Desenvolvimento e Identificação de uma subpopulação Novel dos fagócitos Human Giant neutrófilos derivado In Vitro

Resumo

Descrevemos aqui um método para a obtenção e a identificação de uma subpopulação recentemente caracterizada de fagócitos gigantes derivadas de neutrófilos. Estas células desenvolver em cultura a partir de neutrófilos sangue humano fresco, e são caracterizados por fagocitose, autofagia, tamanho extremamente grande, e tempo de vida prolongado. Este método é essencial para investigar ainda mais este subpopulação derivadas de neutrófilos original.

Resumo

Os neutrófilos (PMN) são mais conhecidos por suas funções fagocíticas contra patógenos invasores e microorganismos. Eles têm a meia-vida mais curta entre leucócitos e em seu estado não activado são constitutivamente empenhada em apoptose. Quando recrutados para sítios inflamatórios para resolver a inflamação, eles produzem uma variedade de moléculas citotóxicas com morte antimicrobiana potente. No entanto, quando estas moléculas citotóxicos potentes são libertados de uma maneira descontrolada que pode danificar os tecidos circundantes. Nos últimos anos, no entanto, a versatilidade de neutrófilos é cada vez mais evidenciado, através da demonstração de funções plasticidade e imunorreguladores. Temos recentemente identificado um novo subpopulação derivadas de neutrófilos, o qual desenvolve espontaneamente em condições padrão de cultura, sem a adição de factores de citoquinas / crescimento, tais como granulócitos factor estimulador de colónias (GM-CSF) / interleucina (IL) -4. Suas capacidades fagocíticas de remanescentes de neutrófilos em grande parte, contribuir para aumentar a suatamanho imensamente; fagócitos gigantes, portanto, eles foram chamados (Gφ). Ao contrário dos neutrófilos, Gφ são muito tempo viveu em cultura. Expressam o cluster de diferenciação (CD) marcadores de neutrófilos CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / mieloperoxidase (MPO) / elastase de neutrófilos (NE), e são desprovidos da monocítica marcadores de linhagem CD14 / CD16 / CD163 e os marcadores CD1c / CD141 dendríticas . Eles também ter-se látex e zymosan e responder pelo burst oxidativo à estimulação com opsonizado-zymosan e PMA. Gφ também expressam o limpador receptores CD68 / CD36, e ao contrário de neutrófilos, internalizar baixo oxidado-lipoproteína de baixa densidade (LDL-ox). Além disso, ao contrário de neutrófilos ou monócitos frescos, em cultura, eles respondem a absorção de oxLDL aumentados por espécies reactivas de oxigénio de produção (ROS). Além disso, estes fagócitos contêm proteína associada a microtúbulos-1 de cadeia leve 3B (LC3B) vacúolos revestidos, indicando a activação da autofagia. Usando inibidores específicos é evidente que tanto a fagocitose e autofagia são prerequisites para o seu desenvolvimento e, provavelmente, NADPH oxidase ROS dependentes. Descrevemos aqui um método para a preparação deste novo subpopulação de células fagocíticas, de vida longa derivadas de neutrófilos em cultura, à sua identificação e características actualmente conhecidas. Este protocolo é essencial para a obtenção e caracterização Gφ, a fim de investigar seu significado e funções.

Introdução

Os neutrófilos polimorfonucleares (PMN) constituem a maior população de leucócitos no sangue, que serve como a primeira linha de defesa contra patogénios invasores através da produção de uma vasta gama de moléculas citotóxicas. A visão tradicional tem sido a de fagócitos profissionais que circulam no sangue, de curta duração, que são os primeiros a chegar aos locais inflamatórios agudos para combater infecções e ajuda na eliminação de agentes patogénicos e partículas nocivas. ¹ Em seu estado não activado, os neutrófilos são constitutivamente comprometido com a apoptose. Ao migrar do sangue para locais inflamatórios, os neutrófilos passam por ativação para resolver a inflamação. Eles fagocitar e matar microorganismos invasores, através da produção de uma variedade de moléculas citotóxicas como espécies reativas de oxigênio (ROS), enzimas líticas, como a elastase de neutrófilos (NE) e catepsinas com atividade microbicida potente. A fim de patógenos armadilha, os neutrófilos também liberam armadilhas extracelulares (NET) Que consistem de segmentos da cromatina nuclear contendo péptidos anti-bacterianos e várias enzimas líticas. Contudo, a libertação descontrolada destas moléculas citotóxicas a partir de neutrófilos também podem perpetuar induzir respostas inflamatórias e danos para os tecidos circundantes. ² Portanto, uma depuração eficaz de neutrófilos apoptóticos por macrófagos (MO) e as células dendríticas (DC) é crucial para resolver inflamações. ^{3, 4, 5, 6}

Nos últimos anos, no entanto, tornou-se cada vez mais evidente que os neutrófilos são altamente versáteis células, cujas funções vão muito além fagocitose e morte patógeno. ^{6, 7} por sofrer de iniciação ou de ativação, neutrófilos plasticidade está gradualmente a ganhar atenção. Por exemplo, bactérias e micobactérias desafiados neutrófilos foram mostrados parasegregar interleucina (IL) -10 e controlar a resposta inflamatória, o que sugere a presença de respostas imuno-reguladora. ⁸ neutrófilos pós-mitóticas foram mostrados para trans-diferenciar-se em células de MO-like, ou células DC-como por digestão e apresentando fragmentos de antigénio quando tratados com citocinas e factores de crescimento, ^{9, 10} Assim, servindo um papel crucial na integração inata e adaptativa respostas. ^{3, 6} Ativação por fatores de crescimento promoveu engulfment de neutrófilos apoptóticos ou restos celulares, com isso, facilitar o desembaraço de detritos em locais inflamatórios ea resolução da inflamação, ^{3, 9} particularmente quando o sistema de apuramento MO / DC é insuficiente ou sobrecarregado, ^{11, 12} sugerindo potencial "auto-regulação" para ajudar a reresolver a resposta inflamatória. Esta, uma vez que a apoptose é uma forma de morte auto-regulado que pode inibir a libertação extracelular de compostos citotóxicos e assim evitar danos em tecidos circundantes. ⁶

sobrevivência prolongada é uma outra característica da activação de neutrófilos e foi demonstrado por tratamento com vários factores do hospedeiro derivados, tais como granulócitos factor de estimulação de colónias (G-CSF), factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), citoquinas inflamatórias, tais como o interferão ( IFN) -γ, factor de necrose tumoral (TNF) -a produtos e / ou o agente patogénico derivados, assim, permitindo neutrófilos para modular a resposta de sobrevivência. ⁶ De fato, a sobrevivência de neutrófilos é um pré-requisito para a sua plasticidade e foi associada com a sua capacidade de realizar a fagocitose. ^{6, 13} Consequentemente, também foi mostrado que se associar com fenotípicas e funcionais mudanças que DepenDED na expressão génica regulada positivamente por induzir a síntese de novas proteínas envolvidas na extensão de tempo de vida de neutrófilos, e a apoptose diminuiu. ¹⁰

