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Artigo de método

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

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DOI:

10.3791/54801

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19 de novembro de 2016

 , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Osteopathic Medicine, University of New England

Neste artigo

Resumo

O desenvolvimento de dor neuropática envolve alterações patológicas das células gliais medula espinhal. Um sistema de cultura de células gliais de confiança derivados de tecidos de medula espinal adulta e concebido para estudar estas células in vitro é inexistente. Portanto, vamos mostrar aqui como estabelecer culturas gliais mistas primárias de tecido da medula espinhal do rato adulto.

Resumo

foi bem aceite que a medula espinhal respostas gliais contribuir significativamente para o desenvolvimento de dor neuropática. Informações tremenda sobre as atividades da glia nos níveis celulares e moleculares foi obtida através dos sistemas de cultura de células in vitro. Os sistemas in vitro utilizados incluem, principalmente as células da glia primária derivada de tecido cortical cerebral neonatal e linhas de células imortalizadas. No entanto, estes sistemas podem não coincidir com as características das células da glia medula espinal in vivo. A fim de investigar o papel das células cabo gliais da coluna vertebral em desenvolvimento de nervo periférico dor neuropática induzida por lesão utilizando um sistema de cultura que reflete melhor a condição in vivo, nosso laboratório tem desenvolvido um método para estabelecer medula espinal primária culturas gliais mistas a partir de camundongos adultos. Em resumo, a espinal medula são coletadas de ratos adultos e processado através de digestão com papaína seguido pela remoção da mielina com tocasdade de gradiente médio. As suspensões de células isoladas são cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco completa (cDMEM) suplementado com 2-mercaptoetanol (2-ME) a 35,9 o C. Estas condições de cultura foram optimizado especificamente para o crescimento de células gliais mistas. Sob estas condições, as células estão prontas para serem utilizados para a experimentação entre 12 - 14 d (células são geralmente em fase log durante este tempo) após o estabelecimento da cultura (D 0) e pode ser mantido em condições de cultura até a D 21. este sistema de cultura pode ser utilizada para investigar as respostas de células gliais medula espinal após estimulação com várias substâncias e agentes. Além da dor neuropática, este sistema pode ser usado para estudar as respostas gliais em outras doenças que envolvem alterações patológicas das células gliais medula espinhal.

Introdução

A dor crônica é um problema de saúde grave que afeta cerca de 100 milhões de adultos nos Estados Unidos, com um custo anual estimado de até 635.000.000.000 $ 1. Evidências crescentes indicou uma contribuição significativa de células gliais medula espinhal no desenvolvimento da dor neuropática, um dos tipos mais devastadores da dor crônica 2. Um sistema in vitro cultura própria ajudaria significativamente em investigar mais os papéis de células gliais nos níveis celulares e moleculares.

Atualmente, os sistemas in vitro de cultura gliais utilizados pelos investigadores incluem principalmente células gliais derivadas de tecidos corticais de rato ou rato cérebros neonatal e linhas celulares imortalizadas gliais derivadas de rato neonatal ou rato células gliais primários. Neonatal células contêm um número significativo de células indiferenciadas que podem ainda ser diferenciadas em células gliais (astrócitos e principalmente da microglia), proporcionando assim umcélulas bundant para o uso experimental 3. No entanto, o nosso estudo anterior demonstrou que as células da glia cerebral neonatal responderam significativamente diferente a partir de células gliais medula espinal adultos mediante a estimulação de lipopolissacárido (LPS). Por exemplo, a interleucina (IL) -4 exibido aumenta os efeitos inibidores sobre o óxido nítrico induzida por LPS (NO) em células da glia de ratos adultos da medula espinal em comparação com as células da glia cerebral neonatal 4. Além disso, os perfis de produção de quimioquina após estimulação por um neuropeptídeo, calcitonina péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), são indiscutivelmente diferente entre as células da glia cerebral do rato neonatal (métodos descritos no Exemplo de Ref. 5) e de ratinho adulto espinal medula glia (Figura 1). As linhas celulares estabelecidas são fáceis de utilizar e de manter e pode fornecer um grande número de células num período de tempo curto. Em geral, as linhas celulares imortalizadas são gerados utilizando um sistema de imortalizao mediada por vírus (tais como a linha de células da microglia amplamente utilizado BV2) 6, 7 ou seguinte the identificação de transformação espontânea (tal como a linha de células de astrócitos C8-D1A e linha de células da microglia C8-B4) 8, 9, as linhas de células são excelentes no estudo das características moleculares dos astrócitos e microglia individualmente.; No entanto, os resultados obtidos a partir de linhas celulares exigem sempre uma validação adicional das células primárias ou em condições in vivo. Deve também notar-se que não houve um relato de uma linha de células da glia, que é derivada de uma medula espinal glia roedor.

