Um método de injeção Alternativa e validado para acessar o espaço sub-retiniano via Uma abordagem transcleral Posterior

Summary

As injeções sub-retinianas são a técnica mais comum para administrar grandes agentes terapêuticos, como proteínas e vetores virais, aos fotorreceptores e ao epitélio pigmentar da retina. Um método alternativo em camundongos que atinge com sucesso o espaço sub-retiniano com danos colaterais mínimos e tempos de recuperação rápidos é descrito aqui.

Abstract

injecções sub-retiniano têm sido utilizados com sucesso em humanos e roedores, para realizar intervenções terapêuticas de proteínas, agentes virais, e células para o compartimento interfotoreceptor / sub-retiniano que tem exposição directa à fotorreceptores e epitélio pigmentado da retina (RPE). injecções sub-retiniana de plasminogénio bem como recentes ensaios pré-clínicos e clínicos demonstraram segurança e / ou eficácia de entrega de vectores virais e das células estaminais para indivíduos com doença da retina avançada. modelos de rato da doença da retina, particularmente distrofias da retina hereditária, são essenciais para testar estas terapias. O processo de injecção mais comum em roedores é a utilização de pequenas incisões ou transcorneano transcleral com uma abordagem anterior para a retina. Com esta abordagem, a agulha de injecção penetra a retina neurosensorial perturbar o RPE subjacente e na inserção pode facilmente cortar a lente, fazendo com que a opacificação da lente e comprometimento da Imagi não invasivang. Aceder ao espaço sub-retiniano através de uma transcleral, abordagem posterior evita estes problemas: a agulha atravessa a esclera cerca de 0,5 mm a partir do nervo óptico, retina, sem penetração e evita perturbar o vítreo. Os danos colaterais é limitada a essa associada com a esclerotomia focal e os efeitos de um transiente, descolamento seroso da retina. A simplicidade do método minimiza a lesão ocular, descolamento de retina assegura uma rápida e recuperação, e tem uma taxa de falha baixa. O mínimo de danos na retina e EPR permite a avaliação clara da eficácia e dos efeitos directos dos próprios agentes terapêuticos. Este manuscrito descreve uma nova técnica de injecção sub-retinal, que pode ser utilizado para alvejar vectores virais, agentes farmacológicos, as células estaminais ou células estaminais pluripotentes induzidas (IPS) para o espaço sub-retiniano em ratos com uma elevada eficácia, danos mínimos, e rápida recuperação.

Introduction

Injecções sub-retiniana são o principal meio de entrega de agentes celulares e virais para as retinas de ratos para estudar seus efeitos sobre fotorreceptores e EPR subjacente a ^1,2. A maioria dos protocolos de injecção subretinal em ratinhos usar um transcorneano ou um local de injecção anterior transcleral ao equador (Figura 1). Esta abordagem pode resultar em danos colaterais inerente que inclui nicking e turvação resultante da lente, perturbação da integridade do vítreo, a penetração da retina neurosensorial e íris, hemorragia da retina, descolamento da retina e o edema substanciais sub-retiniano duradoura ^3-9. Manipulações experimentais devem superar estes efeitos, a fim de avaliar os efeitos de intervenções terapêuticas ^3,7,10,11. Este estudo fornece uma descrição detalhada e validação de um método de injeção transcleral posterior que evita estas complicações, minimiza o trauma e tem uma elevada taxa de sucesso de alvejar o subespaço da retina.

Injeções orientadas para o espaço sub-retiniano em ratos são muitas vezes muito difícil de realizar e a maioria dos investigadores encontram uma elevada frequência de tentativas falhadas em que o vector é entregue a um local incorreto ou se houver danos na retina significativo, por exemplo, em um descolamento de retina completa ^6. O número de olhos excluídas da análise por causa de complicações de injeção normalmente não consta em estudos com ratos, mas em nossa própria experiência e em discussão com outros investigadores, o número de injeções falhou pode ser tão alta quanto 50% e variam dependendo da experiência e capacidades do investigador que está realizando as injeções. O êxito da injecção é tipicamente avaliada por imagiologia fundus directa e / ou tomografia de coerência óptica (OCT) ^7,9. Um método facilmente dominado com altas taxas de sucesso para injecções sub-retinianas em ratos pode acelerar a experimentação e reduzir o custo dos estudos pré-clínicos de treatments para doenças da retina que são as principais causas de cegueira nos Estados Unidos.