Ao contrário dos neutrófilos, que são de curta duração e constitutivamente sofrem apoptose em cultura, ou os neutrófilos citocinas / fatores de crescimento ativados, descritas acima, que se estenderam tempo de vida, que recentemente identificou um novo pequena subpopulação de neutrófilos, que se desenvolve espontaneamente na cultura padrão prolongado condições de neutrófilos sanguíneos humanos isolados de fresco sem a adição de citocinas externamente ou factores de crescimento. ¹⁴ fagócitos gigantes Estas células derivadas de neutrófilos, os quais não foram descritos anteriormente na literatura foram denominadas (Gφ). O Gφ estenderam vida na cultura, eles estão totalmente desenvolvidos dentro de 5-7 dias, e são caracterizados por características morfológicas únicas, expressão fenotípica e funções. Eles são vastamente ampliado devido à autophagocytosis de remanescentes de neutrófilos mortos, vacuolizadas, e contêm phagolysosomes. O Gφ expressam o marcador de grânulos de neutrófilos específico - aglomerado de diferenciação (CD) 66b, os grânulos azurófilos marcadores - CD63 e da mieloperoxidase (MPO) e marcadores de neutrófilos adicionais, tais como CD11b, NE, CD15, as subunidades da NADPH-oxidase gp91- phox e p22- phox, e o -LC3BII autofagia marcador. ^{14, 15} Funcionalmente, eles ativamente take-up esferas de látex e partículas de zymosan, e geram ROS em resposta ao zimosan e forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) estimulação. Curiosamente, ao contrário neutrófilos frescos, Gφ também intensivamente expressam os receptores de varredura CD68 e CD36, take-up oxidado lipoproteína de baixa densidade (LDL-ox), e geram ROS em resposta à estimulação com oxLDL. Além disso, Gφ são desprovidos dos marcadores de linhagem monocíticas CD14, CD16 e CD163 ou os marcadores dendríticas CD1c e CD141. Além disso, o PHAgocytosis e autofagia e provavelmente funcional oxidase NADPH são pré-requisitos para o seu desenvolvimento. Isto uma vez que, a fagocitose-inibidor cytochalsin B, os inibidores de autophagy 3-metiladenina (3-MA) ​​e bafilomicina (BafA1) e o inibidor da NADPH-oxidase - iodónio de difenileno (DPI) - impedido o seu desenvolvimento. Além disso, monócitos / neutrófilos co-culturas, bem como a exposição à hipóxia intermitente dificultado o seu desenvolvimento, ao passo que a adaptação dos neutrófilos à hipóxia sustentada era evidente. ^14,15 Seu desenvolvimento sugerida na cultura é ilustrada na Figura 1 protocolo .A no presente artigo descreve passo a passo a preparação de Gφ de recém isolado circulando neutrófilos de sangue humano, o seu desenvolvimento, identificação e algumas características básicas. Este protocolo pode ser utilizado para investigar e revelar o largo espectro e o papel destes recentemente descrita e intrigante Gφ a fim derivadas de neutrófilos para characterizum e seu significado e suas funções potenciais.

Figura 1: Representação esquemática do gigante Cells Desenvolvimento em 7 culturas Dia de neutrófilos. Sugere-se que pelo locais inflamatórios (1) neutrófilos submetidos a morte celular por apoptose, e (2) a libertação da membrana-rodeado fragmentos contendo detritos nucleares, grânulos verdes e (pontos vermelhos), e outros componentes subcelulares que desencadeiam mecanismos autophagy. (3) fagócitos gigantes (Gφ) desenvolver-se em culturas de neutrófilos a longo prazo desprovidas de citocinas ou factores de crescimento por internalização corpos apoptóticos e detritos de neutrófilos, enquanto se mantém oxidase.They NADPH funcionais são caracterizados por vários neutrofílica CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / marcadores NE, grandes phagosomes encerram grânulos e restos celulares e receptores de varredura CD36 e CD68. Gb1; são células mononucleares na sua maioria, capazes de internalizar também várias partículas e LDL oxidada e gerar ROS. As membranas dos vacúolos de enchimento Gφ conter LC3B (marcados em azul escuro), um marcador de membrana autophagosomal, sugerindo uma associação estrita entre autofagia e formação de fagócitos gigante. Gφ não se desenvolvem em meio contendo GM-CSF / IL-4. Além disso, inibidores tais como o NADPH inibidor da oxidase - iod�io difenileno (DPI), os inibidores da autofagia 3-metiladenina (3-MA) ​​e bafilomicina (BafA1) eo cytochalasin inibidor da fagocitose B (. Cyto B) abolir a sua formação. (4) funções Gφ potenciais in vivo podem incluir propriedades e participação em processos ateroscleróticos anti ou pró-inflamatórios (este valor é baseado em nossas descobertas ^{14, 15} e foi modificado a partir do acompanhamento editorial por BErton ^20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pela Comissão de Direitos Humanos da local de acordo com a declaração de Helsinki, e todos os participantes assinaram um termo de consentimento informado.

1. Isolamento e Desenvolvimento da Gφ em Cultura de neutrófilos

NOTA: Todos os passos devem ser realizados utilizando lipopolissacárido grau de tecido estéril (LPS) soluções -free em uma capela de fluxo Bio-Segurança Laminar. Não adicionar antibióticos, citocinas ou fatores de crescimento para o instituto parque memorial Roswell (RPMI) -1640 médio.