Para ajudar a investigar o papel das células do cordão gliais da coluna vertebral no desenvolvimento de dor neuropática, num sistema de cultura que é derivado a partir da medula espinal do rato adulto foi desenvolvido por adaptação de um método previamente relatado usado para gerar ratos adultos culturas gliais mistas 4, 5 . A cultura de células gliais da medula espinal do rato foi ainda mais refinado recentemente 10 e é descrito em mais detalhe neste artigo. Adultas da medula espinal misturado culturas gliais cum ser estabelecida com um rato a partir de estirpes seleccionadas que se encaixam as necessidades do estudo particular, e as células podem ser mantidas em cultura durante até 21 dias após o inicio da cultura. Este método pode ser utilizado em estudos de dor neuropática, bem como em investigações de várias doenças neurológicas que envolvem alterações patológicas no interior da medula espinal, tais como esclerose amiotrófica lateral (ALS), o vírus da imunodeficiência humana (HIV) -associated neuropatia sensorial, e múltiplos A esclerose múltipla (MS).

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Protocolo

O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Nova Inglaterra. O protocolo seguinte é para a preparação de culturas gliais de rato adulto 4 medulas espinhais.

1. Preparação de Soluções em uma capa de cultura sob condições assépticas

  1. Preparar meios de cultura: modificação de meio de Eagle (cDMEM) contendo DMEM completo de Dulbecco (com 4,5 g / L de glucose), 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina , 250 ng / mL de anfotericina B, e 50 uM de 2-mercaptoetanol (2-ME; ver 1.1.1). Homogeneizar e filtrar esterilizar todos os outros componentes e depois adicionar FBS. Armazenar o meio de cultura a 4 o C.
    1. Preparar 2-Me / solução salina tamponada com fosfato de solução de estoque 50 mM (PBS): adiciona-se 100 mL de concentrado de 2-ME (14,3 M) em 28,6 mL de 1x PBS, e esterilizar filtro (a solução pode ser armazenada a 4 ° C durante vários meses). vocêSE 1 mL de 2-ME solução estoque para cada 1000 mL de meio de cultura.
  2. Preparação dos meios de gradiente de densidade
    1. Prepare uma solução de mídia gradiente de densidade isotônica estoque (por exemplo, 100% Percoll) a partir de 1 parte 10x normal estéril PBS e 9 partes de meios gradientes estéril densidade estoque (por exemplo, Percoll).
    2. Dilui-se a meios de gradiente de densidade de 100% (feito em 1.2.1) com 1x PBS estéril normal para fazer uma de 20% de meio de gradiente de densidade (por exemplo, 10 mL de 100% de meio de gradiente de densidade com 40 mL de PBS 1x) e armazená-lo a quatro o C. Traga os 20% media gradiente de densidade à temperatura ambiente (RT) antes de preparar a cultura de células.
  3. Preparação de soluções a partir do sistema de dissociação de papaína
    NOTA: O sistema de dissociação de papaína pode ser identificado na Tabela Materiais. Outros kits de dissociação semelhantes (incluindo aqueles montado em casa) também pode ser usado. Todos os componeNTS deve ser estéril.
    1. Adicionar 32 ml de Solução Salina Equilibrada de Earle (EBSS) à mistura de inibidor de ovomucóide (pó).
    2. Adicionar 5 mL de EBSS para um frasco papaína (pó). Colocar o frasco papaína em um banho de água a 37 ° C durante 10 minutos ou até que a papaína é dissolvido.
    3. Adicionar 500 mL de EBSS para um frasco de ADNase (pó). Misture delicadamente.
    4. Adicionar 250 ul da solução de ADNase (acima) para o frasco de papaína.
    5. Calcula-se a quantidade total da mistura papaína / ADNase acima necessário (aproximadamente 800 ul de papaina mistura / ADNase por ratinho medula espinal) e transferir a mistura necessária para um tubo de 50 mL para a digestão de tecido (passo 3.2). Armazenar o restante no recipiente original, a 4 ° C durante pelo menos duas semanas.
    6. Manter todos os componentes dos kits em gelo até ser necessária.
  4. Preparar tubos de colheita de medula espinal: um tubo estéril de 15 mL com 5 mL de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS; a partir do sistema de dissociação de papaína,0; para a recolha de medula espinhal) e um tubo de 15 mL estéril com 1x PBS (para encher a seringa de 5 mL, consulte o passo 2.4). Além disso, preparar uma placa de Petri estéril (35 mm ou 60 mm) com 5 mL de HBSS e mantê-lo na capa de cultura.

