Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Drosophila é amplamente usado como um sistema modelo para estudar a neurodegeneração. Este protocolo descreve um método pelo qual a degeneração, como determinado pela formação de vacúolo no cérebro, podem ser quantificados. Ela também minimiza os efeitos devido ao procedimento experimental por meio de processamento e controlo de moscas e de seccionamento experimentais como uma amostra.

Resumo

doenças neurodegenerativas progressivas como a doença de Alzheimer (AD) ou a doença de Parkinson (DP) é uma ameaça crescente para a saúde humana em todo o mundo. Embora os modelos de mamíferos forneceram importantes insights sobre os mecanismos subjacentes da patogenicidade, a complexidade dos sistemas de mamíferos, juntamente com seus altos custos estão limitando a sua utilização. Portanto, o simples, mas bem estabelecida modelo de sistema de Drosophila fornece uma alternativa para investigar as vias moleculares que são afetados nessas doenças. Além défices comportamentais, doenças neurodegenerativas são caracterizadas por fenótipos histológicos, tais como a morte neuronal e axonopatia. Para quantificar a degeneração neuronal e determinar como ela é afetada por fatores genéticos e ambientais, usamos uma abordagem histológica que é baseado na medição dos vacúolos no cérebro mosca adulta. Para minimizar os efeitos do erro sistemático e comparar diretamente as seções de controle e expmoscas erimental em uma preparação, usamos o método "colar" para cortes de parafina. A neurodegeneração é então avaliada medindo o tamanho e / ou o número de vacúolos que se desenvolveram no cérebro da mosca. Isto pode ser feito concentrando-se em uma região específica de interesse ou analisando todo o cérebro através da obtenção de cortes seriados que se estendem da cabeça completa. Por conseguinte, este método permite um para medir não só a degeneração severa mas também fenótipos relativamente suaves que só são detectáveis ​​em algumas secções, como ocorre durante o envelhecimento normal.

Introdução

Com o aumento da expectativa de vida, doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer ou de Parkinson tornaram-se uma ameaça crescente de saúde para a população em geral. De acordo com os Institutos Nacionais de Saúde, 115 milhões de pessoas em todo o mundo estão previstos para ser afetada pela demência em 2050. Embora um progresso significativo tem sido feito na identificação de genes e fatores de risco envolvidos em pelo menos algumas dessas doenças, para muitos deles, o subjacente mecanismos moleculares ainda são desconhecidos ou não bem compreendida.

Simples organismos modelo de invertebrados como Caenorhabditis elegans

Protocolo

1. Fixação da cabeça em coleiras e inclusão em parafina

Nota: Todos os passos no processo de fixação deve ser feito numa hotte. Metilbenzoato, embora não representam um risco para a saúde, tem um odor altamente distinta, que pode ser avassaladora se não for tratado em um exaustor.

1. Antes de anestesiar as moscas, fazem-se 50 ml de solução de Carnoy por adição de 15 ml de clorofórmio e 5 ml de ácido acético glacial e 30 mL de etanol a 99% (não se misturam o clorofórmio e ácido acético). Derramá-lo num recipiente de vidro com um fundo plano, tal como um prato cristalizadas, para garantir que os colares podem estabelecer plana e são completamente cobert....

Resultados

Usando os resultados do método descrito em cortes seriados corados pelo pigmento do olho ^33, que abrangem toda a cabeça da mosca. Uma parte desta é mostrado na Figura 1B, em que as secções de uma cabeça individual são mostrados de cima para baixo. As secções de diferentes moscas são vistos esquerda para a direita neste exemplo. Para facilitar a orientação e a identificação das moscas, de uma mosca sem olhos (oculis seno) é inserido como um marcador na.......

Discussão

O método descrito fornece um meio para quantificar a neurodegeneração no cérebro de Drosophila. Enquanto que outros métodos, tais como contagem de um tipo celular específico, pode ser usado para identificar a neurodegeneração, a vantagem deste método é que ele pode ser aplicada de modo mais geral. Contar as células requer que estas células podem ser identificadas com fiabilidade utilizando quer um anticorpo específico ou a expressão de um marcador específico de células, a qual não está sempre disponível. Além d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do Reagente/Equipamento	Número	Catálogo
da Empresa Coleira	Genesee Scientific	TS 48-100	Estamos usando colares personalizados que são feitos de uma peça de metal em vez de camadas como as da Genesee. Uma descrição sobre como fazer coleiras pode ser encontrada em http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Bandeja de cubos de gelo de borracha para embutir	Loja		O tamanho pode ser feito sob medida, colando em paredes adicionais
Prato de cristalização	Fisher Scientific company	08-762-3
Éter	Fisher Scientific Company	E138-1
Etanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Ácido Acético Glacial	Fisher Scientific Company	A38-212
Metilbenzoato	Fisher Scientific Company	M205-500	Odor Distinto - Use em capela de exaustão!
Cera de Parafina de Baixo Ponto de Fusão	Fisher Scientific Company	T565	Certifique-se de manter o extra derretido em um 65° C
Micrótomo	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Lâmina de Microscópio	Fisher Scientific Company	12-550D
Vidro de Cobertura de Microscópio	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Três recipientes diferentes para lavagens
Frasco de Coloração Vertical com Capa	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Solução de Poli-L-Lisina (PLL)	Sigma Life Science	P8290-500

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