1. Obter pelo menos 40 ml de sangue venoso de adultos saudáveis ​​jovens usando um conjunto veia do couro cabeludo estéril. Extrair o sangue em tubos vacutainer contendo etilenodiamina tetra ácido acético sal K ₃ (K ₃ EDTA) e misture delicadamente. Manter o sangue à temperatura ambiente.
2. Isolar os neutrófilos por gradiente de densidade descontínua duas etapas usando polissacarose em 1.119 e 1.077 g / ml. Traga soluções para a temperatura ambiente antes de usar.
   NOTA: Durante a centrifugação, o sangue vermelhocélulas (hemácias) são agregados pelo polissacarose e sedimento rapidamente. As células mononucleares (monócitos / linfócitos) são encontrados entre o plasma superior / polissacarose -1077 interface, enquanto que os neutrófilos estejam situados imediatamente acima da GVs, no polissacarose -1077 / 1119 de interface (ver Figura 2). Este método permite a separação simultânea de células mononucleares e neutrófilos a partir do mesmo indivíduo.

Figura 2: Isolamento de Neutrófilos do Whole Sangue. Polissacarose numa 1,077 g / ml é cuidadosamente colocado em cima de polissacarose-1.119 g / ml para formar um gradiente descontínuo. O sangue total diluído é então mergulhado em cima do polissacarose-1.077. Os tubos são imediatamente submetido a centrifugação a 700 xg durante 30 min, à temperatura ambiente, sem travão. Três bandas distintas são anotados. (A) células mononucleares, (B), as células polimorfonucleares (PMN),e (C) células vermelhas do sangue (RBC) na parte inferior do tubo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Adicionar 12 ml de polissacarose-1119 para a parte inferior de um tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno cónico estéril.
2. camada cuidadosamente 12 ml de polissacarose-1077 para o polissacarose -1119.
3. Diluir 10 - 12 ml de sangue inteiro a um volume final de 24 ml de sangue com fosfato livre de iões de solução salina tamponada (PBS) contendo 2% de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (HI-FCS). camada cuidadosamente 24 ml de sangue total diluído para o gradiente superior do tubo.
4. Centrifuga-se a 700 xg durante 30 min à temperatura ambiente (20 - 24 ° C) sem travão.
   NOTA: A centrifugação a temperaturas mais baixas podem resultar em agregação celular e recuperação pobre.
5. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga without perturbar o gradiente. Duas camadas opacas deve ser observado (A: células mononucleares e B: PMN, representada na Figura 2).
6. Aspirar e descartar o líquido até 0,5 cm acima da camada A. Transferência (ou descartar) as células desta camada para um tubo marcado "mononucleares".
7. Aspirar e desprezar o restante de fluido de até 0,5 cm acima da camada B. Transferência das células a partir desta camada para um tubo rotulado "PMN".
8. PMN de associação de cada um de dois tubos de gradiente e lavar com PBS contendo 2% de HI-FCS para um volume final de 30 ml. Centrifugar durante 12 minutos a 200 xg, remover o sobrenadante e descartar.
9. Para se livrar de contaminar células vermelhas do sangue (RBC), adicionar 3 ml de hipotônica 0,2% gelada NaCl estéril enquanto ressuspensão do pellet, chamando suavemente dentro e para fora com um 1 ml ponta de pipeta estéril. Manter em gelo durante 30 segundos.
10. Após 30 s, restaurar a isotonicidade pela adição de 3 ml de solução estéril de NaCl a 1,6% frio de gelo ao tubo.
11. Para os 6 ml de solução salina isotónica, adiciona-se 6 ml de pré-aquecido (37 ° C), meio RPMI-1640 suplementado com 2% de HI-FCS e centrifugar a 250 xg durante 12 min. Descartar o sobrenadante. O pellet PMN deve estar limpa de contaminação RBC.
    NOTA: Se contaminado por RBC, o pellet PMN aparece avermelhada.
12. Se algum RBC contaminando permanecem, repita os passos 9 e 10 mais uma vez.
13. Ressuspender o sedimento de células em 4 ml de RPMI-1640 suplementado com 10% de HI-FCS e contar as células para determinar a sua concentração e a viabilidade por exclusão com azul de tripano.
14. Ajustar a concentração de 1,25-1,5 x 10 ⁶ PMN / ml (dependendo das necessidades experimentais), e a placa de 1,0 mL / poço numa placa de 24 poços.
    NOTA: A pureza dos neutrófilos na população de granulócitos excedeu sempre 95%, tal como avaliado por coloração de May-Giemsa Grunewald e microscopia de luz.
15. Após a sementeira, colocar as células de um humidificada com 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C.
16. Substitua média a cada 3 dias, aspirando delicadamente metadea forma e adicionar o mesmo volume de meio RPMI-1640 fresco suplementado com 10% de HI-FCS. Uso LPS soluções livres e os compostos e os baixos níveis de LPS em HI-FCS (0,05 ng / ml ou menos).
    NOTA: A alteração do meio gentil é imperativo uma vez que o Gφ, que se desenvolvem na cultura não firmemente anexar a placa de cultura e lavagem vigorosa também pode lavar as células em desenvolvimento. O aparecimento de Gφ é perceptível em 3 - 4 dias após a cultura de PMN, dependendo do dador de sangue. A maioria das análises e ensaios aqui descritas são realizadas entre 6 - 7 dias de cultura, quando Gφ são muito grandes em tamanho. Deve notar-se que a adição de 1 - 10 ng de LPS / ml e o meio RPMI-1640 não afectam o desenvolvimento Gφ em cultura. ¹⁴

