Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.
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Artigo de método
A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em
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Resumo
Resumo
A triagem genética avançada em organismos modelo é o carro-chefe para descobrir genes e caminhos funcionalmente importantes em muitos processos biológicos. Na maioria das triagens baseadas em mutagênese, os pesquisadores confiaram no uso de produtos químicos tóxicos, cancerígenos ou irradiação, o que requer equipamentos designados, configuração de segurança e/ou descarte de materiais perigosos. Desenvolvemos uma abordagem simples para induzir mutações hereditárias em C. elegans usando histona-miniSOG expressa em linha germinativa, um potente gerador induzível por luz de espécies reativas de oxigênio. Este método de mutagênese é livre de produtos químicos tóxicos e requer segurança laboratorial mínima e gerenciamento de resíduos. As modificações induzidas no DNA incluem alterações de nucleotídeo único e pequenas deleções e complementam as causadas pela mutagênese química clássica. Essa metodologia também pode ser usada para induzir a integração de transgenes extracromossômicos. Aqui, fornecemos os detalhes da configuração e dos protocolos de LED para mutagênese padrão e integração de transgenes.
Introdução
Telas genéticos forward têm sido amplamente utilizados para gerar mutantes genéticos perturbadoras vários processos biológicos em organismos modelo tais como Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. As análises de tais mutantes levar à descoberta de genes funcionalmente importantes e suas vias de sinalização 1,2. Tradicionalmente, a mutagénese em C. elegans é conseguida usando produtos químicos mutagénicos, radiação ou transposons 2. Produtos químicos, tais como metanossulfonato de etilo (EMS) e N-etil-N -nitrosourea (ENU) são tóxicos para os seres humanos; de raios gama ou de raios ultravioleta (UV) ....
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Protocolo
1. Construção do Iluminador LED
NOTA: O equipamento de LED necessário é resumido na Lista de Materiais. A configuração LED inteiro é pequeno e pode ser colocado em qualquer lugar no laboratório, embora recomendamos que ser colocado em um quarto escuro para controlar a exposição à luz de vermes 4.
- Ligue o LED a um controlador com cabos (Figura 1A, D).
- Ligue o aparelho a uma função de gerador / amplificador digital com um cabo BNC (Figura 1A, C, D).
- Corrigir os LED de luz 10 cm acima do palco usando um suporte personalizado (Figura 1A).
NOTA: Nós fizemos o suport....
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Resultados
Foi realizado um rastreio genético para a frente com CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3), utilizando a exposição à luz 30 min seguindo o protocolo padrão descrito nas secções 2 e 3. Entre 60 F 1 placas correspondentes a 120 genomas haplóides mutagenizados, encontramos 8 F 1 placas com F 2 vermes que exibem fenótipos visíveis, tais como defeito tamanho do corpo (Figura 3B), o movimento descoordenado (Figura 3C), e letal.......
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Discussão
Aqui, nós descrevemos um procedimento detalhado de mutagénese utilizando optogenetic His-MSOG expresso na linha germinativa e fornecem um exemplo de um rastreio genético para a frente em pequena escala. Comparado a mutagénese química padrão, este método de mutagénese optogenetic tem várias vantagens. Em primeiro lugar, não é tóxico, mantendo assim o pessoal de laboratório longe de agentes mutagénicos químicos tóxicos, tais como EMS, ENU e trimetilpsoraleno com luz ultravioleta (TMP / UV). Em segundo lugar, o procediment.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O trabalho é suportado pelo HHMI. Agradecemos aos membros do nosso laboratório por sua ajuda no teste do protocolo e na revisão do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fonte de luz LED de ultra alta potência | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± Controlador LED de 5 nm |
| Prizmatix | UHPLCC-01 | ||
| Gerador/amplificador de função digital | PASCO | PI-9587C | PI-9587C não está mais disponível. A substituição é PI-8127. |
| Cabo BNC macho/macho | THORLABS | CA3136 | |
| Interface USB-TTL | Prizmatix | ||
| Fotômetro | THORLABS | PM50 e Modelo D10MM | |
| Papel de filtro | Whatman | 1001-110 | |
| Estereomicroscópio | Leica | MZ95 | |
| NGM placa | Dissolver 5 g de NaCl, 2,5 g de Peptona, 20 g de Ágar, 10 µ g/mL de colesterol em 1 L H2O. Após a autoclavagem, adicione 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6,0). | ||
| Solução | 10 mM Tris (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 100 µ g / mL de proteinase K |
Referências
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P.
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Reimpressões e permissões
