Um Modelo de Cardiologia remodela Através constrição da Aorta Abdominal em Ratos

Resumo

Um modelo de rato de constrição da aorta abdominal que induz hipertrofia e remodelamento cardíaco é descrito. Um método eficiente, altamente reprodutível e minimamente invasivo é usado para fornecer uma plataforma simples, mas útil, para pesquisa em hipertrofia e disfunção miocárdica.

Resumo

A insuficiência cardíaca é uma das principais causas de morte em todo o mundo. É uma síndrome clínica complexa que inclui fadiga, dispneia, intolerância ao exercício e retenção de líquidos. Alterações na estrutura miocárdica, condução elétrica e metabolismo energético se desenvolvem com insuficiência cardíaca, levando à disfunção contrátil, aumento do risco de arritmias e morte súbita. A cardiopatia hipertensiva é um dos principais fatores contribuintes da remodelação cardíaca associada à insuficiência cardíaca. O modelo animal mais comumente usado que imita a doença cardíaca hipertensiva é criado por meio de intervenções cirúrgicas, como o estreitamento da aorta. A constrição da aorta abdominal é uma técnica experimental útil para induzir uma sobrecarga de pressão, que leva à insuficiência cardíaca. A cirurgia pode ser facilmente realizada, sem a necessidade de abertura torácica ou ventilação mecânica. A patologia cardíaca induzida por constrição da aorta abdominal progride gradualmente, tornando esse modelo relevante para a insuficiência cardíaca hipertensiva clínica. Lesão cardíaca e remodelação podem ser observadas 10 semanas após a cirurgia. O método descrito aqui fornece uma abordagem simples e eficaz para produzir um modelo animal de doença cardíaca hipertensiva adequado para estudar os mecanismos da doença e testar novas terapêuticas.

Introdução

A insuficiência cardíaca é uma síndrome complexa clínica, cujos sintomas incluem fadiga, dispneia, intolerância ao exercício, e retenção de líquidos nos tecidos periféricos. É a principal causa de morte em países desenvolvidos ^1. Além de cardiomiopatia hereditária causada por mutações em proteínas sarcômero ou canais iónicos ^2, disfunção miocárdica pode ser causada por uma variedade de condições médicas, incluindo a hipertensão, doenças de coração valvular, obesidade, diabetes e ^3. Mudanças na estrutura do miocárdio, condução elétrica, e chumbo metabolismo energético a capacidade inadequada de bombeamento cardíaco para atender às demandas do aparelho circulatório, que resulta em insuficiência cardíaca ^3,4. Investigar os mecanismos subjacentes insuficiência cardíaca, portanto, é crítico no domínio da investigação cardiovascular. Identificando os mecanismos moleculares que conduzem à progressão da insuficiência cardíaca, eventualmente, pode auxiliar na identificação de novos alvos terapêuticos ou biomarcadores úteis 1. Portanto, é importante para desenvolver modelos de insuficiência cardíaca de animais que compartilham características clínicas principais com insuficiência cardíaca em humanos ^5.

hipertrofia e remodelação cardíaca desempenha um papel crítico no desenvolvimento de insuficiência cardíaca. Doença cardíaca hipertensiva é o fator de contribuição chave da hipertrofia cardíaca ea remodelação maladaptive visto em pacientes humanos ^1. Para imitar essas condições humanas, os modelos animais são muitas vezes estabelecida através de procedimentos cirúrgicos. Em particular, a aorta abdominal transverso ou podem ser constrito para aumentar a resistência contra o ventrículo esquerdo, o que acaba por conduzir a uma sobrecarga de pressão no coração. Este fenómeno resulta geralmente em hipertrofia cardíaca, uma compensação fisiológica dos cardiomiócitos para satisfazer a exigência funcional do sistema cardiovascular. No entanto, a demanda funcional substitui os mecanismos compensatórios fisiológicas normais, levando a fibrose cardíaca e contraçãoimpairment telha. cirurgia transversal constrição aórtica (TAC) muitas vezes envolve procedimentos complicados, incluindo toracotomia, ventilação mecânica, e separação do timo e tecido adiposo do arco aórtico. Em contraste, a constrição da aorta abdominal mais simples requer técnicas experimentais ^6-8. A aorta abdominal, entre a esquerda e artérias renais direita, é contraída durante a cirurgia. Hipertrofia e remodelação cardíaca pode ser observado várias semanas após a cirurgia abdominal aórtica constrição ^6-8; eles produzem doença cardíaca hipertensa robusta semelhante à gerada pelo transversal cirurgia constrição da aorta ^9,10. Aqui, descrevemos um protocolo para conduzir a constrição da aorta abdominal em ratos utilizando um método eficiente, altamente reprodutível e minimamente invasiva. A aorta abdominal adjacente às artérias renais é limitado por um circuito de 0,72 milímetros formado por um fio de seda 4-0. Dez semanas após a cirurgia, hipertrofia cardíaca e remodeling pode ser observada. O modelo de rato de hipertrofia cardíaca induzida por constrição da aorta abdominal fornece uma plataforma para o estudo de mecanismos da doença e fisiopatologia, bem como o desenvolvimento de potenciais terapias.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH publicação no. 85-23, revista em 1996). Este protocolo foi aprovado e em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Universidade Nacional de Taiwan.