2. Confocal Laser Scanning Microscopy

1. Prepare citospinas ¹⁶ a partir de neutrófilos isolados de fresco, e a partir das culturas de 7 dias desenvolvido Gφ(Preparado na seção 1).
   NOTA: Para aumentar a concentração de Gφ no prato de várias análises, remova cuidadosamente a metade do meio. Certifique-se de que Gφ não são detectados no meio removido por examinar a forma sob um microscópio de luz. Em seguida, intensamente pipete o meio restante para remover levemente aderiu Gφ. Centrifuga-se o meio durante 10 minutos a 200 xg, e ressuspender o sedimento em 100-120 ul de meio.
   1. Use 100 - 120 ul do meio contendo células para cada lâmina. Prepare duplicado ou triplicado slides de cada tratamento. Girar durante 7 minutos a 84 x g.
2. Secam-se as células fiadas e fixar as células com paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente durante 10 minutos, sob um capuz química. Lavar 3x com PBS (~ 100 ul durante alguns segundos por cada lavagem). Para a coloração intracelular, permeabilizar as células com 0,5% de Triton X-100 em PBS à temperatura ambiente durante 10 minutos e lavar 5x com PBS.
   NOTA: Em todas as etapas, use buffer / volu solução adequada-me para cobrir o perímetro das células sobre a lâmina. Usar uma caneta barreira hidrofóbica para a determinação de células de perímetro.
   Cuidado: O paraformaldeído é tóxico. Evitar o contato com a pele e os olhos. Usar equipamento de protecção individual adequado.
3. As células de bloco com soro de cabra normal a 10% em meio RPMI-1640 e incubar durante a noite a 4 ° C ou à temperatura ambiente durante 40 min. Lavar com PBS.
4. Incubar com anticorpo único (Ab) ou uma combinação de rato e anticorpos primários de coelho (ABS) a uma diluição de 1: 100 (~ 100 mL). Incubar durante a noite (18-20 horas) a 4 ° C.
   NOTA: Aqui, monoclonal de ratinho Abs incluíram: anti-CD14, anti-CD63, anti-CD66b e anti-CD1c, CD15 anti-, e anti-citocromo b-245 da cadeia leve (p22- identificação phox). Abs policlonal de coelho foram: anti-CD68, anti-CD36, anti-LC3B, anti-mieloperoxidase, elastase de neutrófilos anti-(NE), e anti-Nox2 / gp91- phox Abs. controles isotípicos incluídos IgG1 purificada mouse e IgG2, e IgG de coelho. prepare os Abs de acordo com as instruções do fabricante e utilizar o volume apropriado (cerca de 100 ul) para cobrir o perímetro das células.
5. Lavam-se as células e incuba-se com anticorpos secundários 1/400 Cy2-CF (488A) de caprino conjugado anti-IgG de coelho (verde) e / ou Cy5 (CF 647) de caprino conjugado anti-IgG de ratinho (vermelho) à temperatura ambiente durante 40 min.
   NOTA: Diluir e preparar Abs acordo com as instruções do fabricante.
6. Após a lavagem, montar lâminas com uma gota de meio de montagem, contendo 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para a coloração nuclear, em seguida, coloque imediatamente a tampa de deslizamento.
7. Analisar os slides por um sistema de varredura a laser confocal usando microscópio de fluorescência e objetivo óleo de imersão Plano de Apo 40X. Efectuar a análise dentro de 30 min a 2 h após a preparação das lâminas ou manter a 4 ° C durante a noite.
   1. Calcular a área da célula e a intensidade de fluorescência utilizando um software de imagem (por exemplo, Imagem a J). Para co-localização, quantify por software usando Manders Sobreposição Coeficiente (MOC) ^17.
      NOTA: Apenas as células com MOC> 0,6 podem ser consideradas como células com co-localização significativa.

3. transmigração das PMN através das células endoteliais: Efeitos de IL-8 no gigante Fagócito (Gφ) Formação

NOTA: O uso de cultura de células de 24 poços permeável insere para o ensaio de transmigração de células.

1. Revestir a câmara superior do inserto com 150 ul de fibronectina numa concentração de 50 ug / ml, e manter à temperatura ambiente durante 30 min.
2. Adicionar à câmara superior 5 x 10 ⁴ EA.hy926 células endoteliais / poço, ressuspensas em 150 ul de formulação meio de Dulbecco modificado de Eagle (meio de crescimento completo).
   NOTA: Verifique se a monocamada endotelial é confluente antes do uso.
3. Para a câmara inferior, adicionar 700 uL de meio de crescimento completo.
4. Colocar o permeávelcultura de células insere em bandejas de cultura de fragmentação e as células endoteliais EA.hy926 durante 2 dias a 37 ° C em 5% de CO _2.
   NOTA: Em paralelo, no segundo dia preparar PMN fresca (como descrito na seção 1).
5. Após 2 dias, substituir o meio nas câmaras superiores e inferiores das inserções.
   1. Para a câmara inferior, adicionar meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FCS e IH-interleucina (IL) -8, a uma concentração final de 50 nM / ml. Não adicione IL-8 para controlar câmaras inferiores.
   2. Para cada uma das câmaras superior, adicionam-se 10 ⁶ fresco PMN em 100 ul de meio RPMI-1640 suplementado com 10% FCS-IH.
6. Incubar as bandejas de fragmentação a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante 90 min.
7. Após 90 min de incubação, retire as células do superior e as câmaras inferiores separadamente e contar cada subpopulação. células expressam em cada câmara, como uma percentagem do total de células adicionadas.
   NOTA: Retire cuidadosamente as células do chamb superiorer pipetando suavemente, a fim de evitar a remoção de células endoteliais e transferir para um tubo estéril. Remover as células a partir da câmara inferior por pipetagem e lavagem da câmara inferior com 500 ul e transferir para um segundo tubo de ensaio estéril.
8. Piscina de 10 ⁶ células de vários poços de transmigração (câmara baixa) e não-migração (câmara alta) frações PMN e da cultura de cada para 7 dias sem fatores de crescimento, tal como especificado nas etapas 14-16 (seção 1).
9. Girar células em lâminas de ¹⁶ e analisar as células desenvolvidas em cada condição de cultura por meio de microscopia confocal, como descrito na seção 2.