2. Spinal Cord Colecção

NOTA: Todos os equipamentos devem ser estéreis. Realizar a coleta em uma área designada aprovado pelo IACUC.

  1. Obter as seguintes ferramentas para a colheita do rato medulas espinhais: sem corte tesoura reta afiadas / 18 cm cirúrgicos, um bisturi de 12 cm padrão (# 3 sólida), em aço carbono estéreis bisturi lâmina nº 10, uma pequena decapitator animal, de 12 cm padrão curvo uma pinça, e uma agulha de 20G estéril ligada a uma seringa de 5 mL.
  2. Eutanásia do animal com CO2 e desinfectar a cabeça de rato e a região de volta com 70% de etanol (EtOH).
  3. Decapitar animal com o decapitator. Adicione uma incisão longitudinal no meio da parte inferior das costas para expor a camada muscular. Façouma transecção limpa através da coluna de vertebrados do nível do quadril (também corte através da camada de músculo que cobre a coluna de vertebrados) com as tesouras cirúrgicas retas estéreis (18 cm).
  4. Colocar o animal em uma folha de fresco pano descartável. Cuidadosamente inserir a agulha de 20 G (ligada a uma seringa de 5 ml cheio com PBS estéril 1x (passo 1.4)) dentro da coluna vertebral em direcção ao lado rostral. Mantenha o animal para baixo firmemente e empurre a seringa rapidamente. Toda a medula espinhal deve sair a partir do final do colo do útero. Recolha da medula espinal no interior do tubo 15 mL contendo HBSS.
  5. Repetir o passo 2.4 para o resto dos ratinhos. Entre cada animal, desinfectar todos os instrumentos utilizados com etanol 70%.
    NOTA: Normalmente, uma única placa de 12 poços pode ser estabelecido para cada 4 rato medula espinhal (ver 4.3).

3. Preparação da suspensão de células individuais

Nota: Execute os passos 3 e 4 em uma capa de cultura para manter tudo esterilizado.

  1. Transfira todas as medulas espinhais na HBSS contendo placa de petri (passo 1.4). Corte cada uma das medulas espinhais em muitos finos, pequenos pedaços com uma tesoura e uma pinça estéril. Transferir o tecido da medula espinhal ao tubo cônico de 50 ml, contendo papaína preparado / mistura de enzima DNase (passo 1.3.5) usando uma pinça estéril ou uma pipeta de 10 (evitar a adição de HBSS à mistura enzimática, tal como esta continuará a diluir o preparado solução de enzima e pode resultar na diminuição do desempenho da enzima).
  2. Vortex o tubo suavemente para misturar. Incubar o tubo a 37 o C durante 1 h num incubador / agitador com agitação orbital a 150 rpm.
  3. Vortex e o tubo de novo vigorosamente tritura-se a solução de enzima com o tecido utilizando uma pipeta de 5 mL para promover ainda mais a dissociação.
  4. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min à TA.
  5. Durante a centrifugação, misturar 2,7 mL de EBSS, com 300 ul de albumina de INH-ovomucóide reconstituídosolução ibitor (1.3.1) em um tubo estéril. Adicionar 150 ul da solução de ADNase (passo 1.3.3).
  6. Após a centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células com a solução preparada acima (passo 3.5). Vortex bem para quebrar o sedimento celular.
  7. Adicionar 3 ml de solução reconstituída albumina-ovomucóide inibidor (passo 1.4.1) para a suspensão de células. células Centrifugar a 70 xg durante 6 minutos à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante (que contém os fragmentos de membrana).