1. Cirurgia animal

1. Prepare um G agulha de seringa 22 por embotamento da ponta da agulha em uma pedra de afiar. Utilizando um alicate, plicate a agulha a um ângulo direito.
2. Antes da cirurgia, preparar os instrumentos cirúrgicos necessários e materiais, bem como uma gaiola de recuperação. Autoclave todos os instrumentos e material cirúrgico antes do uso.
3. Manter os ratos em torno de 200 g e mantê-los sob 12 h ciclo claro / escuro a uma temperatura controlada (21 ± 2 ° C), com livre acesso a comida e água. Incluir pelo menos 6 ratos em cada grupo. Anestesiar os ratos com pentobarbital(75 mg / kg em 0,5 ml, ip) ou um outro agente anestésico apropriado. Confirmar a profundidade da anestesia, testando o reflexo da cauda.
   NOTA: A ausência do reflexo da cauda é um indicador de anestesia adequada.
4. Coloque um rato na posição supina sobre uma plataforma de cirurgia com uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo. Raspar a região abdominal do rato com um cortador de pêlos e cabelos loção removedor para evitar contaminações cirúrgicos. Esfregar o abdômen limpa raspada com betadine ou outro reagente de limpeza antes da cirurgia.
   NOTA: É importante manter um campo esterilizado durante todo o procedimento.
5. Adicione de 2 cm da incisão ao longo da linha média do abdómen com um bisturi. Usando solução salina normal, manter o órgão abdominal úmida durante a cirurgia. Deslocar os órgãos digestivos cuidadosamente para o lado usando bolas de algodão para expor a veia cava inferior, que se situa na região peritoneal posterior. Identificar a aorta abdominal, que se encontra justaposta e, geralmente, sobre aesquerda da veia cava inferior.
   NOTA: A aorta abdominal é o vaso que pulsa no tempo com o ritmo cardíaco.
6. Furar o peritônio com um par de fórceps para descobrir os vasos abaixo. Gentilmente isolar a aorta abdominal ao lado das artérias renais e passar a 8 cm de comprimento por 4-0 sutura de seda por baixo da aorta abdominal entre as origens do direito e artérias renal esquerda.
7. Faça um nó duplo solto com a sutura; deixar um loop 3 mm de diâmetro e coloque a agulha 22 G embotada e dobrada dentro do loop. Apertar o nó em torno da aorta e da agulha, e em seguida, remover a agulha imediatamente para alcançar uma constrição diâmetro 0,7 mm.
8. Fechar a cavidade abdominal com 6-0 material de sutura absorvível. Suturar o músculo ou da pele incisões com suturas interrompidas simples. Para prevenir a infecção, esfregue o local da cirurgia com uma tintura de iodo.
9. Observar o animal com cuidado até que ele recupera a consciência suficiente, como indicado pela livre circulaçãoe ingestão de alimentos. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Para prevenir a dor pós-cirurgia, o tratamento de ratos com acetaminofeno (300 mg / kg em 0,5 ml, ip).
   Nota: Os usuários devem administrar analgésicos conforme aprovado por políticas institucionais.

2. Tecidos e coleta de sangue

1. No pós-operatório de 10 semanas, pesar o rato e anestesiar com pentobarbital (75 mg / kg em 0,5 ml, ip). Antes da cirurgia, confirmar a profundidade da anestesia, testando o seu reflexo cauda. Coloque o rato em uma bandeja de metal.
2. Adicione de 2 cm da incisão ao longo da linha média do pescoço utilizando um bisturi. Deslocar os músculos cuidadosamente com uma pinça para expor a traqueia. Observe cuidadosamente para identificar as artérias carótidas, as quais são paralelas à traqueia e vibram no tempo com o ritmo cardíaco.
3. Recolhe-se o sangue a partir da artéria carótida dentro de um tubo de recolha de sangue revestido com EDTA. imediatamente centrífugao sangue durante 15 minutos a 2000 xg e recolher o plasma. Armazenar o plasma do sangue a -80 ° C até ser necessário.
4. Adicione 5 cm de incisão na região torácica, em torno da linha média do processo xifóide. Perfurar o diafragma com uma pinça afiada. Utilizando um par de tesouras, cortar e remover a caixa torácica ao longo das linhas médio-clavicular de ambos os lados para expor o coração. Extirpar o coração cuidadosamente ao longo das fronteiras cardíacas e vasculares. Retire o coração suavemente sem agarrar o tecido.
5. Monte o coração em um aparelho de perfusão Langendorff modificado por amarrar o tronco da aorta para a agulha de perfusão. Perfundir o coração com tampão de Krebs (contendo NaCl 110 mM, KCl 2,6 mM, 1,2 mM _de KH ₂ PO _4, 1,2 mM _MgSO4, 25 mM de NaHCO _3, e glucose 11 mM [pH 7,4]) para lavar o sangue. Pese o coração e calcular a relação coração de peso-para-corpo-peso. Corrigir o coração com 4% de paraformaldeído, em gelo. Lembre-se de usar uma máscara, uma vez que o vapor paraformaldeído é toxic.