O posterior, técnica de injeção sub-retiniana transcleral aqui descrito é uma adaptação de protocolos clínicos e pré-clínicos ^9,12. Os diagnósticos não invasivos realizados em camundongos injetados demonstrar danos leves e altamente localizada e falta de lentes de garantia adicional, lesão da retina e EPR. Além disso, com relativamente pouco prática, um experimentador pode conseguir esses resultados com uma taxa de sucesso alta (80 - 90% ou mais), reduzindo assim os custos associados a esses estudos. Este procedimento pode ser usado para entregar intervenções terapêuticas celulares, virais, ou farmacológicos para fotorreceptores e / ou RPE em estudos pré-clínicos e facilmente avaliar intervenções experimentais.

Protocol

Animais: tipo selvagem camundongos C57BL / 6J criados na Universidade da Califórnia em Los Angeles (UCLA). Todos os animais tinham entre 11-17 semanas de idade, e incluiu ratos machos e fêmeas. Todos os ratos foram alojados em grupo, mantidos em um ciclo de luz 12:12 / escuro com comida e água ad libitum. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais da UCLA e da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research.

NOTA: Todas as drogas e agentes injetáveis ​​são United States Pharmacopeia grau (USP).

1. Preparação cirúrgica

1. Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e de 8 mg / kg de xilazina em uma mistura de solução salina. Administrar anestesia a uma profundidade tal que o rato não tem qualquer aperto do dedo do pé ou reflexos de toque da córnea.
2. Manter a temperatura corporal a 37,0 ° C com uma almofada de água circulante.
3. Dilatar os alunos com 2,5% de fenilefrina olho dROPS e aparar bigodes para facilitar a visualização. Suiças fornecer entrada sensorial significativa para o rato, por conseguinte, suiça aparar só deve remover a porção que bloqueia o acesso desobstruído para o olho, e não para a base da caixa de bigodes. Em nossa experiência, os ratos mostram recuperação normal após este procedimento. Aplicar olho metilcelulose cai para prevenir o ressecamento e minimizar anestésicos induzidas catarata transitória ^13.
4. Esterilizar instrumentos antes da cirurgia (ou seja, betadine e etanol ou esferas de ferro).
5. Prepare fluoresceína diluído (0,01% utilizando solução salina 0,9%) em um ambiente estéril (isto é, cabine de segurança biológica), se a visualização será realizada (ver secção 3 abaixo).

2. Injeção Preparação do Site

1. Prepara-se uma seringa (por exemplo, seringa de 5 mL) com o volume adequado de injecção (por exemplo, 0,3 a 1,0 mL).
2. Posicione o mouse para que o olho é voltado para cima e claramente visível no dissecting microscópio.
3. Aperte suavemente a conjuntiva temporal com uma pinça de ponta fina. Faça uma incisão circular de aproximadamente 90 graus usando curvas tesouras Vannas.
4. Repita o passo 2.3 com a cápsula de Tenon subjacente.
5. Ressecção do tecido conjuntivo circundante com uma pinça de ponta fina enquanto gira o globo por via nasal. Trabalhar para o local de injecção de aproximadamente 0,5 milímetros temporal com o nervo óptico. Use muito cuidado para evitar a interrupção do seio retro-orbital.

3. esclerotomias e sub-retiniana Injection

NOTA: Recomenda-se que a injecção de 0,01% de fluoresceína em 0,9% de solução salina ser utilizados para auxiliar na visualização enquanto aprende este procedimento. A distribuição topográfica da fluoresceína pode ser efetivamente documentada com imagens de fundo de olho (ver secção 4).