4. Além disso remoção da mielina da suspensão de células individuais

  1. Adiciona-se 8 mL de 20% de meio de gradiente de densidade (preparado no passo 1.2.2) para o tubo contendo o sedimento de células, vortex suavemente para perturbar o sedimento, e centrifugar as células a 800 xg durante 30 min à temperatura ambiente sem travagem. Remova cuidadosamente a camada superior de detritos (principalmente mielina) e o sobrenadante, mas manter o sedimento.
  2. Para remover vestígios do gradiente de densidade, lavar as células por resuspending o sedimento celular com 8 mL de uma cDMEM diluída (1 parte cDMEM e 2 partes HBSS). Centrifugar as células a 400 xg durante 10 minutos a 4 o C. Remover o sobrenadante e lava-se as células novamente com o cDMEM diluída (de cima) da mesma maneira. Manter as células em gelo até semeando-os.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio de cultura (cDMEM fornecido com 2-ME (preparado no passo 1.1)). Para uma placa de 12 poços, utilize 3 mL x 4 (número de ratinhos usados ​​2 ml) + = 14 ml de meio. Isto irá assegurar que existe suspensão de células suficientes para toda a placa (12 poços) e vai proporcionar para poços adicionais que podem ser usados ​​para determinar o número médio de células por poço e o conteúdo da microglia da cultura. Se vai ser utilizados outros tipos de recipientes de cultura, calcular o volume total de meios de cultura necessária proporcionalmente.
  4. Adicionar 1 ml de suspensão celular em cada poço de uma placa de 12 poços.
  5. Incubar as células a 35,9 ° C com 5% de CO 2.
  6. Alterar a mídia (remover a velha mídia através de aspiração) em D 1 e depois a cada 3 - 4 d depois (normalmente alterar a mídia on D: 1, 4, 8 e 11, e, em seguida, usar as células no dia 12).
    NOTA: No dia 1, a cultura pode conter quantidades significativas de detritos devidos à mielina resíduo a partir do tecido da medula espinal; Assim, mudando a mídia no dia 1 é recomendada (consulte o Discussão para mais informações). As culturas estão prontas para tratamento entre D 12 - 14. As células são normalmente 80% confluentes em D 12, e pode ser próxima de 100% confluentes por D 14. Tipicamente, em D 12, existem cerca de 100000 células por poço numa placa de 12 poços .

figure-protocol-1
Figura 2:. Imagens representativas de células gliais misturadas em diferentes momentos após o estabelecimento da cultura glia mista medula espinhal glia mistos primários foram preparados a partir de adultos camundongos C57BL / 6. imagens representativasmostram o progresso da cultura glial após o plaqueamento. No dia 1, algumas células são ligados à placa de cultura, mas que ainda são principalmente redondo. Há também muitas células flutuantes e detritos significativo. No dia 4, a maioria das células estão ligados à placa de cultura. Células parecem ramificada com processos visíveis. As células são distribuídas de forma esporádica e culturas são cerca de 20-30% confluentes no momento. No dia 8, as culturas são entre 50-60% confluentes. Algumas áreas das culturas têm grandes manchas de células. Outras áreas das culturas ter um crescimento escasso de células. Algumas células no interior das manchas assumir uma aparência "quadrado-like". No dia 12, as culturas são iguais ou superiores a 80% confluentes (cerca de 90% confluentes na imagem mostrada aqui). Células estão na fase log do crescimento neste momento e entre os dias 12-14 é o momento ideal para o uso das células da glia para experimentos. Por favor clique aqui para ver umaversão maior desta figura.

  1. Examinar o conteúdo da microglia usando células dos poços adicionais (passo 4.3), através de células activadas por fluorescência padrão (FACS) usando o protocolo de coloração 11, a combinação de anticorpo anti-ratinho-CD45 e os anticorpos monoclonais anti-CD11b de rato. As células CD45 + CD11b + são identificados como microglia.

