Name: Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprenda a quantificar neurodegeneração em Drosophila usando histologia em massa sem coloração específica. Este método minimiza erros sistemáticos ao processar amostras de controle e experimentais juntas.

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Este trabalho foi apoiado por doações para DK da Medical Research Foundation of Oregon e do NIH / NINDS (NS047663). ES foi apoiado por uma bolsa de treinamento do NIH (T32AG023477).

1. Fixação da cabeça em coleiras e inclusão em parafina Nota: Todos os passos no processo de fixação deve ser feito numa hotte. Metilbenzoato, embora não representam um risco para a saúde, tem um odor altamente distinta, que pode ser avassaladora se não for tratado em um exaustor. <ol><li> Antes de anestesiar as moscas, fazem-se 50 ml de solução de Carnoy por adição de 15 ml de clorofórmio e 5 ml de ácido acético glacial e 30 mL de etanol a 99% (não se misturam o clorofórmio e ácido acético). Derramá-lo num recipiente de vidro com um fundo plano, tal como um prato cristalizadas, para garantir que os colares podem estabelecer plana e são completamente cobertas com a solução. </li><li> Anestesiar as moscas com CO 2 ou éter. </li><li> moscas de rosca (até 20 com a maioria dos colares) por seus pescoços para os colares usando uma pinça. Recorde para alinhar todos os cabeças com a mesma orientação, como pode ser visto na Figura 1A, e ser suave para assegurar que não se verifiquem danos na cabeça ou olhos. </li><li> Incluir moscas seno Oculis (setas, Figura 1A) em posições aleatórias para que a ordem das moscas podem ser facilmente identificados nas secções. Além disso, se as moscas experimentais têm uma cor branca ou clara do olho, passe algumas moscas de olhos vermelhos, tais como o tipo selvagem, entre elas para assegurar que o pigmento está presente suficiente para corar a corrediça. Grave a ordem das moscas sobre a folha de protocolo em conjunto com o número colar se utilizar mais do que um anel. </li><li> Uma vez que um colar foi terminado, colocá-lo em solução de Carnoy preparado para 3,5-4 h. </li><li> Despejar a solução Carnoy dentro do recipiente eliminação adequada e começar as lavagens de etanol. Certifique-se lentamente para derramar, de modo a não perturbar a colocação dos colares no recipiente. </li><li> Lavar os colares durante 30 min em 99% de etanol duas vezes. </li><li> Lavar os colares em 100% de etanol durante 1 h. Certifique-se de alterar as lavagens a tempo para evitar overdehydration. </li><li> Coloque os colares em metilbenzoatoO / N à temperatura ambiente. Fecha-se o recipiente com parafilme para evitar a evaporação do metilbenzoato. </li><li> Verter a methylbenozate para dentro do recipiente descartável adequado na hotte. Adicionar uma mistura previamente preparada de 1: 1 de baixo ponto de fusão (56-57 ° C), cera de parafina e metilbenzoato de metilo. A partir deste ponto, os colares devem ser mantidas numa incubadora a 65 ° C para se certificar de que a parafina não endurece. </li><li> Deite a mistura de parafina e methylbenozate para dentro do recipiente descartável adequado, e derramar a cera de parafina puro fundido, mantido a 65 ° C, para os colares. </li><li> Alterar a parafina depois de 30 min e repita este pelo menos 5 vezes. Pelo menos 6 - 8 lavagens devem ser executadas. </li><li> Uma vez que as lavagens são completos, coloque os colares em uma bandeja de cubos de gelo de borracha com ranhuras de aproximadamente o tamanho dos colares. Despeje parafina derretida sobre eles até que esteja completamente coberto e deixe-a endurecer O / N (tentar evitar bolhas de ar). </li><li> Remova os blocos de parafina containing os colares da bandeja de cubos de gelo. Separa-se o bloco de parafina a partir da gola utilizando uma lâmina de barbear, suavemente romper o colar. As cabeças estará no bloco de parafina ao passo que os corpos vão ficar na gola. Os blocos podem ser mantidos à temperatura ambiente. </li><li> Para limpar os colares, mergulhe-os em um agente desparafinização a 65 ° C para remover a parafina, limpo esfregando-se