1. Fazer uma pequena incisão da esclerótica no local da injecção por raspagem suave a ocular com uma lâmina oftálmica 22,5 graus. Este shou incisãoúnica ld ser grande o suficiente para permitir que a ponta da agulha passe através da esclerótica.
2. Insira o chanfrada 33 agulha G (dobrado. 5 - 10 ° para o esclerotomia com o bisel voltado e paralela angular para a retina Injectar volume desejado (por exemplo, 0,3 a 1,0 l de 0,01% Fluoresceína para fins de aprendizagem).
   NOTA: manter a esterilidade da seringa através da limpeza cuidadosamente com lavagens sucessivas de um solvente adequado e água desionizada antes de cada injecção.
3. Empurrar o êmbolo devagar (mais de ~ 3 seg), sem mover a agulha e, mesmo com pressão.
   NOTA: Quando a agulha está no espaço sub-retiniano, uma ligeira resistência será sentida enquanto pressiona o êmbolo. Não haverá a resistência mínima, se a agulha perfura a retina, e alta resistência, se a agulha não penetra a esclera ou EPR.
4. Aguarde alguns segundos antes de retirar a agulha para minimizar o refluxo.
5. Lavar os olhos com solução salina tamponada estéril e garantir o olho hcomo rodado de volta à sua posição normal.

4. Avaliação da Retinal Detachment por PTU e Fundus Imagiologia

1. Realizar imagem outubro imediatamente após a injecção para avaliar a qualidade da injecção e no tempo adequado aponta pós-injecção conforme necessário, para avaliar a estrutura retiniana.
   NOTA: Os exemplos da utilização de outubro em estudos semelhantes foi anteriormente descrito ^7,14.
   1. Ajustar e alinhar a imagem OCT para atingir o local de injecção. O local de injecção deve ser linha média e 0,5 milímetros temporal com a cabeça do nervo óptico. Repita conforme necessário, se o destacamento está fora do quadro ou não otimamente centrado.
2. Visualize descolamento da retina e tingir área de injeção com en-face fundus imaging ^7,14.
   NOTA: Se um sistema de imagem outubro não está disponível, a injeção de uma pequena quantidade de fluoresceína com um vector para a prática irá permitir a visualização em qualquer câmara de fundo que realiza fluoresceína angiografia usando os mesmos comprimentos de onda de excitação e de filtros de bloqueio. áreas localizadas de hiper-fluorescência aparece debaixo da vasculatura e da vasculatura terá fronteiras nítidas e distintas se o espaço sub-retiniano é direcionado corretamente. O bordo da bolha a partir da injecção será delimitada pela transição da hiper- a fluorescência hipo. Vários instrumentos fornecem esse recurso para o rato; a instrumentação utilizada aqui é descrito noutro local ^14.

Cuidados 5. Pós-operatório

1. Aplique uma camada grossa de creme oftálmica antibiótico triplo para a superfície da córnea do olho injetado.
2. Coloque os ratos em gaiolas solitários limpas para recuperação. Não combine ratos que foram submetidos a cirurgia até que sejam totalmente recuperado.
3. Monitorar a respiração e temperatura durante a recuperação da anestesia. Monitorar os animais até que eles possam manter decúbito esternal.
4. Realizar o monitoramento pós-operatória complementar adequadoe tratamento, incluindo uma injecção sub-cutânea de carprofeno (5 mg / kg) para pós-cirúrgica a gestão da dor.

6. Avaliação da função da retina por Eletrorretinografia (ERG)

1. Realizar análise ERG pré-injecção e em momentos adequados após a injecção, conforme necessário para avaliar a função da retina. Se a injecção foi feita para o espaço sub-retiniano, o descolamento da retina devem resolver dentro de 72 h.
   1. Use técnicas ERG padrão para avaliar a função da retina, antes e após a injeção, como descrito anteriormente ^14,15.

7. Reconstrução 3D e quantificação da bolha Volume

NOTA: OCT exames com contraste elevado englobando todo o destacamento dentro do quadro de vista são ideais para uso. ImageJ / Fiji ^17,18 e Imaris foram usadas, mas outro software pode ser utilizado.