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Resultados

Este método pode ser utilizado para preparar células gliais mistas de ambos os ratinhos e ratos. O número total de células médio por poço numa placa de 12 poços em D 12 pós-iniciação da cultura deve ser relativamente estável, com cerca de 100000 células por poço, quando as células são derivadas de medulas espinais de rato. As células da glia obtidos com este método pode ser utilizado em experiências que se destinam a examinar adultos respostas cabo gliais espinal após administração de su...

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Discussão

É crítico para executar todas as etapas-incluindo os meios de comunicação Alterar o horário-de maneira consistente, a fim de obter resultados reprodutíveis entre experimentos. Os passos seguintes são particularmente crítico na obtenção de excelente qualidade adulto glia mista.

A digestão enzimática é um aspecto importante deste protocolo. É crucial que os pedaços de tecido são bem digerido, a fim de se obter uma suspensão de célula única. No entanto, o excesso de digestão irá resultar em um ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

As culturas mistas de medula espinhal adulta foram desenvolvidas pela primeira vez usando ratos com o apoio de um prêmio NIH / NIDA R01 (PI De Leo) e uma bolsa de treinamento NIH T32 (PI Green). Esses métodos foram adaptados para medula espinhal de camundongo com o apoio das seguintes bolsas: NIH / NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH / NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) e NIH / NIGMS P20GM103643 (PI Meng). Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Alejandro MS Mayer, Departamento de Farmacologia do Chicago College of Osteopathic Medicine, por sua ajuda técnica na obtenção de células gliais mistas ricas em microglia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dulbecco' modificação de Eagle' s (DMEM) com 4,5 g/L de glicoseLonza12-709FO meio cDMEM é um meio de cultura padrão e amplamente utilizado. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar o DMEM e todos os outros componentes usados para fazer a mídia cDMEM.
L-Glutamina (100x)Lonza17-605EA L-glutamina é um componente padrão e amplamente utilizado para vários meios de cultura. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar L-glutamina.
Solução Antibiótica-Antimicótica (100x)Corning-Mediatech30-004-CIEsta é uma combinação de penicilina, estreptomicina e Anfotericina formulada para conter 10.000 unidades/mL de penicilina G, 10 mg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 µ g / mL de anfotericina B. Pesquisadores individuais podem decidir onde comprar componentes individuais.
2-mercaptoetanol (2-ME)Sigma-AldrichM3148Um BioReagente, adequado para cultura de células, biologia molecular e eletroforese.
Sistema de dissociação de papaínaWorthington Biochemical CorporationLK003150Componentes individuais deste kit podem ser adquiridos separadamente. 
PercollGE Health Care17-0891-01Percoll é vendido como solução estéril. O Percoll não diluído pode ser autoclavado novamente, se necessário.
Incubadora/agitador de linha de laboratório Barstead/Lab-lineMaxQ4000 Esta é a incubadora/agitadora que temos atualmente. Outros tipos de agitadores podem ser usados em seu lugar.
Lipopolissacarídeos Salmonella Minnesota Re595Sigma-AldrichL-9764Outras cepas de LPS também podem induzir respostas gliais. A magnitude das respostas, porém, pode variar.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA R& D SystemsDY406Cada pesquisador individual pode selecionar o kit ELISA de sua preferência.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISAR& D SystemsDY410Cada pesquisador individual pode selecionar o kit ELISA de sua preferência.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISAR& D SystemsDY466Cada pesquisador individual pode selecionar o kit ELISA de sua preferência.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia setBD Biosciences555260Cada pesquisador individual pode selecionar o kit ELISA de sua preferência.
Quimiocina de camundongo Q-PlexQuansys Biosciences120251MSEste produto não estava disponível para ensaio interno na época. Em vez disso, enviamos amostras ao fabricante para análise.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)eBioscience17-0451O anticorpo do mesmo clone, mas de outros fornecedores, pode ser usado.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)eBioscience11-0112O anticorpo do mesmo clone, mas de outros fornecedores, pode ser usado.
Citômetro de fluxo Accuri C6BD BiosciencesBD Accuri C6 Cada pesquisador individual pode usar qualquer citômetro de fluxo de sua preferência.
Software FlowJoTree Star, Inc.FlowJo7.6.5Cada pesquisador individual pode usar qualquer software de análise de sua preferência.

Referências

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