As infecções por biofilme mostram alta tolerância à quimioterapia. Nenhum ensaio captura a complexidade dos biofilmes. Em vez disso, são necessários ensaios complementares. Apresentamos uma plataforma de triagem (desenvolvida para S. aureus) que combina ensaios de viabilidade, biomassa e matriz de biofilme. Permite a descoberta de medicamentos anti-biofilme, incluindo a avaliação dos efeitos quimioterápicos a longo prazo.
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Artigo de método
A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os biofilmes são considerados como um dos temas mais desafiadores da biomedicina moderna, e eles são potencialmente responsáveis por mais de 80% das infecções antibióticos tolerante. Os biofilmes tem exibido uma tolerância excepcionalmente elevada de quimioterapia, que se pensa ser multifactorial. Por exemplo, a matriz proporciona uma barreira física que reduz a penetração de antibióticos para o biofilme. Além disso, as células dentro dos biofilmes são fenotipicamente diversificada. Provavelmente, o biofilme resiliência surge a partir de uma combinação destes e de outros, ainda desconhecidos, mecanismos. Todos os antibióticos actualmente existentes têm sido desenvolvidos contra-células individuais (bactérias planctónicas). Portanto, até agora, um repertório limitado de moléculas que existe pode actuar selectivamente em biofilmes maduros. Esta situação tem impulsionado uma mudança de paradigma progressivo na descoberta de medicamentos, em que a procura para os anti-biofilme tem sido instado a ocupar um lugar mais proeminente. Um desafio adicional é que há umnúmero de métodos padronizados para a investigação de biofilme, especialmente aqueles que podem ser utilizados para o rastreio de grande rendimento de bibliotecas químicas muito limitado. Aqui, uma plataforma de anti-biofilme experimental para filtragem de produtos químicos é apresentada. Coloração Ela usa três ensaios para medir a viabilidade do biofilme (coloração com resazurina), biomassa total (com coloração de violeta de cristal) e matriz do biofilme (usando uma aglutinina de gérmen de trigo, com sede em WGA-fluorescência do poli-N-acetil-glucosamina, PNAG , fração). Todos os ensaios foram desenvolvidos utilizando Staphylococcus aureus como as bactérias modelo. Exemplos de como a plataforma pode ser utilizada para rastreio primário, bem como para a caracterização funcional de acessos identificados anti-biofilme são apresentados. Esta sequência experimental permite ainda a classificação dos hits com base nos pontos finais medidos. Ele também fornece informações sobre o seu modo de acção, especialmente no longo prazo contra os efeitos quimioterápicos de curto prazo. Assim, é muito advantageous para a rápida identificação de compostos de vida de alta qualidade que podem servir como pontos de partida para várias aplicações biomédicas.
Introdução
As bactérias podem alternar entre dois estilos de vida muito diferentes, planctônicas e sessile, dos quais um biofilme é o exemplo mais comum. Em biofilmes, as bactérias formarem comunidades estruturadas embebidas numa matriz auto-produzido um. Esta matriz auto-produzido é uma barreira entre as bactérias e seu ambiente externo, e que protege as células microbianas, mantê-los na proximidade. A composição da matriz do biofilme varia entre e dentro das espécies, mas a maioria é constituída de uma forte rede de lipopolissacarídeos, ADN extracelular e proteínas. A matriz serve como uma barreira física inibir a entrada de agentes nocivos, mas também protege o bi....
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Protocolo
1. o crescimento da bactéria
- Pré-cultura das bactérias durante a noite num caldo de soja tríptica (TSB) a 37 ° C com 220 rpm de agitação (16-18 h).
- Dilui-se a pré-cultura 100-1000 vezes (dependendo da taxa de crescimento das bactérias, aqui, 1.000 vezes é utilizado para S. aureus) em TSB fresco e deixar crescer a 37 ° C e 200 rpm para alcançar um crescimento exponencial (óptico densidade a 595 nm (OD 595) entre 0,2 e 0,6).
NOTA: Este passo requer otimização específicas de tensão.
2. formação de biofilme: pré e pós-exposição
- Diluir os crescido exponencialmente cultura 100 vez....
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Resultados
Na plataforma proposta, os efeitos sobre a viabilidade, a biomassa, e a matriz do biofilme são quantificadas. Na sequência de trabalho (Figura 1), uma placa de amostra sejam marcadas com resazurina e subsequentemente com violeta de cristal para avaliar simultaneamente os efeitos sobre a viabilidade do biofilme bacteriano e na biomassa total do biofilme. Ambos os ensaios podem ser realizados consecutivamente na mesma placa, porque foi demonstrado anteriormente que uma pri.......
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Discussão
Não há nenhum método único que pode medir simultaneamente o efeito de um composto sobre a viabilidade, a biomassa, e a matriz do biofilme. Por conseguinte, existe uma necessidade para a combinação de ensaios, a fim de detectar um efeito sobre os três pontos de extremidade, de preferência a uma etapa de rastreio primário.
Resazurina é um protocolo de coloração muito simples, consistindo apenas da adição da sonda redox. No entanto, o estabelecimento do tempo de incubação óptimo dos biofilmes c.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem o professor Paul Cos e LMPH, Universidade de Antuérpia, Bélgica por seu apoio durante o processo de filmagem em seu laboratório. Este trabalho foi financiado pela Academia de projectos Finlândia (projectos 272266 e 282981) e Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlândia. As contribuições técnicas de MSc Janni Kujala são reconhecidas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Cristal violeta | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Aglutinina de Gérmen de Trigo, Conjugado Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| VIVO/MORTO BacLight | Sondas moleculares | L7012 | SYTO 9 para coloração de células viáveis verdes e iodeto de propídio para coloração de células mortas vermelhas |
| Fosfato Tampolado Ácido | |||
| Triptona de soja | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Caldo de soja triptina | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Placa de poço Poliestireno Estéril Transparente Fundo plano | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| Tampas de marca, tiras de 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Banho ultrassônico da série Branson CPX | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipeta | Thermo Fisher Scientific | ||
| Dispensador Multidrop | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Leitor Multiplaca Varioskan Flash | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | Rolamento 25923 |
Referências
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics.....
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Reimpressões e permissões