1. Exportar o b-scan de interesse, importação para ImageJ / Fiji e cultura (Imagem> Cortar) a parte do sc outubroum a ser modelado usando a ferramenta de seleção retangular.
   1. Ajustar o contraste (Image> Adjust> Brightness / Contrast) e delimitar quaisquer limites em falta, ligando duas seções com uma linha.
   2. Desenhar uma linha reta com o (shift holding) ferramenta de linha que atravessa o RPE para a camada de fotorreceptores. Medida (Analisar> Medida) o comprimento da linha para obter o tamanho de máximo afastamento para o passo 7.8.
2. Import cortada quadros para o software 3D-reconstrução (Ver Tabela de Materiais), utilizando o "RGB para cinza" plugin e MATLAB Compiler Runtime.
3. Defina o tamanho do voxel (em Propriedades de imagem) usando os parâmetros de calibração da verificação outubro (x, y, z).
4. Execute o "RGB para Gray" plug-in (em Propriedades de imagem), com igual ponderação para cada canal, para criar um quarto canal. Excluir canais vermelho-verde-azul original.
5. Inverter o canal cinza usando mudança de contraste. Image Store.
6. Clique no botão "adicionar umsuperfície ew "botão na guia 3D-View, e começar o guiada 4 passo processo de criação da superfície.
   1. Definir o nível de detalhe de superfície (etapa 1 de 4).
      NOTA: Em nossa experiência 8,0-12,0 era a gama mais eficaz.
   2. Defina o tamanho da esfera máximo (em Seleção de fundo) para um pouco menos que o tamanho máximo desprendimento medido no ponto 7.1.2. Criar a superfície e desfazer cinza inversão de canal (passo 2 de 4).
   3. Definir o limite para o valor máximo para a superfície dos espaços negativos fora da retina e o desprendimento não entram em contacto (passo 3 de 4).
   4. Definir o tipo de filtro para o número de voxeis e isolar o espaço negativa no local de descolamento por tamanho. Terminar a superfície (passo 4 de 4).
      NOTA: O volume da superfície de desprendimento está localizado sob o volume na guia estatísticas.

Results

Abordagem posterior transcleral injecções sub-retinianas foram realizadas a 31 olhos saudáveis ​​de 16 ratinhos de tipo selvagem com injecções de 0,3 mL (n = 18), 0,5 mL (n = 8) e 1,0 uL (n = 5) de 0,01% de fluoresceína. Um olho foi excluído da injecção devido a uma opacidade da córnea pré-existente que impediu uma análise estrutural e funcional. Todos os olhos injetados está incluído neste relatório. Não há descolamento de retina não intencionais, punções da retina neurossensorial, ou f...

Discussion

injecções sub-retiniano são o método de escolha para a entrega de vectores virais e terapia derivada de células para a manipulação de fotorreceptores e RPE em investigação básica e clínica de tratamento. Em pacientes, injecções sub-retinianas são tipicamente feitas com uma esclerotomia anterior na pars plana, uma vitrectomia de núcleo e posterior penetração da retina pela agulha com visualização directa. Tal como acontece com a maioria dos procedimentos de vitrectomia, que é comum para a formação de cataratas ocorra pre...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Modelo 62 RN SYR	Hamilton	87942	Seringa x 1
Agulha Hamilton 33 G, 1.0", 20 DEG, ponto 3 (aço inoxidável 304)	Hamilton	7803-05	Agulhas x 6
Tesouras Curvas Vannas	Ted Pella, INC.	1347	Lâmina de 5 mm
Faca de microcirurgia de 22,5 graus	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Cetamina
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xilazina
Fluoresceína 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10 100	mg / ml
0,9% de solução salina USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Pomada antibiótica	Akorn	NDC 17478-235-35	oftálmica
Bomba de Circulação	Gaymar	TP-500 T/Bomba	Nº da peça 07999-000
comercial	sd-OCT	Bioptigen	R-Series
	Research Laboratories	Pinças MICRON III
Tipo 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% Phenylephrine	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Ophthalmic
IMARIS8	Bitplane		Versão 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  2,5%	Goniovisc	AX0401	Colírio de metilcelulose
(enxágue)	Bausch & Microscópio de	solução salina
	Zeiss	Stemi 2000	Microscópio
Fonte de luz	Fostec	P / N 20520	Fonte de luz