ligeiramente, e lave em etanol antes de reutilizar. </li></ol> 2. corte e montagem <ol><li> Aquecer uma placa de aquecimento a 50 ° C. Coloque os titulares objeto (ou blocos de montagem de metal) e lâminas de barbear sobre a placa e deixá-los aquecer. </li><li> Dependendo da orientação desejada para a secção transversal, e anexar o bloco de parafina, quer com as cabeças para o lado (para secções horizontais) ou virada para cima (para secções frontais) a um bloco de montagem aquecida (derretendo brevemente o bloco no lado do contacto). Remover o bloco da placa de aquecimento e deixe-o esfriar por pelo menos 10 min para assegurar que a parafina é endurecido o suficiente para uma vedação adequada para o bloco de montagem. Manter a fila de cabeças alinhadas em paralelo com a superfície do bloco, tanto quanto possível para evitar desnivelamentos. </li><li> Pegue uma lâmina de barbear e aparar o excesso de parafina longe das cabeças de mosca de modo que apenas uma pequena fila com os chefes incorporados permanece (a lâmina de barbear pode ser aquecido para corte mais fácil). Certifique-se de não cortar muito para que a parafina não quebra durante o corte (mais corte pode ser feito durante o corte). </li><li> Colocar o bloco de montagem no suporte do objecto do micrótomo e assegurar que o alinhamento da fila de cabeças é tão paralela quanto possível da aresta da lâmina. </li><li> Preparar lâminas de microscópio, cobrindo-os com uma camada fina de-L-lisina de poli (PLL) solução e deixar secar durante 5 min. Cubra-os com água imediatamente antes da utilização. </li><li> Cortar 7 uM secções e transferir a fita de secções para a corrediça que flutua na água. &lt;br /&gt; NOTA: Para obter o cérebro inteiro para seções horizontais, recolhemos a fita de quando iniciar o corte no olho até que a cabeça foi completamente cortado (corte a partir a tromba para dentro do cérebro). Mais de um slide pode ser necessário para toda a cabeça. </li><li> Colocar a lâmina numa placa de calor a 37 ° C e permitir que a fita para expandir durante cerca de 1 min. </li><li> Retire o excesso de água (por vazamento-lo ou usando um tecido) e secar a diapositivos O / N. </li><li> Remover a cera de parafina a partir do slide, colocando os diapositivos numa altura, vertical frasco deslizante de coloração com um agente desparafinização (cobrindo completamente as secções). Realizar 3 lavagens de 30 min - 60 min cada. </li><li> Remover o slide da lavagem final. Coloque 2 gotas de meios de incorporação para o slide e cobri-lo com uma lamela grande. </li></ol> 3. fotografando e analisando as Secções <ol><li> Permitir que as lâminas preparadas para secar por 1-2 d. Em seguida, examiná-los em um microsc fluorescênciaope sob a luz azul. </li><li> Utilize uma ampliação menor para determinar a orientação das moscas e para encontrar a região de interesse se concentrando-se em uma região específica. NOTA: Para as moscas SWS (ver Figura 2), encontramos a seção que contém a grande comissura e tomar uma imagem (geralmente em 40X). Ao analisar todo o cérebro (como na Figura 3), que percorrer todas as secções de uma cabeça e quer fotografar a secção com o fenótipo mais grave ou todas as secções que mostram vacúolos. </li><li> Para uma análise duplo-cego, tomar e imagens numéricas sem saber o genótipo e anote o número colarinho e posição da cabeça na linha de identificá-los mais tarde. </li><li> Depois que as imagens foram tomadas, analisá-los usando um software de imagem. </li><li> Contar o número de vacúolos por secção ou por cabeça. Para medir o tamanho vacúolo, abrir as imagens em um programa de software e selecionar os vacúolos com uma seleção muitoeu. Determinar a quantidade de pixels nos vacúolos seleccionados. </li><li> Para a conversão para mm 2, tirar uma foto de um slide de calibração estágio micrômetro na ampliação usada para a aquisição de fotos. Determinar a quantidade de pixels em 100 uM 2 para calcular um factor de conversão. </li><li> Converter o número total de pixels em 2 uM dividindo o número de pixels de acordo com o factor de conversão calculado no passo acima. </li></ol>