3. tecido fibroso Quantificação

1. Colocar o tecido cardíaco fixo-paraformaldeído em um dispositivo de corte de tecido e cortado 2 mm de espessura. Coloque as secções de tecido em uma cassete de incorporação. Desidratar o tecido através de uma série de banhos de álcool graduado (50%, 75%, 95%, e 100% durante 1 h cada).
2. Se infiltrar o tecido com xileno, durante 1 hora e finalmente em cera, durante 1 h. Coloque o tecido infiltrado numa cassete de incorporação e incorporar com cera de parafina. Armazenar os tecidos embebidos em blocos de parafina à temperatura ambiente até microtoming.
3. Corte o tecido embebido em 4 mm de espessura. Coloque as secções em banho-maria 45 ºC. Mergulhar uma lâmina de vidro para o banho de água a um ângulo e gradualmente se aproxima das bordas parafina secção parcial para permitir a ligação à corrediça.
4. Mova o controle deslizante dentro e fora do banho para remover bolsas de ar potenciais sob a secção de tecido e para facilitar uma melhor fixação. Dry tele desliza a 37 ºC durante 1 hora e armazená-los à temperatura ambiente durante coloração histológica.
5. Coloque o slide em um tanque. Desparafinar o diapositivo com xileno durante 30 minutos e re-hidratar-o em álcool diluído sequencialmente (95%, 75%, e 50% durante 3 min cada) e finalmente com água destilada. Use solução vermelho de picrosirius suficiente para cobrir completamente as secções de tecido, durante 1 h. Lavar as lâminas em uma solução de ácido acético 0,5% para duas alterações, e depois executar duas lavagens em álcool absoluto.
6. Ar seco o slide e montar o slide em resina sintética com uma lamela. Fotografar o slide em um campo de luz visível.
   NOTA: A área vermelha na fotografia mostra uma zona positiva vermelho picrosirius sob um microscópio com ampliação de 200X. Calcular a percentagem da zona positiva vermelho de picrosirius sobre a área total, o que indica a extensão de fibrose ^11.

4. Sangue troponina Quantificação

1. Quantificar os níveis de troponina plasmausando um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Ensaiar cada amostra em duplicado. Carga de 50 ul de plasma sanguíneo e de 50 ul de uma mistura de anticorpos nos poços apropriados. Selar a placa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador de placas a 400 rpm.
   NOTA: A troponina cardíaca no plasma é um marcador de lesão cardíaca.
2. Aspirar o líquido e lavar cada cavidade com 250 uL de tampão de lavagem três vezes. Após a última lavagem, inverter a placa e apagá-lo contra toalhas de papel limpo para remover o líquido em excesso.
3. Adicionar 100 ul de substrato de tetrametilbenzidina a cada poço e incubar durante 10 min no escuro, num agitador de placas a 400 rpm. Adicionar 100 ul de solução de paragem a cada poço. Agitar a placa num agitador de placas durante 1 minuto para misturar. Grave a densidade óptica (OD) a 450 nm.
   NOTA: A concentração de troponina é proporcional ao valor OD.

Resultados

10 semanas após a cirurgia a constrição da aorta abdominal, foi analisada a patologia cardíaca resultante. A histologia cardíaco foi medido através do cálculo da razão entre o peso do coração para o peso corporal e detectando a quantidade de colagénio no coração. lesão cardíaca foi confirmada pela medição da concentração plasmática troponina.

Como mostrado na Figura 1A, o tamanho cardíaco foi alargada após a c...

Discussão

A cardiopatia hipertensiva, um grande problema de saúde que contribui muito para a morbidade e mortalidade, pode levar à hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca⁵. A patogênese e a progressão da cardiopatia hipertensiva em humanos são complexas, portanto, um modelo animal apropriado é fundamental para investigar os mecanismos subjacentes e testar novas terapias que visam melhorar a estrutura e a função^cardíaca5. O modelo de constrição da aorta abdominal, que simula doenças cardíacas crônicas, é...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha de seringa de 22 G	BD Biosciences
Tubos de Coleta de Sangue EDTA	BD Biosciences
sutura de seda 4-0	Sharpoint™ Produtos	Sutura de seda DC-2515N
6-0	Sharpoint™ Produtos	DC-2150N
Pentobarbital	Sigma Aldrich
Paraformaldeído	Sigma Aldrich
Paracetamol	Sigma Aldrich	A7085
Picrosirius solução vermelha	Abcam	ab150681
Kit de troponina cardíaca	Abcam	ab200016
Imagequant	Molecular
Langendorff	ADInstruments