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Artigo de método

A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

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DOI:

10.3791/54829

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27 de dezembro de 2016

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

Neste artigo

Resumo

As infecções por biofilme mostram alta tolerância à quimioterapia. Nenhum ensaio captura a complexidade dos biofilmes. Em vez disso, são necessários ensaios complementares. Apresentamos uma plataforma de triagem (desenvolvida para S. aureus) que combina ensaios de viabilidade, biomassa e matriz de biofilme. Permite a descoberta de medicamentos anti-biofilme, incluindo a avaliação dos efeitos quimioterápicos a longo prazo.

Resumo

Os biofilmes são considerados como um dos temas mais desafiadores da biomedicina moderna, e eles são potencialmente responsáveis ​​por mais de 80% das infecções antibióticos tolerante. Os biofilmes tem exibido uma tolerância excepcionalmente elevada de quimioterapia, que se pensa ser multifactorial. Por exemplo, a matriz proporciona uma barreira física que reduz a penetração de antibióticos para o biofilme. Além disso, as células dentro dos biofilmes são fenotipicamente diversificada. Provavelmente, o biofilme resiliência surge a partir de uma combinação destes e de outros, ainda desconhecidos, mecanismos. Todos os antibióticos actualmente existentes têm sido desenvolvidos contra-células individuais (bactérias planctónicas). Portanto, até agora, um repertório limitado de moléculas que existe pode actuar selectivamente em biofilmes maduros. Esta situação tem impulsionado uma mudança de paradigma progressivo na descoberta de medicamentos, em que a procura para os anti-biofilme tem sido instado a ocupar um lugar mais proeminente. Um desafio adicional é que há umnúmero de métodos padronizados para a investigação de biofilme, especialmente aqueles que podem ser utilizados para o rastreio de grande rendimento de bibliotecas químicas muito limitado. Aqui, uma plataforma de anti-biofilme experimental para filtragem de produtos químicos é apresentada. Coloração Ela usa três ensaios para medir a viabilidade do biofilme (coloração com resazurina), biomassa total (com coloração de violeta de cristal) e matriz do biofilme (usando uma aglutinina de gérmen de trigo, com sede em WGA-fluorescência do poli-N-acetil-glucosamina, PNAG , fração). Todos os ensaios foram desenvolvidos utilizando Staphylococcus aureus como as bactérias modelo. Exemplos de como a plataforma pode ser utilizada para rastreio primário, bem como para a caracterização funcional de acessos identificados anti-biofilme são apresentados. Esta sequência experimental permite ainda a classificação dos hits com base nos pontos finais medidos. Ele também fornece informações sobre o seu modo de acção, especialmente no longo prazo contra os efeitos quimioterápicos de curto prazo. Assim, é muito advantageous para a rápida identificação de compostos de vida de alta qualidade que podem servir como pontos de partida para várias aplicações biomédicas.

Introdução

As bactérias podem alternar entre dois estilos de vida muito diferentes, planctônicas e sessile, dos quais um biofilme é o exemplo mais comum. Em biofilmes, as bactérias formarem comunidades estruturadas embebidas numa matriz auto-produzido um. Esta matriz auto-produzido é uma barreira entre as bactérias e seu ambiente externo, e que protege as células microbianas, mantê-los na proximidade. A composição da matriz do biofilme varia entre e dentro das espécies, mas a maioria é constituída de uma forte rede de lipopolissacarídeos, ADN extracelular e proteínas. A matriz serve como uma barreira física inibir a entrada de agentes nocivos, mas também protege o biofilme de desidratação e impede que os nutrientes se escape da célula 2.