Resultados

Neutrófilos autophagocytosis e Desenvolvimento na Cultura

Autophagocytosis neutrófilos e o seu desenvolvimento em Gφ no prazo de 7 dias em cultura é apresentada nas Figuras 3 e 4. Por dias 4 - 7, seu tamanho era muito alargada, ¹⁵ e autophagosytosis foi evidente logo aos 90 minutos, após co-cultura das neutrófilos com manchas de membrana fluorescentes (PKH-26, vermelho; PKH-67, verde). ¹⁴ Como controlo para esta subpopulação de neutrófilos, algumas culturas de neutrófilos também foram tratados com GM-CSF / IL-4. As células tratadas com citoquinas aumentou de tamanho dentro de 7 - 14 dias em cultura como anteriormente descrito. ^{18, 19} Mas, foram menores do que Gφ e tinha projecções citoplasmáticos assemelhando-DC como as células (Figura 5), como relatado anteriormente b Y Oehler et ai. ¹⁹ Além disso, a GM-CSF / IL-4 células tratadas foram negativos ou teve uma baixa expressão CD66b, ¹⁵ demonstrando claramente diferenças morfológicas e funcionais potencialmente bem.

Figura 3: autophagocytosis na fagócitos gigante Desenvolvimento (Gφ) em Cultura. neutrófilos purificados isolados de fresco foram marcadas com PKH-67 (verde) ou PKH-26 de membrana (vermelho) corantes fluorescentes no tempo zero, e, em seguida, co-cultivados e seguiu-se a sete dias. As células foram centrifugadas em lâminas de vidro, os núcleos foram corados com DAPI e as amostras foram analisadas por microscopia confocal. Autophagocytosis já é perceptível após 90 min de co-cultura. Mesclando de vermelho e verde para amarelo e laranja é claramente evidente na Gφ desenvolvimento.files / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Desenvolvimento de gigante fagócitos (Gφ) em Cultura. neutrófilos purificados isolados de fresco foram seguidos até 7 dias em cultura. As células foram centrifugadas em lâminas de vidro, nos intervalos de tempo indicados, coradas com May Grunewald-Giemsa, e analisadas com um microscópio de campo brilhante. Um indivíduo com poucos eosinófilos é apresentado para comparação. Note-se que o tamanho de eosinófilos permanece inalterada em cultura. óleo aumento de 100 vezes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Comparação entre o desenvolvimento da gigante fagócitos (G φ) e GM-CSF / IL Tratada neutrófilos em Cultura. (A) May Grunwald-Giemsa neutrófilos corados cultivadas sem (Gφ) e com GM-CSF / IL-4 durante 7 dias. As amostras foram analisadas com um microscópio de campo brilhante. Ampliação, X40. As células desenvolvidas em culturas com meio suplementado com GM-CSF / IL-4 mostram projecções citoplasmáticos difundidas mas são menores do que Gφ. (B) neutrófilos isolados de fresco foram marcadas com PKH-26 (vermelho) corante e cultivadas em meio livre de citocina durante 7 dias ou marcado com PKH-67 (verde) de corante e cultivadas em meio suplementado com GM-CSF / IL-4 para 7 dias. Em seguida, as células desenvolvidas foram misturados numa proporção de 1: 1 e de co-cultura durante 2 h. As células foram fixadas e analisadas por MICR confocaloscopy. Este valor foi modificado de referência. ¹⁵ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para investigar mais o curso do desenvolvimento Gφ, suas alterações morfológicas também foram acompanhadas por microscopia de lapso de tempo. Video-1 (dia 3 ao dia 4) e vídeo-2 (dia 4 a dia 5) demonstrar o seu desenvolvimento em culturas de neutrófilos purificados. Estes Gφ são não-aderentes ou ligeiramente aderente com capacidade movimento limitado e ingerem activamente torno restos de neutrófilos e detritos. Em vídeo-3, o movimento de monócitos MO-derivado e Gφ é comparado em uma cultura de monócitos / neutrófilos misto. O MO rastreia activamente (esquerda, células sem rótulo). O Gφ (à direita), é brilhante celular rotulados PKH-26.

Video-1: Demonstra o Desenvolvimento da gigante fagócitos em culturas puras PMN nos dias 3 - 4 por microscopia de lapso de tempo. Os neutrófilos foram acompanhados na cultura a partir do dia 3 ao dia 4 por lapso de tempo microscopy.The sistema de microscopia de lapso de tempo é composto por microscópio invertido fluorescente motorizado, e uma câmera CCD B / W de alta resolução, com uma incubadora no palco. Imagem aquisição captura de lapso de tempo foi feita a cada 10 min. Originalmente publicado em ¹⁴ de referência Por favor clique aqui para ver este vídeo.

Video-2: Demonstra o Desenvolvimento da gigante fagócitos em Purificada PMN Cultura nos Dias 4-5 por Time-lapse Microscopia. Os neutrófilos foram acompanhados na cultura a partir do dia 4 ao dia 5 por microscopia de lapso de tempo. O sistema de microscopia de lapso de tempo é composto por microscópio invertido fluorescente motorizado, e uma câmera CCD B / W de alta resolução, com uma incubadora no palco. Imagem aquisição captura de lapso de tempo foi feita a cada 10 min. Por favor clique aqui para ver este vídeo.

Video-3: Uma Fagócito gigante e um macrófago Desenvolvido em co-cultura. Monócitos / neutrófilos co-cultura foi seguido-se a partir do dia 4 ao dia 5 por microscopia de lapso de tempo. macrófagos derivados de monócitos (esquerda); brilhante (-26 PKH manchado celular) fagócitos gigante derivadas de neutrófilos (direita). O sistema de microscopia de lapso de tempo para o vídeo é composto por invertida micr fluorescente motorizadooscope, e uma câmera CCD B / W de alta resolução, com uma incubadora no palco. Imagem aquisição captura de lapso de tempo foi feita a cada 10 min. Originalmente publicado em ¹⁴ de referência Por favor clique aqui para ver este vídeo.

Expressão de marcadores em fagócitos gigantes

A origem de Gφ neutrofílica foi verificada por expressão positiva dos seguintes marcadores de neutrófilos CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (Figura 6). O Gφ também expresso da NADPH-oxidase, os receptores scavenger oxLDL - CD68 e CD36, e continham vacúolos LC3B-revestidos e agregados (identificados por transferência de Western como LC3BII ^15), demonstrando a presença de um marcador autofagia. No entanto, eles foram negativos para a linhagem monocítica (CD14, CD16 e CD163) e Dendritcélulas ic (cd1c e CD141) marcadores, sugerindo que Gφ não surgiu a partir de monócitos contaminantes.