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<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+expression+of+polyglutamine+proteins+induce+behavioral+changes+and+aggregate+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila.</a> Glia. 49, 59-72 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O método descrito fornece um meio para quantificar a neurodegeneração no cérebro de Drosophila. Enquanto que outros métodos, tais como contagem de um tipo celular específico, pode ser usado para identificar a neurodegeneração, a vantagem deste método é que ele pode ser aplicada de modo mais geral. Contar as células requer que estas células podem ser identificadas com fiabilidade utilizando quer um anticorpo específico ou a expressão de um marcador específico de células, a qual não está sempre disponível. Além d...

Com o aumento da expectativa de vida, doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer ou de Parkinson tornaram-se uma ameaça crescente de saúde para a população em geral. De acordo com os Institutos Nacionais de Saúde, 115 milhões de pessoas em todo o mundo estão previstos para ser afetada pela demência em 2050. Embora um progresso significativo tem sido feito na identificação de genes e fatores de risco envolvidos em pelo menos algumas dessas doenças, para muitos deles, o subjacente mecanismos moleculares ainda são desconhecidos ou não bem compreendida. Simples organismos modelo de invertebrados como Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster oferecem uma variedade de vantagens experimentais para estudar os mecanismos de doenças neurodegenerativas, incluindo um ciclo de vida curta, grande número de descendentes, e da disponibilidade de métodos genéticos e moleculares bem estabelecidas e, por vezes únicas 1 -12. Além disso, estes organismos são passíveis de imparcialtelas de interação que podem identificar fatores que contribuem para estas doenças por seus efeitos agravantes ou melhorar em fenótipos neurodegenerativas. Analisar tais interações genéticas e avaliar os efeitos do envelhecimento requer protocolos quantitativos para detectar neurodegeneração e medir a sua gravidade. Esta avaliação pode ser feita de forma relativamente fácil quando se mede aspectos comportamentais em Drosophila, como a aprendizagem olfactiva, geotaxis negativos, ou fototaxia rápido, que fornecem um valor de desempenho numérico 13-21. É também possível determinar os efeitos sobre a sobrevivência neuronal contando os neurónios. No entanto, isso só é possível quando o foco em uma população específica que é claramente identificável, como os neurónios dopaminérgicos que são afectados na doença de Parkinson, e mesmo assim, os resultados têm sido controversos 22-24. O protocolo aqui descrito utiliza o método de colar para realizar cortes seriados de parafina, um métodoque foi originalmente desenvolvido por Heisenberg e Böhl, que o usou para isolar mutantes cerebrais anatômicas em Drosophila 25. A utilização do método de colar foi subsequentemente adaptado, incluindo em criocortes, vibratome secções, e secções de plástico 26-28. Aqui, este método é empregue para obter secções em série de toda a cabeça da mosca, que pode então ser utilizado para medir os vacúolos que se desenvolvem em moscas com fenótipos 16,21,29-32 neurodegenerativas. Estas medições podem ser feitas em regiões específicas do cérebro, ou pode cobrir todo o cérebro; esta última abordagem permite um para identificar os fenótipos fracos mesmo degenerativas, como observado durante o envelhecimento. Finalmente, quando se utiliza os colares, até 20 moscas pode ser processada como uma preparação, que não só é menos demorado, mas também permite a análise de controlo e as moscas experimentais na mesma preparação, minimizando artefactos devido a ligeiras alterações na a preparação.

