Artigo de método

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

DOI:

10.3791/54819

⸱

14 de dezembro de 2016

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1Physiology and Experimental Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Clinical Microbiology, Royal College of Surgeons in Ireland, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Pediatrics, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve a visualização do desenvolvimento do biofilme após a exposição a fatores do hospedeiro usando um modelo de câmara de lâminas. Este modelo permite a visualização direta do desenvolvimento do biofilme, bem como a análise dos parâmetros do biofilme usando programas de software de computador.

Resumo

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Os biofilmes consistem de grupos de bactérias embebidas em uma matriz auto-secretado. Eles desempenham um papel importante na contaminação industrial, bem como no desenvolvimento e persistência de muitas infecções relacionadas com a saúde. Um dos biofilmes mais bem descrita e estudada em doenças humanas ocorre na infecção pulmonar crónica de pacientes com fibrose cística. Ao estudar biofilmes no contexto do hospedeiro, muitos factores que podem influenciar a formação e desenvolvimento de biofilme. A fim de identificar como factores do hospedeiro pode afetar a formação de biofilme e desenvolvimento, foi utilizado um método lamela chambered estática para crescer biofilmes na presença de fatores derivados do hospedeiro na forma de sobrenadantes de escarro. As bactérias são semeadas em câmaras e expostos a filtrados de expectoração. Na sequência de 48 horas de crescimento, os biofilmes estão manchadas com um kit de viabilidade de biofilme comercial antes da microscopia confocal e análise. Após a aquisição das imagens, as propriedades do biofilme pode ser avaliada através de diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar as propriedades fundamentais do crescimento do biofilme na presença de diferentes substâncias, incluindo antibióticos.

Introdução

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biofilmes bacterianas são grupos de microrganismos que estão ligados uns aos outros e incorporados numa matriz auto-secretado. 1,2 Classicamente, eles representam bactérias fisicamente ligados a uma superfície abiótica ou biótico formado sob condições de fluxo. Os biofilmes também têm sido mostrados para crescer em condições estáticas (ausência de fluxo) e distal de superfícies, tais como na interface ar-líquido de piscinas termais ou películas formadas nos tubos de ensaio. Estes biofilmes têm sido reconhecidos no meio ambiente e são um grande prejuízo para processos industriais, como eles podem se formar em reservatórios de água ou em tubos, resultando em....

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Protocolo

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Note-se que Conselho de Ética em Pesquisa (REB) é necessário para coletar e armazenar amostras de escarro de seres humanos. Esses estudos foram aprovados pelo Hospital para Crianças Doentes REB # 1000019444.

1. preparação de amostras de expectoração CF

  1. Recolher amostra de escarro de pacientes durante as visitas de rotina à clínica fibrose cística e manter em gelo.
  2. Transporte de amostra de escarro no gelo dentro da primeira hora da coleta, para o laboratório de pesquisa, submeter-se a tratamento.

2. escarro Processing

  1. Registrar o volume da amostra de expectoração obtidos. A....

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Resultados

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A concepção geral da experiência está representada na Figura 1. A utilização deste protocolo fornece um método conveniente para visualizar as alterações em biofilmes cultivadas por diferentes períodos de tempo (por exemplo, 24, 48 ou 72 horas). Importante, sinais exógenos, tais como expectoração filtrados, pode ser adicionado para visualizar as alterações no desenvolvimento de biofilme. Como pode ser visto na Figura 2, a presença de 10% filtrado.......

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Discussão

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Os métodos aqui descritos permitem a visualização de biofilmes bacterianas cultivadas na presença de produtos exógenos. Não surpreendentemente, a produção dos exoproducts é de importância quando se utiliza este tipo de sistema. Por exemplo, ditiotreitol (DTT), é frequentemente utilizado em amostras de saliva humana para ajudar a liquefazer as amostras. No entanto, o efeito do DTT sozinho pode diminuir o desenvolvimento do biofilme e a viabilidade (dados não mostrados). Assim, controles adequados para todas as condições .......

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Agradecimentos

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TB reconhece uma bolsa de pesquisa da Fibrose Cística no Canadá.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lab-Tek II Lamínula com câmara, borosilicato #1.5, 8 poçosThermo Sicher Scientific155409
Filmtracer Kit de Viabilidade de Biofilme Vivo/MortoThermo Fisher ScientificL10316
Placas de ágar sangueThermo Fisher ScientificR10215Confirmando a viabilidade via contagens de UFC ou selecionando colônias para inoculação
COMSTATSoftware disponível onlineCOMSTAT é um software para analisar imagens de biofilme. Disponível www.comstat.dk 
Millers LB CaldoThermo Fisher Scientific12780-052Mídia padrão para crescimento noturno de gowth/biofilme
Filtros de seringa Millex-GVMilliporeSLGV013SLFiltragem de supernantes de escarro
Tamponado com fosfato Salino (Dulbecco A)OxoidBR0014GLavagem de câmaras de biofilme após remoção de mídia
Zeiss AxioVert 200MCarl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD QSTechnologies Inc.
Espectral BorealQs Technologies Inc.
Perkin Elmer VolocityQS Technologies Inc.As instruções para este software podem ser encontradas em: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf

Referências

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  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
  2. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2....

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