Artigo de método

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em C. elegans

DOI:

10.3791/54810

⸱

14 de novembro de 2016

 , 
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Neste artigo

Resumo

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Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.

Resumo

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A triagem genética avançada em organismos modelo é o carro-chefe para descobrir genes e caminhos funcionalmente importantes em muitos processos biológicos. Na maioria das triagens baseadas em mutagênese, os pesquisadores confiaram no uso de produtos químicos tóxicos, cancerígenos ou irradiação, o que requer equipamentos designados, configuração de segurança e/ou descarte de materiais perigosos. Desenvolvemos uma abordagem simples para induzir mutações hereditárias em C. elegans usando histona-miniSOG expressa em linha germinativa, um potente gerador induzível por luz de espécies reativas de oxigênio. Este método de mutagênese é livre de produtos químicos tóxicos e requer segurança laboratorial mínima e gerenciamento de resíduos. As modificações induzidas no DNA incluem alterações de nucleotídeo único e pequenas deleções e complementam as causadas pela mutagênese química clássica. Essa metodologia também pode ser usada para induzir a integração de transgenes extracromossômicos. Aqui, fornecemos os detalhes da configuração e dos protocolos de LED para mutagênese padrão e integração de transgenes.

Introdução

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Telas genéticos forward têm sido amplamente utilizados para gerar mutantes genéticos perturbadoras vários processos biológicos em organismos modelo tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. As análises de tais mutantes levar à descoberta de genes funcionalmente importantes e suas vias de sinalização 1,2. Tradicionalmente, a mutagénese em C. elegans é conseguida usando produtos químicos mutagénicos, radiação ou transposons 2. Produtos químicos, tais como metanossulfonato de etilo (EMS) e N-etil-N -nitrosourea (ENU) são tóxicos para os seres humanos; de raios gama ou de raios ultravioleta (UV) mutagénese radiação requer equipamento especial; e estirpes transposon-activa, tais como cepas mutantes 3, pode causar mutações desnecessários durante a manutenção. Nós desenvolvemos uma abordagem simples para induzir mutações hereditárias usando um fotossensibilizador geneticamente codificado 4.

Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) podem danificar o DNA 5.O Gerador de mini-oxigênio singlete (miniSOG) é uma proteína verde fluorescente de 106 aminoácidos que foi projetado a partir do LOV (luz, oxigênio, e tensão) de domínio de Arabidopsis phototropin 2 6. Após a exposição à luz azul (~ 450 nm), miniSOG gera ROS, incluindo oxigénio singuleto com FL avin mononucleótido como um cofactor 6-8, que está presente em todas as células. Construiu-se uma proteína de fusão His-MSOG por marcação miniSOG para o terminal C da histona-72, um C. variante elegans de histona 3. Geramos um transgene de cópia única 9 para expressar His-MSOG na linha germinativa de C. elegans. Em condições normais de cultura no escuro, os vermes transgênicos His-MSOG tem o tamanho da ninhada normal e tempo de vida 4. Após a exposição à luz LED azul, os vermes His-MSOG produzir mutações hereditárias entre seus descendentes 4. O espectro de mutações induzidas inclui mudanças de nucleótidos, tais como G: C para T: A e G: C para C: G, e pequena chromosome Exclusões 4. Este processo de mutagénese é simples de executar, e requer uma configuração mínima segurança do laboratório. Aqui, descrevemos a instalação de iluminação LED e procedimentos para mutagénese optogenética.

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Protocolo

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1. Construção do Iluminador LED

NOTA: O equipamento de LED necessário é resumido na Lista de Materiais. A configuração LED inteiro é pequeno e pode ser colocado em qualquer lugar no laboratório, embora recomendamos que ser colocado em um quarto escuro para controlar a exposição à luz de vermes 4.

  1. Ligue o LED a um controlador com cabos (Figura 1A, D).
  2. Ligue o aparelho a uma função de gerador / amplificador digital com um cabo BNC (Figura 1A, C, D).
  3. Corrigir os LED de luz 10 cm acima do palco usando um suporte personalizado (Figura 1A).
    NOTA: Nós fizemos o suporte com peças de metal.
  4. Cubra a instalação de iluminação LED parcialmente, mas evitar a acumulação de calor (Figura 1B), o que torna vermes doente.
    NOTA: Nós usamos uma cobertura de plástico rígido feito por encomenda com a parte superior aberta e inferior (Figura 1A). A tampa não é necessária para a própria mutagénese, mas é usado o to limitar a exposição desnecessária da luz azul para os arredores. Aconselhamos a não cobrir a configuração LED totalmente (Figura 1B) para evitar o sobreaquecimento os vermes.
  5. Use óculos de laser de proteção.
    NOTA: usar óculos de laser de proteção porque a luz é muito brilhante. Óculos de sol pode funcionar tão bem.
  6. Mudar a alavanca do controlador de LED para 'Int.' para iluminação contínua (Figura 1D) e estabelece-lo em 65% da potência máxima (Figura 1C).
  7. Use um fotômetro para medir a intensidade da luz azul sobre a fase em que os vermes são colocados utilizando o protocolo do fabricante. A configuração dá 2,0 mW / mm 2 sob iluminação contínua.