Figura 6: Expressão dos vários marcadores para os neutrófilos, monócitos e células dendríticas nos fagócitos gigante (Gφ) após 7 dias em cultura. A expressão positiva da neutrófilos específica marcador granulado CD66b, o azurófilos grânulos marcadores CD63 e MPO, elastase de neutrófilos e CD15. expressão negativa para os marcadores cd1c e CD141 dendríticas e marcadores de linhagem monocíticas CD14, CD16 e CD163. Além disso, Gφ expressa o marcador LC3B autofagia, os receptores de varredura CD68 e CD36 e as subunidades da NADPH oxidase subunidades gp91-phox / p22-phox. Os núcleos foram coradas com DAPI, e as amostras foram analisadas por microscopia confocal. Esta figura foi modificado a partir de referências. ¹⁴ p>, ¹⁵ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Funções de Gφ - NADPH oxidase Activation, ROS Produção e fagocitose:

A fagocitose das esferas de látex e zimosano opsonizado foi evidente em Gφ. Gφ também gerado basal ROS (Figura 7A), e reagiu com zimosano e estimulação com PMA por burst oxidativo (Figura 7B-D). No entanto, ao contrário dos monócitos ou neutrófilos, Gφ gerado ROS também em resposta à estimulação de oxLDL e foram coradas com Oil Red O (Figura 7B, F). De nota, o tratamento de neutrófilos frescas com o inibidor da NADPH oxidase - DPI, não só inibiu a produção de ROS, mas também prevented formação Gφ na cultura, sugerindo que a sinalização de ROS é essencial para a formação Gφ. ^{14, 15}

Figura 7: burst oxidativo, fagocitose e oxLDL absorção por parte do gigante fagócitos (Gφ). Produção (A) Basal ROS é evidente nos lisossomos de Gφ. (B) a produção de ROS em resposta à LDL oxidada (oxLDL), PMA e zymosan (partículas de zimosan são claramente indicado). (C) Nitroblue tetrazólio (NBT) de teste em Gφ mostrando atividade oxidativa sem e com PMA (slides são imaculada, mas as inserções são corados com May Grunwald-Giemsa). (D) teste de NBT e maio Grunewald-Giemsa manchado Gφ com PMA e PMA / DPI que inibiu oxidase NADPH e ROS. (E) A fagocitose de LATEX e zymosan IgG-opsonizado em PKH-26 (vermelho) células coradas. (F) Oil Red O coloração em oxLDL não tratada e tratada Gφ. Esta figura foi modificado a partir de referências. ^{14, 15} Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Transmigração das PMN através das células endoteliais

De modo a identificar potenciais neutrófilos sub-populações que pode evoluir para Gφ, a migração de neutrófilos através de monocamadas de células endoteliais foi determinada (Figura 8A). Depois de 90 minutos, 62,3 ± 12,2% dos neutrófilos transmigrou através de células endoteliais no sentido de IL-8 no compartimento inferior. De nota, Gφ positivas para CD66b / CD15 / LC3B desenvolvido apenas a partir da população transmigrou de neutrófilos, enquanto que as células que se desenvolveram a partir da fracção neutrófilos não-migração foram menores em tamanho e negativo para os marcadores de neutrófilos CD66b / CD15 (Figura 8B, 8C) .

Figura 8: Efeitos de IL-8 dependente de PMN transmigração através de células endoteliais sobre gigante Fagocitário (Gφ) Formação. (A) Um esquema ilustrando ensaio de transmigração de neutrófilos através monocamadas de células endoteliais (CEs) em direcção a IL-8. Este ensaio pode ser considerado como um modelo para o recrutamento de neutrófilos a locais de inflamação aguda. (B - C) No ensaio de migração celular (especificada no protocolo 3), transmigrando (B) e não-migração (C) neutrófilos fracções foram cultivados por sete dias sem fatores de crescimento (como no protocolo 1). Em seguida, as células foram centrifugadas em lâminas de vidro e analisadas por microscopia confocal. As células fixadas foram coradas para CD66b (vermelho), LC3B (verde) e CD15 (vermelho). Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

fagócitos gigantes (Gφ) são uma subpopulação recém-definido de células derivadas de neutrófilos expressam marcadores de neutrófilos fundamentais e específicos, tais como CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Este tipo de fagócitos derivadas de neutrófilos não foi descrito anteriormente na literatura. Ao contrário dos neutrófilos, que são de curta duração e se submetem a apoptose, Gφ são-anexina-V negativo e exibir vida útil prolongada. No entanto, como neutrófilos, Gφ também internalizar partículas e produzir ROS NADPH oxidase-dependente em resposta a essas partículas e PMA. No entanto, suas habilidades para internalizar LDL-ox e, consequentemente, para a produção de ROS são características únicas de Gφ. ¹⁴

Um número de factores foram mostrados para influenciar o seu desenvolvimento em cultura. A falta de citocinas ou factores de crescimento externos no meio de crescimento é essencial (especificamente GM-CSF / IL-4). No entanto, os neutrófilos migração para IL-8 mostrou um factor de discriminação entre os que devfugiu em Gφ e aqueles que não o fez. Além disso, a internalização de detritos resultantes de neutrófilos apoptóticas, a expressão de proteínas autophagy (LC3B) e da NADPH-oxidase funcional, foram todos mostrados para ser imperativo para o seu desenvolvimento, uma vez que a sua inibição impediu a formação Gφ (Figura 1). Aparentemente, o desenvolvimento destas células gigantes que derivam de neutrófilos difere da que caracteriza a formação de células gigantes no monócito / macrófago linhagem. Estas últimas células gigantes formulário multi-nucleada associadas a diversas doenças inflamatórias crônicas, ^{20, 21} ao passo que o Gφ neutrofílica descrita aqui se desenvolvem através autophagocytosis, por engolindo restos celulares e permanecem em sua maioria mono-nucleada em todo o seu desenvolvimento, ¹⁴ (raramente no entanto, por vezes, uma segunda núcleo pode ser observado). Além disso, um certo número de controlos estabelecida a sua origem neutrofílica: (1) expreSsion dos marcadores neutropilic específicos e ausência de marcadores dendríticas e de linhagem monocítica, (2) o seu desenvolvimento prejudicado em monócitos / PMN co-culturas, (3) seus diferentes padrões de movimento na cultura de macrófagos (como evidenciado por imagens de células vivas e hora microscopia -lapse), ¹⁴ (4) a sua adesão à luz e pratos de plástico (5) o seu desenvolvimento a partir puro CD15 ⁺ / CD14 ^- PMN adquiridos por citometria de fluxo.

