizados incluem, principalmente as células da glia primária derivada de tecido cortical cerebral neonatal e linhas de células imortalizadas. No entanto, estes sistemas podem não coincidir com as características das células da glia medula espinal in vivo. A fim de investigar o papel das células cabo gliais da coluna vertebral em desenvolvimento de nervo periférico dor neuropática induzida por lesão utilizando um sistema de cultura que reflete melhor a condição in vivo, nosso laboratório tem desenvolvido um método para estabelecer medula espinal primária culturas gliais mistas a partir de camundongos adultos. Em resumo, a espinal medula são coletadas de ratos adultos e processado através de digestão com papaína seguido pela remoção da mielina com tocasdade de gradiente médio. As suspensões de células isoladas são cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco completa (cDMEM) suplementado com 2-mercaptoetanol (2-ME) a 35,9 o C. Estas condições de cultura foram optimizado especificamente para o crescimento de células gliais mistas. Sob estas condições, as células estão prontas para serem utilizados para a experimentação entre 12 - 14 d (células são geralmente em fase log durante este tempo) após o estabelecimento da cultura (D 0) e pode ser mantido em condições de cultura até a D 21. este sistema de cultura pode ser utilizada para investigar as respostas de células gliais medula espinal após estimulação com várias substâncias e agentes. Além da dor neuropática, este sistema pode ser usado para estudar as respostas gliais em outras doenças que envolvem alterações patológicas das células gliais medula espinhal.
Introdução
A dor crônica é um problema de saúde grave que afeta cerca de 100 milhões de adultos nos Estados Unidos, com um custo anual estimado de até 635.000.000.000 $ 1. Evidências crescentes indicou uma contribuição significativa de células gliais medula espinhal no desenvolvimento da dor neuropática, um dos tipos mais devastadores da dor crônica 2. Um sistema in vitro cultura própria ajudaria significativamente em investigar mais os papéis de células gliais nos níveis celulares e moleculares.
Atualmente, os sistemas in vitro de cultura gliais utilizados pelos investigadores incluem principalmente células g....
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Protocolo
O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Nova Inglaterra. O protocolo seguinte é para a preparação de culturas gliais de rato adulto 4 medulas espinhais.
1. Preparação de Soluções em uma capa de cultura sob condições assépticas
- Preparar meios de cultura: modificação de meio de Eagle (cDMEM) contendo DMEM completo de Dulbecco (com 4,5 g / L de glucose), 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina , 250 ng / mL de anfotericina B, e 50 uM de 2-mercaptoetanol (2-ME; ver 1.1.1). Homogeneizar e filtra....
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Resultados
Este método pode ser utilizado para preparar células gliais mistas de ambos os ratinhos e ratos. O número total de células médio por poço numa placa de 12 poços em D 12 pós-iniciação da cultura deve ser relativamente estável, com cerca de 100000 células por poço, quando as células são derivadas de medulas espinais de rato. As células da glia obtidos com este método pode ser utilizado em experiências que se destinam a examinar adultos respostas cabo gliais espinal após administração de su.......
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Discussão
É crítico para executar todas as etapas-incluindo os meios de comunicação Alterar o horário-de maneira consistente, a fim de obter resultados reprodutíveis entre experimentos. Os passos seguintes são particularmente crítico na obtenção de excelente qualidade adulto glia mista.
A digestão enzimática é um aspecto importante deste protocolo. É crucial que os pedaços de tecido são bem digerido, a fim de se obter uma suspensão de célula única. No entanto, o excesso de digestão irá resultar em um .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
As culturas mistas de medula espinhal adulta foram desenvolvidas pela primeira vez usando ratos com o apoio de um prêmio NIH / NIDA R01 (PI De Leo) e uma bolsa de treinamento NIH T32 (PI Green). Esses métodos foram adaptados para medula espinhal de camundongo com o apoio das seguintes bolsas: NIH / NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH / NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) e NIH / NIGMS P20GM103643 (PI Meng). Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Alejandro MS Mayer, Departamento de Farmacologia do Chicago College of Osteopathic Medicine, por sua ajuda técnica na obtenção de células gliais mistas ricas em microglia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' modificação de Eagle' s (DMEM) com 4,5 g/L de glicose | Lonza | 12-709F | O meio cDMEM é um meio de cultura padrão e amplamente utilizado. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar o DMEM e todos os outros componentes usados para fazer a mídia cDMEM. |
| L-Glutamina (100x) | Lonza | 17-605E | A L-glutamina é um componente padrão e amplamente utilizado para vários meios de cultura. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar L-glutamina. |
| Solução Antibiótica-Antimicótica (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | Esta é uma combinação de penicilina, estreptomicina e Anfotericina formulada para conter 10.000 unidades/mL de penicilina G, 10 mg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 µ g / mL de anfotericina B. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar componentes individuais. |
| 2-mercaptoetanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | Um BioReagente, adequado para cultura de células, biologia molecular e eletroforese. |
| Sistema de dissociação de papaína | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Componentes individuais deste kit podem ser adquiridos separadamente. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll é vendido como solução estéril. O Percoll não diluído pode ser autoclavado novamente, se necessário. |
| Incubadora/agitador de linha de laboratório | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | Esta é a incubadora/agitadora que temos atualmente. Outros tipos de agitadores podem ser usados em seu lugar. |
| Lipopolissacarídeos Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Outras cepas de LPS também podem induzir respostas gliais. A magnitude das respostas, porém, pode variar. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R& D Systems | DY406 | Cada pesquisador individual pode selecionar o kit ELISA de sua preferência. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R& D Systems | DY410 | Cada pesquisador individual pode selecionar o kit ELISA de sua preferência. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R& D Systems | DY466 | Cada pesquisador individual pode selecionar o kit ELISA de sua preferência. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Cada pesquisador individual pode selecionar o kit ELISA de sua preferência. |
| Quimiocina de camundongo Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | Este produto não estava disponível para ensaio interno na época. Em vez disso, enviamos amostras ao fabricante para análise. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | O anticorpo do mesmo clone, mas de outros fornecedores, pode ser usado. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | O anticorpo do mesmo clone, mas de outros fornecedores, pode ser usado. |
| Citômetro de fluxo Accuri C6 | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Cada pesquisador individual pode usar qualquer citômetro de fluxo de sua preferência. |
| Software FlowJo | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Cada pesquisador individual pode usar qualquer software de análise de sua preferência. |
Referências
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy? Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
- Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation....
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Reimpressões e permissões