2. Tratamento Light Blue

NOTA: Utilize a tensão CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) III 4 A estirpe está disponível. no Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. Manter a tensão His-MSOG no escuro em meio de crescimento nematóide padrão (NGM) placas com E. coli OP50 seguindo um protocolo padrão 10,11.
    NOTA: Sob luz ambiente, juSi164 estirpes molecular contendo não apresentam uma taxa de mutação acima de uma taxa espontânea 4. passagem estirpe de rotina usando um escopo de dissecação com uma lâmpada de halogéneo geralmente não causa mutações também. No entanto, os cuidados devem ser tomados para evitar a exposição desnecessária à luz, por exemplo, mantendo as tensões em uma incubadora-escuro dentro standard, ou cobrindo as tensões com papel alumínio. Aconselha-se a congelar alíquotas da estirpe após recebê-la no caso de mutações desnecessárias se acumulam ao longo do tempo.
  2. Escolha grávida jovem adulto (cerca de 12 h pós-L4) animais com um verme pegar 11.
    NOTA: Os animais mais jovens mostram efeito menos mutagênico 4, enquanto que os animais mais velhos podem ter menor tamanho da ninhada.
  3. Corte um filtro paper para atender a uma placa de 60 mm com 25 mm x 25 milímetros furo quadrado e coloque sobre uma placa unseeded (Figura 1E).
    NOTA: Um perfurador quadrado pode ser usado, mas o tamanho do punção não tem de ser preciso.
  4. Queda de 100 ul de 100 mM de CuCl 2, no papel de filtro para restringir uniformemente vermes dentro do furo quadrado sobre a placa.
  5. Escolha número desejado de grávidas hermafroditas adultos jovens (ver Passo 3, por exemplo) e transferir para o centro da placa de CuCl2.
  6. Usar a laser óculos de proteção.
  7. Ligue o LED e o gerador de função.
  8. Mudar a alavanca do controlador de LED para "Ext." para controlá-lo por o gerador de funções (Figura 1D).
  9. Definir o controlador a 65% da potência máxima e o gerador de função como onda senoidal, 4 Hz (Figura 1C).
  10. Colocar a placa de CuCl 2 do Passo 2.5, sem uma tampa sobre o palco sob o diodo emissor de luz (Figura 1A </ Strong>).
  11. Iluminar os animais com luz azul durante 30 min.
  12. Transferir vermes aparência saudável a um prato semeado como P 0.
    NOTA: O número desejado de P 0 depende do tipo de tela. Consulte a Etapa 3 para um exemplo. Os P 0 vermes pode parecer ser descoordenada imediatamente após o tratamento de luz e vai recuperar ao longo do tempo.
  13. Mantenha vermes cobertos com folha em uma incubadora ou no escuro; e siga o procedimento padrão para começar a triagem fenótipos desejados entre os seus descendentes 2,10.

3. Exemplo de uma tela genética Adiante

NOTA:. Este é um exemplo do ecrã clonal com 120 genomas haplóides para verificar se o diodo emissor de luz e a tensão estão a trabalhar Figura 2 mostra um esquema do processo.

  1. [Day1] Após o tratamento luz azul, escolher cinco vermes aparência saudável em uma placa NGM com OP50 como P 0, mantê-los em um 20 ° C incubadora, e deixá-los colocar ovos para 1d (placa 'Day1').
  2. [Day2] Transferência P 0 para uma nova placa sem sementes (placa 'Day2').
  3. [Day3] Escolha e matar P 0 na placa o 'Day2', queimando-os.
  4. [Day4] Escolha 30 gravídico jovem adulto F 1 da chapa 'Day1' e transferi-los em placas individuais (30 F 1 Bocas para 'Day1').
  5. [Dia5] Repita o passo 3.4 para a placa do "Day2 '(30 F 1 placas para' Day2 ').
  6. [Day7-9] Verifique as morfologias anormais e / ou comportamento de F 2 vermes em comparação com a estirpe WT (Figura 3A) sob um microscópio estereoscópico padrão quando se tornam adultos.
    NOTA: uma mutação hereditárias exibe cerca de um quarto dos vermes com o mesmo fenótipo entre F 2, quando é recessiva com alta penetrância. No entanto, alguns mutantes podem crescer lentamente, e / ou mostrar penetrância parcial. Portanto, é possível que menos do que um quarto dos mutantes pode ser encontrado numaprato.
  7. Escolha vermes com fenótipos visíveis individualmente e verificar a herdabilidade do fenótipo na próxima geração.