Algumas das funções identificadas in-vitro pode nos dar pistas quanto às suas funções potenciais in vivo. Por exemplo, as habilidades de Gφ a consumir grandes quantidades de grânulos de neutrófilos e detritos, a presença de grandes vacúolos, eo LC3B expressão - uma proteína autofagia o que contribui para diminuir a inflamação através de interações reguladoras com vias de sinalização imune inata, ²² - todos os quais habilidades de suporte de limpeza. Como tal, Estes resultados também indicam que Gφ pode estar funcionando em locais inflamatórios onde o sistema MO / DC é insuficiente ou oprimido, e, assim, contribuir para a resolução da inflamação. Esta noção pode ser apoiada pelo fato de que, em culturas de monócitos / neutrófilos mistos desenvolvimento Gφ é dificultada. ¹⁴ Além disso, dado que Gφ expressam receptores de LDL-ox limpador (CD36, CD68), internalizar oxLDL e produzir ROS em resposta a isso, pode indicar que eles estão envolvidos em processos ateroscleróticos para resolver a inflamação. Desde Gφ desenvolvido apenas a partir de neutrófilos que migraram em direção IL-8, e transmigração 'neutrófilos através monocamadas endoteliais no sentido de IL-8 representa o recrutamento de neutrófilos para locais inflamatórios agudos, este achado pode também apoiar funções anti-inflamatórias. Por outro lado, o desempenho de Gφ em certas condições inflamatórias pode permitir que estes desempenhem as componentes granulares e de ROS, assim, contribuir para persistente inflamação e danos nos tecidos. ²⁰ No entanto, em geral, as suas capacidades autofágicos indicam que Gφ provavelmente estão envolvidos na diminuição da resposta inflamatória ao invés de perpetuá-la.

É interessante notar que foram identificadas recentemente a presença de Gφ em placas ateroscleróticas humanas. (em preparação). No entanto, um grande número de questões a serem desvendados. Por exemplo, são Gφ pro- ou anti-inflamatória? Quais são os fatores que determinam sua formação e função in vitro ou in vivo? Qual específica de neutrófilos subpopulação é a sua célula precursora que facilita seu desenvolvimento em Gφ? Eles estão associados a certas patologias e qual? Colectivamente, colocando questões interessantes quanto à sua origem e funções potenciais.

No entanto passos críticos e armadilhas dentro do protocolo deve ser mantido em mente. Um passo crítico no desenvolvimento de Gφ is os neutrófilos cultura pura em meio desprovido de citocinas, factores de crescimento ou antibióticos. Outro passo fundamental é de excluir que Gφ desenvolver a partir de monócitos contaminantes e verificar a origem neutrofílica de Gφ. Assim, após a separação do sangue por gradiente descontínuo, os neutrófilos foram ainda submetidas a um passo adicional de purificação por citometria de fluxo utilizando gating granulócitos e ^células CD15 ⁺ / CD14 ^- marcadores. O Gφ desenvolvido obtida a partir de neutrófilos que foram ainda purificados por citometria de fluxo separação não diferem das que não foram submetidas a este passo de purificação. Portanto, a maior parte das experiências foram realizadas sem a citometria de fluxo passo de purificação devido à perda de células adicionais. É de notar, em alguns casos raros alguns eosinófilos foram observadas em cultura. Seu tamanho permaneceu inalterada durante todo o período de cultura. Devemos também observar que, embora haja uma série de métodospara a separação de neutrófilos do sangue humano, o método descrito aqui é o único método foi empregado e, portanto, não podemos comparar o desenvolvimento Gφ por outros métodos disponíveis para a separação dos neutrófilos.

Um grande armadilha na investigação Gφ resulta da incapacidade de obter um número suficiente de população Gφ puro apropriado para vários ensaios bioquímicos. É basicamente possível nas condições nossas experiências foram conduzidas. Em primeiro lugar, o rendimento do Gφ é baixo. A partir de 1,0 x 10 ⁶ semeadas sobre PMN 100-200 Gφ desenvolver depois de sete dias em cultura, dependendo do dador de sangue. Em segundo lugar, é basicamente difícil no momento para separar o Gφ desenvolvida em cultura a partir dos detritos de neutrófilos remanescente no prato. Estas limitações tornaram praticamente impossível de analisar as células através de métodos de biologia molecular ou bioquímica. Portanto, este protocolo está focado em descrever a identificação e função Gφ usando luze microscopia confocal. Sua transformação morfológica de neutrófilos para Gφ na cultura também foi seguida por imagens de células vivas e microscopia de lapso de tempo. ¹⁴ Aparentemente, os volumes de sangue muito maiores podem ser necessárias para implementar os métodos de biologia molecular ou bioquímica e superar o baixo rendimento obtido e separa o Gφ viável de detritos 'neutrófilos no prato.

