Um método de injeção Alternativa e validado para acessar o espaço sub-retiniano via Uma abordagem transcleral Posterior

Summary

As injeções sub-retinianas são a técnica mais comum para administrar grandes agentes terapêuticos, como proteínas e vetores virais, aos fotorreceptores e ao epitélio pigmentar da retina. Um método alternativo em camundongos que atinge com sucesso o espaço sub-retiniano com danos colaterais mínimos e tempos de recuperação rápidos é descrito aqui.

Abstract

injecções sub-retiniano têm sido utilizados com sucesso em humanos e roedores, para realizar intervenções terapêuticas de proteínas, agentes virais, e células para o compartimento interfotoreceptor / sub-retiniano que tem exposição directa à fotorreceptores e epitélio pigmentado da retina (RPE). injecções sub-retiniana de plasminogénio bem como recentes ensaios pré-clínicos e clínicos demonstraram segurança e / ou eficácia de entrega de vectores virais e das células estaminais para indivíduos com doença da retina avançada. modelos de rato da doença da retina, particularmente distrofias da retina hereditária, são essenciais para testar estas terapias. O processo de injecção mais comum em roedores é a utilização de pequenas incisões ou transcorneano transcleral com uma abordagem anterior para a retina. Com esta abordagem, a agulha de injecção penetra a retina neurosensorial perturbar o RPE subjacente e na inserção pode facilmente cortar a lente, fazendo com que a opacificação da lente e comprometimento da Imagi não invasivang. Aceder ao espaço sub-retiniano através de uma transcleral, abordagem posterior evita estes problemas: a agulha atravessa a esclera cerca de 0,5 mm a partir do nervo óptico, retina, sem penetração e evita perturbar o vítreo. Os danos colaterais é limitada a essa associada com a esclerotomia focal e os efeitos de um transiente, descolamento seroso da retina. A simplicidade do método minimiza a lesão ocular, descolamento de retina assegura uma rápida e recuperação, e tem uma taxa de falha baixa. O mínimo de danos na retina e EPR permite a avaliação clara da eficácia e dos efeitos directos dos próprios agentes terapêuticos. Este manuscrito descreve uma nova técnica de injecção sub-retinal, que pode ser utilizado para alvejar vectores virais, agentes farmacológicos, as células estaminais ou células estaminais pluripotentes induzidas (IPS) para o espaço sub-retiniano em ratos com uma elevada eficácia, danos mínimos, e rápida recuperação.

Introduction

Injecções sub-retiniana são o principal meio de entrega de agentes celulares e virais para as retinas de ratos para estudar seus efeitos sobre fotorreceptores e EPR subjacente a ^1,2. A maioria dos protocolos de injecção subretinal em ratinhos usar um transcorneano ou um local de injecção anterior transcleral ao equador (Figura 1). Esta abordagem pode resultar em danos colaterais inerente que inclui nicking e turvação resultante da lente, perturbação da integridade do vítreo, a penetração da retina neurosensorial e íris, hemorragia da retina, descolamento da retina e o edema substanciais sub-retiniano duradoura ^3-9. Manipulações ....

Protocol

Animais: tipo selvagem camundongos C57BL / 6J criados na Universidade da Califórnia em Los Angeles (UCLA). Todos os animais tinham entre 11-17 semanas de idade, e incluiu ratos machos e fêmeas. Todos os ratos foram alojados em grupo, mantidos em um ciclo de luz 12:12 / escuro com comida e água ad libitum. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais da UCLA e da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research.

NOTA: Todas as drogas e agentes injetáveis ​​são United States Pharmacopeia grau (USP).

1. Preparação cirúrgica

1. Anestes....

Results

Abordagem posterior transcleral injecções sub-retinianas foram realizadas a 31 olhos saudáveis ​​de 16 ratinhos de tipo selvagem com injecções de 0,3 mL (n = 18), 0,5 mL (n = 8) e 1,0 uL (n = 5) de 0,01% de fluoresceína. Um olho foi excluído da injecção devido a uma opacidade da córnea pré-existente que impediu uma análise estrutural e funcional. Todos os olhos injetados está incluído neste relatório. Não há descolamento de retina não intencionais, punções da retina neurossensorial, ou f.......

Discussion

injecções sub-retiniano são o método de escolha para a entrega de vectores virais e terapia derivada de células para a manipulação de fotorreceptores e RPE em investigação básica e clínica de tratamento. Em pacientes, injecções sub-retinianas são tipicamente feitas com uma esclerotomia anterior na pars plana, uma vitrectomia de núcleo e posterior penetração da retina pela agulha com visualização directa. Tal como acontece com a maioria dos procedimentos de vitrectomia, que é comum para a formação de cataratas ocorra pre.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Modelo 62 RN SYR	Hamilton	87942	Seringa x 1
Agulha Hamilton 33 G, 1.0", 20 DEG, ponto 3 (aço inoxidável 304)	Hamilton	7803-05	Agulhas x 6
Tesouras Curvas Vannas	Ted Pella, INC.	1347	Lâmina de 5 mm
Faca de microcirurgia de 22,5 graus	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Cetamina
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xilazina
Fluoresceína 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10 100	mg / ml
0,9% de solução salina USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Pomada antibiótica	Akorn	NDC 17478-235-35	oftálmica
Bomba de Circulação	Gaymar	TP-500 T/Bomba	Nº da peça 07999-000
comercial	sd-OCT	Bioptigen	R-Series
	Research Laboratories	Pinças MICRON III
Tipo 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% Phenylephrine	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Ophthalmic
IMARIS8	Bitplane		Versão 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  2,5%	Goniovisc	AX0401	Colírio de metilcelulose
(enxágue)	Bausch & Microscópio de	solução salina
	Zeiss	Stemi 2000	Microscópio
Fonte de luz	Fostec	P / N 20520	Fonte de luz