4. Exemplo de Integração Extracromossômica Transgene

  1. Injetar o DNA de interesse em CZ20310 juSi164 [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (tbb-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) e preparar vermes transgênicos com uma baixa taxa de transmissão (10-30%) na sequência de um protocolo de 12,13 injeção padrão.
    NOTA: Como alternativa, as matrizes extracromossômicos estabelecidos podem ser cruzados para as cepas juSi164. Para evitar a genotipagem em juSi164, heterozigotos juSi164 pode ser usado como a P 0, embora a eficiência pode ser diminuída. O método de genotipagem para juSi164 é descrito na Seção 5.
  2. [Dia1] Tratar ~ 20 animais transgénicos como P 0 com luz azul, como descrito no Passo 2.
    NOTA: Mais P 0 vermes são necessárias, dependendo do tr taxa de ansmission. Os transgenes podem ser identificados por co-injecção ou fenótipos marcador 12,13.
  3. Escolha 10 saudável P procura 0 em placas individuais, mantê-los em um 20 ° C incubadora, e deixá-los põem ovos por alguns dias (P 0 placas)
  4. [Day4] Único out 20 transgênico F 1 vermes de cada placa P 0 em placas individuais e deixá-los pôr ovos. (20 f 1 x 10 placas de P 0 = 200 F 1 placas no total).
  5. [Day7] Encontrar F 1 placas com> 75% F 2 com transgenes.
  6. Escolha cinco animais transgénicos a partir da taxa de transmissão de> 75% F 1 F 2 placas (placas).
  7. [Dia10] Mantenha F 2 placas com taxa de transmissão de 100% como potenciais linhas integradas.
  8. Outcross as potenciais linhas integradas, usando um procedimento padrão 10 para verificar a segregação mendeliana e remover possíveis mutações de fundo.
le "> 5. Genotipagem

  1. Lyse outcrossed 20 F 2 vermes em tampão de lise utilizando um protocolo padrão 14.
  2. Executar PCR utilizando os iniciadores para MosSCI inserção 9, juSi164, (Tabela 1) com uma temperatura de recozimento de 58 ° C, seguindo um protocolo padrão 14.
    NOTA: Não é necessário ao genótipo unc-119 (ED3), porque unc-119 (ED3) pode ser detectado pelo comportamento descoordenado após a remoção do transgene resgatando (juSi164) nas seguintes etapas 5.4 e 5.5.
  3. Execute eletroforese em gel de agarose 15 e examinar os tamanhos da banda (Tabela 1) para encontrar o WT para juSi164.
  4. Examinar se a progênie F 2 tem paralisado vermes devido à existência de unc-119 (ED3).
  5. Se vermes descoordenados são encontrados na etapa 5.4, individuais vários vermes nonuncoordinated obter todos os vermes nonuncoordinated na próxima geração.

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Resultados

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Foi realizado um rastreio genético para a frente com CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3), utilizando a exposição à luz 30 min seguindo o protocolo padrão descrito nas secções 2 e 3. Entre 60 F 1 placas correspondentes a 120 genomas haplóides mutagenizados, encontramos 8 F 1 placas com F 2 vermes que exibem fenótipos visíveis, tais como defeito tamanho do corpo (Figura 3B), o movimento descoordenado (Figura 3C), e letal...

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Discussão

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Aqui, nós descrevemos um procedimento detalhado de mutagénese utilizando optogenetic His-MSOG expresso na linha germinativa e fornecem um exemplo de um rastreio genético para a frente em pequena escala. Comparado a mutagénese química padrão, este método de mutagénese optogenetic tem várias vantagens. Em primeiro lugar, não é tóxico, mantendo assim o pessoal de laboratório longe de agentes mutagénicos químicos tóxicos, tais como EMS, ENU e trimetilpsoraleno com luz ultravioleta (TMP / UV). Em segundo lugar, o procediment...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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O trabalho é suportado pelo HHMI. Agradecemos aos membros do nosso laboratório por sua ajuda no teste do protocolo e na revisão do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fonte de luz LED de ultra alta potênciaPrizmatixUHP-mic-LED-460460 ± Controlador LED de 5 nm
PrizmatixUHPLCC-01
Gerador/amplificador de função digitalPASCOPI-9587CPI-9587C não está mais disponível. A substituição é PI-8127.
Cabo BNC macho/machoTHORLABSCA3136
Interface USB-TTLPrizmatix
FotômetroTHORLABSPM50 e Modelo D10MM
Papel de filtroWhatman1001-110
EstereomicroscópioLeicaMZ95
NGM placaDissolver 5 g de NaCl, 2,5 g de Peptona, 20 g de Ágar, 10 µ g/mL de colesterol em 1 L H2O. Após a autoclavagem, adicione 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6,0). 
Solução10 mM Tris (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 100 µ g / mL de proteinase K
opcional de lise

Referências

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