<table><tbody><tr><td>Nome do Reagente/Equipamento</td><td>Número</td> de <td>Catálogo</td><td></td></tr><tr><td>da Empresa Coleira</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>Estamos usando colares personalizados que são feitos de uma peça de metal em vez de camadas como as da Genesee. Uma descrição sobre como fazer coleiras pode ser encontrada em http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&nbsp;</td></tr><tr><td>Bandeja de cubos de gelo de borracha para embutir</td><td>Loja</td><td></td> doméstica <td>O tamanho pode ser feito sob medida, colando em paredes adicionais&nbsp;</td></tr><tr><td>Prato de cristalização</td><td>Fisher Scientific company</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>Éter</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Metilbenzoato</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>Odor Distinto - Use em capela de exaustão!</td></tr><tr><td>Cera de Parafina de Baixo Ponto de Fusão</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>Certifique-se de manter o extra derretido em um 65&deg; C</td></tr><tr><td>Micrótomo</td> de Banho de Água <td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Microscópio</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura de Microscópio</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>Três recipientes diferentes para lavagens</td></tr><tr><td>Frasco de Coloração Vertical com Capa</td><td>Ted Pella Inc.&nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Poli-L-Lisina (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

mass histologia para quantificar neurodegeneração em<em&gt; drosophila</em

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

doenças neurodegenerativas progressivas como a doença de Alzheimer (AD) ou a doença de Parkinson (DP) é uma ameaça crescente para a saúde humana em todo o mundo. Embora os modelos de mamíferos forneceram importantes insights sobre os mecanismos subjacentes da patogenicidade, a complexidade dos sistemas de mamíferos, juntamente com seus altos custos estão limitando a sua utilização. Portanto, o simples, mas bem estabelecida modelo de sistema de Drosophila fornece uma alternativa para investigar as vias moleculares que são afetados nessas doenças. Além défices comportamentais, doenças neurodegenerativas são caracterizadas por fenótipos histológicos, tais como a morte neuronal e axonopatia. Para quantificar a degeneração neuronal e determinar como ela é afetada por fatores genéticos e ambientais, usamos uma abordagem histológica que é baseado na medição dos vacúolos no cérebro mosca adulta. Para minimizar os efeitos do erro sistemático e comparar diretamente as seções de controle e expmoscas erimental em uma preparação, usamos o método &quot;colar&quot; para cortes de parafina. A neurodegeneração é então avaliada medindo o tamanho e / ou o número de vacúolos que se desenvolveram no cérebro da mosca. Isto pode ser feito concentrando-se em uma região específica de interesse ou analisando todo o cérebro através da obtenção de cortes seriados que se estendem da cabeça completa. Por conseguinte, este método permite um para medir não só a degeneração severa mas também fenótipos relativamente suaves que só são detectáveis ​​em algumas secções, como ocorre durante o envelhecimento normal.

Usando os resultados do método descrito em cortes seriados corados pelo pigmento do olho 33, que abrangem toda a cabeça da mosca. Uma parte desta é mostrado na Figura 1B, em que as secções de uma cabeça individual são mostrados de cima para baixo. As secções de diferentes moscas são vistos esquerda para a direita neste exemplo. Para facilitar a orientação e a identificação das moscas, de uma mosca sem olhos (oculis seno) é inserido como um marcador na...

Drosophila é amplamente usado como um sistema modelo para estudar a neurodegeneração. Este protocolo descreve um método pelo qual a degeneração, como determinado pela formação de vacúolo no cérebro, podem ser quantificados. Ela também minimiza os efeitos devido ao procedimento experimental por meio de processamento e controlo de moscas e de seccionamento experimentais como uma amostra.

Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a neurodegeneração no cérebro de Drosophila, causada por diversos fatores, incluindo idade, modificações genéticas ou influências ambientais, sem a necessidade de coloração específica. Este método é muito útil para analisar questões fundamentais no campo das doenças neurodegenerativas, como quais genes ou fatores ambientais causam ou contribuem para essas doenças?A principal vantagem deste método é que ele evita ou minimiza erros sistemáticos, pois moscas controle e moscas experimentais são tratadas como uma única amostra. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois é necessário prática para garantir que a região correta do cérebro esteja no lâmina e para evitar danos que possam ocorrer durante o corte. Para começar, use pinças para inserir as moscas sujeito pelo pescoço dentro dos colares.Alinhe todas as cabeças na mesma orientação e certifique-se de que nenhum dano ocorra à cabeça ou aos olhos. Inclua aleatoriamente moscas sem olhos (Eyeless Senoculus Flies) em posições conhecidas, para que a ordem das moscas possa ser facilmente identificada nas seções. Além disso, se a linhagem de moscas de interesse tiver olhos claros ou brancos, insira moscas com olhos vermelhos em intervalos ao longo da tira, para garantir que haja pigmento suficiente presente para colorir a lâmina.Registre a ordem das moscas, juntamente com o número da coleira, se for usada mais de uma. Uma vez finalizada uma coleira, coloque-a na solução de Carnoy por três vírgula cinco a quatro horas. Realize uma série de lavagens com Etanol, Benzoato de Metila e Parafina para preparar o tecido da mosca para inclusão.Em seguida, coloque as cânulas em uma bandeja de gelo de borracha, uma por seção. Despeje cuidadosamente parafina derretida sobre as cânulas, evitando bolhas de ar, e deixe endurecer durante a noite. Remova os blocos de parafina contendo as cânulas da bandeja.Se pare o bloco de parafina do colarinho, utilizando uma lâmina de barbear. Quebre suavemente o colarinho. Os corpos permanecerão no colarinho, enquanto as cabeças permanecerão no bloco de parafina.Para seccionar o tecido, aqueça primeiro uma placa aquecedora a 50 graus Celsius. Coloque todas as ferramentas que entrarão em contato com a parafina, como lâminas de barbear ou blocos metálicos de montagem, sobre a placa para aquecê-las. Determine a orientação desejada para a seção e, em seguida, fixe o segmento de parafina ao bloco de montagem derretendo-o brevemente no lado de contato.Com uma lâmina de barbear, retire o parafina em excesso ao redor das cabeças das moscas, de modo que apenas uma pequena fileira contendo as cabeças embutidas permaneça. Coloque o bloco de montagem no suporte do micrótomo, alinhando as cabeças paralelamente à borda da lâmina. Corte seções de sete micrômetros e transfira a fita de seções para lâminas de microscópio.Coloque as lâminas sobre uma placa aquecida a 37 graus Celsius por cerca de um minuto, para permitir que a fita se expanda. Remova o excesso de água e, em seguida, deixe as lâminas secarem completamente durante a noite. Após a secagem, remova a parafina colocando as lâminas verticalmente em um frasco de coloração alto, preenchido com agente de desparafinização, por 30 minutos a uma hora.Repita esta lavagem três vezes. Por fim, retire as lâminas do frasco e coloque duas gotas de meio de montagem sobre cada uma. Cubra os cortes com uma lamínula grande e deixe as lâminas secarem por um a dois dias.Sob baixa ampliação em um microscópio de fluorescência, determine a orientação do cérebro e foque na região de interesse. Após identificar essa região, capture as imagens necessárias. Utilizando um software de imagem, conte o número de vacúolos por cabeça.Meça o tamanho do vacúolo selecionando o vacúolo de interesse e determinando o número de pixels cobertos. Esta imagem mostra seções de cabeças diferentes de moscas orientadas da esquerda para a direita. De cima para baixo, seções seriadas da mesma cabeça de mosca são visualizadas.A mosca controle Eyeless Senoculus é indicada pela seta. As seções são coradas pelo pigmento fluorescente naturalmente presente nos olhos, que se espalha sobre as seções durante o corte. Seções de cabeça em parafina de moscas Swiss Cheese One com sete, 14 e 21 dias de idade mostram um aumento progressivo relacionado à idade no número e na área dos vacúolos.Essa degeneração é quantificável por meio da contagem dos vacúolos e do cálculo da área combinada, sendo considerada significativa. Da mesma forma, em moscas do tipo selvagem, demonstrou-se que a neurodegeneração ocorre com a idade. No exame de seções de cabeça de moscas do tipo selvagem com 10, 30 e 60 dias, observou-se poucos ou nenhum vacúolo formado na condição de 10 dias.No cérebro de indivíduos com 30 dias de idade, vacúolos estavam começando a se formar. Em indivíduos com 60 dias, havia significativamente mais vacúolos e de área maior. Após dominado, os cortes podem estar disponíveis para análise dentro de uma semana.Ao utilizar este procedimento, é importante registrar cuidadosamente a ordem das moscas no colar. Para garantir que você possa identificá-las posteriormente, após a análise. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar as seções e quantificar a neurodegeneração encontrada no cérebro de Drosophila.

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Research

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