Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em Drosophila

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a neurodegeneração no cérebro da Drosophila, causada por uma variedade de fatores, incluindo idade, modificações genéticas ou influências ambientais, sem a necessidade de coloração específica. Este método é muito útil na análise de questões-chave no campo das doenças neurodegenerativas. Por exemplo, quais genes ou fatores ambientais causam ou contribuem para essas doenças?

A principal vantagem deste método é que ele evita ou minimiza erros sistemáticos porque as moscas de controle e as moscas experimentais são tratadas como uma amostra. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, porque é preciso prática para garantir que a área correta do cérebro esteja no slide e para evitar danos que possam ocorrer durante o corte. Para começar, primeiro use uma pinça para enfiar as moscas do sujeito pelo pescoço nas golas.

Alinhe todas as cabeças na mesma orientação e certifique-se de que não ocorram danos na cabeça ou nos olhos. Inclua moscas Senoculus sem olhos em posições aleatórias e conhecidas para que a ordem das moscas possa ser facilmente identificada nas seções. Além disso, se a cepa de mosca de interesse tiver olhos claros ou brancos, enfie moscas de olhos vermelhos em intervalos ao longo da tira, para garantir que haja pigmento suficiente para manchar a lâmina.

Registre a ordem das moscas, juntamente com o número do colarinho, se mais de um for usado. Assim que um colar estiver pronto, coloque-o na solução de Carnoy por três vírgula cinco a quatro horas. Realize uma série de lavagens com etanol, benzoato de metila e parafina para preparar o tecido da mosca para incorporação.

Em seguida, coloque os colares em uma bandeja de cubos de gelo de borracha, em cada seção. Despeje delicadamente a parafina derretida sobre os colares, evitando bolhas de ar e deixe endurecer durante a noite. Remova os blocos de parafina que contêm os colares da bandeja.

Separe o bloco de parafina do colarinho, usando uma lâmina de barbear. Quebrando suavemente a coleira. Os corpos permanecerão no colarinho, enquanto as cabeças ficarão no bloco de parafina.

Para seccionar o tecido, primeiro aqueça uma placa de aquecimento a 50 graus Celsius. Coloque todas as ferramentas que entrarão em contato com a cera, como lâminas de barbear ou blocos de montagem de metal na placa para aquecer. Determine a orientação desejada para o corte e, em seguida, conecte o segmento de parafina ao bloco de montagem, fundindo-o brevemente no lado de contato.

Com uma lâmina de barbear, corte o excesso de parafina das cabeças das moscas, de modo que apenas uma pequena fileira contendo as cabeças embutidas permaneça. Coloque o bloco de montagem no porta-objetos do micrótomo, alinhando as cabeças paralelamente à borda da lâmina. Corte sete seções de micrômetros e transfira a fita de seções para lâminas de microscópio.

Coloque as lâminas em um prato aquecido a 37 graus Celsius por cerca de um minuto, para permitir que a fita se expanda. Remova o excesso de água e coloque as lâminas para secar ainda mais durante a noite. Depois de seco, remova a cera de parafina colocando as lâminas verticalmente em um frasco alto de coloração de lâminas, cheio de agente de desparafinização por 30 minutos a uma hora.

Repita esta lavagem três vezes. Por fim, remova as lâminas do frasco e coloque duas gotas de mídia de incorporação em cada uma. Cubra as seções com uma lamínula grande e deixe as lâminas secarem por um a dois dias.

Sob baixa ampliação em um microscópio de fluorescência, determine a orientação do cérebro e concentre-se na região de interesse. Assim que essa região for identificada, tire as imagens necessárias. Usando o software de imagem, conte o número de vacúolos por cabeça.

Meça o tamanho do vacúolo selecionando o vacúolo de interesse e determinando o número de pixels cobertos. Esta imagem mostra seções de diferentes cabeças de mosca orientadas da esquerda para a direita. De cima para baixo, são visualizadas seções seriais da mesma cabeça de mosca.

A mosca de controle do Senoculus sem olhos é indicada pela seta. As seções são manchadas pelo pigmento ocular fluorescente naturalmente presente que lava as seções durante o corte. Seções de cabeça de parafina de moscas Swiss Cheese One de sete, 14 e 21 dias mostram um aumento progressivo relacionado à idade no número e na área do vacúolo.

Essa degeneração é quantificável contando os vacúolos e calculando a área combinada e considerada significativa. Da mesma forma, em moscas do tipo selvagem, a neurodegeneração demonstrou ocorrer com a idade. No exame de seções de cabeça de moscas do tipo selvagem de 10, 30 e 60 dias, poucos ou nenhum vacúolo foram vistos na condição de 10 dias.

Nos cérebros dos indivíduos de 30 dias, vacúolos estavam começando a se formar. Nos indivíduos de 60 dias, vacúolos significativamente maiores e de maior área estavam presentes. Uma vez dominadas, as seções podem estar disponíveis para análise dentro de uma semana.

Ao usar este procedimento, é importante registrar cuidadosamente a ordem das moscas na coleira. Para garantir que você possa identificá-los mais tarde, após a análise. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar as seções e quantificar a neurodegeneração encontrada no cérebro da Drosophila.