Em resumo, recentemente descrito para a primeira vez que o desenvolvimento de Gφ em cultura, uma subpopulação de fagócitos durabilidade de origem neutrofílica. Por conseguinte, este é o único método disponível para se obter Gφ em cultura, embora as duas maiores limitações acima mencionadas deve ser ultrapassada (o baixo rendimento do Gφ obtido na cultura e a incapacidade para separar o Gφ desenvolvido a partir dos detritos de neutrófilos na cultura prato). Ainda assim, a sua preparação e identificação, apresentada neste protocolo, é essential para os cientistas interessados ​​em respostas inflamatórias e biologia de neutrófilos e plasticidade, a fim de investigar mais profundamente o significado potencial e funções de Gφ.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Conjunto de veias do couro cabeludo estéril (21GX3/4)	Bio Diagnósticos Ltda.	# 20080312	Uma agulha de estria para venipancture
VACUETTE HOLDEX Suporte de uso único PP	Greiner Bio-One	# 450263	Para fixação durante a punção venosa
Tubo VACUETTE K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL)	Greiner Bio-One	# 455036	Tubo estéril para coleta de sangue
Nunclon MultiDish (24 poços x 1 ml)	Thermo Scientific	# 142475
Tubo de centrífuga cônico de polipropileno (50 ml)	Greiner Bio-One	# E14103PJ
Poço Transwell-24 (ensaio de transmigração)	Corning	# CA-3415	Membrana de policarbonato, 6,5 mm de diâmetro, 3 μ m poros)
RPMI-1640 medium	BioIndustries	# 01-100-1A	Não adicione antibióticos
EA.hy926 (CRL2922 ATCC)	BioIndustries	# CRL-2922
Dulbecco formulado por ATCC' s  Águia Modificada' s Medium	BioIndustries	# 302002	meio de crescimento completo
Polissacarose - Histopaque1119	Sigma-Aldrich	# 1119-1 Grau de cultura de	tecidos
Polissacarose - Histopaque1077	Sigma-Aldrich	# 1077-1 Grau de	cultura de tecidos
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) - livre de íons	BioIndustries	# 02-023-1A	Grau de biologia celular e biologia molecular
Soro de bezerro fetal inativado por calor (HI-FCS)	BioIndustries	# 04-121-1B	Grau de biologia celular ou grau de cultura de tecidos, baixo LPS
NaCl	Sigma	# S3014	Grau de biologia molecular, adequado para cultura de células
Paraformaldeído, 16%	Microscopia eletrônica Ciências	# 15710	Grau de bologia celular ou grau de cultura de tecidos (apenas 16% PFA)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	# 9002-93-1 Grau de	biologia molecular
Soro de Cabra Normal	BioIndustries	# 04-009-1	Grau de biologia celular e biologia molecular
Azul de tripano	BioIndustries	# 031021B	Grau de cultura de tecidos
Maio-Grü nwald	Sigma-Aldrich	# MG500	Grau de biologia celular-(procedimento nº GS-10)
Kit de coloração Giemsa	Sigma	# 48900	Grau de biologia celular-(procedimento nº GS-10)
Fibronectina	BioIndustries	# 03090105
Interleucina-8 humana (CXCL8)	PeproTech	# 200-08-5
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-58951	IgG2b de camundongo; expresso por  monócitos
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-5275	IgG1 de camundongo; expresso por neutrófilos
Anti-CD66b (clone 80H3)	AbD Serotec	# MCA216	IgG1 de camundongo; expresso por neutrófilos
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7)	MACS Miltenyi Biotec	# 130-090-695	IgG2a de camundongo; expresso por  células dendríticas
Anti-CD15 (clone MY-1)	Abcam	# ab754	IgM de camundongo; expresso por neutrófilos
Anti-Citocromo b-245 Cadeia leve (p22-phox) (clone 44.1)	BioLegend	# 650001	IgG2a de camundongo; para reconhecer o complexo NADPH oxidase de neutrófilos
Anti-CD68	Protein Tech	# 16192-1-AP	Rabbit IgG; para reconhecer o receptor eliminador de oxLDL
Anti-LC3B	Sigma	# L7543	Rabbit IgG
Anti-Mieloperoxidase	Abcam	# ab45977	IgG de Coelho
Anti-Elastase de Neutrófilos	Calbiochem	# 481001	IgG de Coelho
Anti-NOX2 (gp91-phox)	Abcam	# ab131083	IgG de Coelho
Anti-CD36 (SR-B3)	Novus Biologicals	# NB400-144
IgG de Coelho Purificado de Camundongo IgG1, κ Controle de Isotipo (clone MG1-45)	BioLegend	# 401401	Anticorpo usado como controle de isotipo
Camundongo Purificado IgG2a, κ Controle de isotipo (clone MOPC-173)	BioLegend	# 400263	Anticorpo usado como controle de isotipo
IgG normal de coelho	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-2027	Anticorpo usado como controle de isotipo
CF488A IgG anti-coelho de cabra (H+L)	Biotium	# 20012	IgG Anti-Coelho com o corante verde fluorescente CF488A
CF647 IgG Anti-Coelho de Cabra (H+L)	Biotium	# 20043	IgG Anti-Coelho com o corante fluorescente vermelho CF647
CF488A IgG Anti-Rato de Cabra (H+L)	Biotium	# 20010	Anti-Mouse IgG com o corante verde fluorescente CF488A
CF647 Cabra Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20040	Anti-Mouse IgG com o corante fluorescente vermelho CF647
Meio de montagem fluorescente com DAPI	Vectashield H-1000; Laboratório de vetores Inc.	# E19-18
Microscópio confocal de varredura a laser para coloração nuclear (LSM 700)	Carl Zeiss	Ser.# 3523000380	Plan Apo 40X objetivo de óleo de imersão
Software Zeiss CLSM (ZEN 2010)	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	versão 6.0	Para análise de colocalização
Software ImageJ	Wayne Rasband, NIH, EUA	versão 1.49k	Para determinação de áreas celulares e intensidade de fluorescência
Microscópio óptico (Axiovert 25)	Carl Zeiss	Ser.# 201060153	Exame de células em cultura
Centrífuga (Megafuge 1.0 R)	Heraeus Instruments	# D-37520	Separação de células do sangue; preparação de citospins
Microscópio fluorescente invertido (Zeiss Axio Observer Z.1)	Carl Zeiss	Ser.# 3834001470	Demonstração do desenvolvimento de fagócitos gigantes
Sistema de incubação com temperatura controlada (Cube& Caixa)	Life Imaging Services		Sistema de controle de temperatura para microscópios
Alta  câmera digital CCD de resolução (AxioCam HRm)	Carl Zeiss	Ser.# 117090279	Para capturar dados de imagem de alto contraste  de objetos de uma célula examinada
Caneta de barreira hidrofóbica (Caneta Elite PAP)	Diagnostic Biosystems	# K039	Para definir o perímetro celular para coloração de imunofluorescência