Os biofilmes são considerados como um dos temas mais desafiadores da biomedicina moderna, e eles são supostamente responsáveis por mais de 80% das infecções antibióticos tolerante 3. eles dispestabelecer uma tolerância inerentemente alta contra ameaças externas: umidade, pressão osmótica, estresse mecânico 4, calor, radiação UV 5, desinfectantes, agentes antimicrobianos e o sistema imune do hospedeiro 1. Por exemplo, a concentração de agente antimicrobiano necessária requerida para matar um biofilme tem sido mostrado para ser de até 1000 vezes mais elevada em comparação com a necessária para matar bactérias planctónicas. A explicação para essa maior tolerância parece ser multifatorial. A matriz proporciona uma barreira física que reduz a penetração de antibióticos para o biofilme. Além disso, as células dentro dos biofilmes são fenotipicamente diversificada; eles transição entre diferentes estados metabólicos devido a um gradiente existente de oxigénio, nutrientes, metabolitos e entre as partes interior e exterior do biofilme 6. Assim, em algumas regiões do biofilme, como o núcleo, as bactérias são privadas de oxigênio e nutrientes e vive em um metabolicamente menos ativo ou um estado completamente adormecida 7. As células totalmente dormentes são referidas como células Persister, e eles não são sensíveis a tratamentos antimicrobianos convencionais 8. Assim, é provável que o biofilme resiliência surge a partir de uma combinação dos mecanismos presentemente sugeridas e outras, ainda desconhecidos,. Staphylococcus spp. ainda estão entre as bactérias gram-positivas mais problemáticas, causando graves, muitas vezes relacionados com o biofilme, infecções 4. Sugere-se que até 99% de todas as bactérias estão associadas dentro de biofilmes, tornando-o estilo de vida bacteriana predominante 3. No entanto, todos os antibióticos actualmente existentes têm sido desenvolvidos contra bactérias unicelulares (planctônicas). Até agora, um repertório limitado de moléculas que existe pode actuar selectivamente em biofilmes maduros. Esta situação tem impulsionado uma mudança de paradigma progressivo na descoberta de medicamentos, em que a procura para os anti-biofilme tem sido instado a ocupar um lugar mais proeminente.

De um methodologperspectiva iCal, existem desafios adicionais, já que apenas um número limitado de métodos de biofilme foram desenvolvidos por organizações de normalização, especialmente aqueles aplicáveis ​​ao rastreio de alto rendimento de bibliotecas químicas. Todos os ensaios normalizados (com apenas uma excepção) baseiam-se em reactores de biofilme, e estes métodos requerem grandes volumes de trabalho e grandes quantidades de compostos a serem testados, que são normalmente não disponível durante a fase precoce investigacional 9-12. O ensaio de rastreio-aplicável padronizado única existente é o assim chamado dispositivo de Calgary biofilme, a partir do qual o sistema disponível comercialmente biofilme eliminando concentração mínima (MBEC) foi desenvolvido 13-15. No entanto, a limitação deste ensaio é que os biofilmes são cultivadas em estacas, e nem todas as espécies bacterianas ou mesmo estirpes da mesma espécie são capazes de formar biofilmes sobre este dispositivo. Além disso, os métodos que podem ser especialmente aplicados para a exploração de compostos naturais sãonecessário. Produtos naturais têm sido a principal fonte de inovação na descoberta de medicamentos antimicrobianos durante o último século 16. Eles podem fornecer compostos anti-biofilme com novos mecanismos de acção único que também pode ser eficaz contra células Persister. Assim, a exploração de bibliotecas naturais e inspirados na natureza tem grandes chances de produzir leads anti-biofilme promissores e originais.

Aqui, apresentam-se os pormenores experimentais de uma plataforma de ensaios que foi desenvolvido para o rastreio de compostos químicos anti-biofilme usando três ensaios para medir os efeitos sobre a viabilidade, a biomassa total, e a matriz do biofilme Staphylococcus aureus. O primeiro ensaio mede a viabilidade do biofilme, e que se baseia na coloração resazurina. Resazurina é um corante redox azul e que é não fluorescente no seu estado oxidado e transforma-se em cor de rosa resorufina, altamente fluorescente quando reduzida pela actividade metabólica das bactérias. É um m muito simples e rápidoétodo adequado para exames preliminares 17-20. O segundo ensaio, com base na coloração de violeta de cristal, mede massa total do biofilme. Cristal violeta é uma mancha amplamente utilizado para estudar as bactérias e bactérias em biofilmes 19,21-23. O ensaio baseia-se reagentes baratos e tem um ponto de extremidade simples leitura de absorvância. Finalmente, o terceiro ensaio tem como alvo o -matrix extracelular substância polimérica (EPS) do biofilme através de aglutinina de gérmen de trigo (WGA), que se liga especificamente a poli- resíduos de glucosamina N-acetil-(PNAG) presentes na matriz do biofilme estafilocócicas 24. A WGA é conjugado com um fluoróforo, que pode ser detectado utilizando leitores de intensidade de fluorescência 25. Apresentamos aqui a lógica e os detalhes da plataforma que desenvolvemos, incluindo exemplos de aplicações.

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Protocolo

1. o crescimento da bactéria

  1. Pré-cultura das bactérias durante a noite num caldo de soja tríptica (TSB) a 37 ° C com 220 rpm de agitação (16-18 h).
  2. Dilui-se a pré-cultura 100-1000 vezes (dependendo da taxa de crescimento das bactérias, aqui, 1.000 vezes é utilizado para S. aureus) em TSB fresco e deixar crescer a 37 ° C e 200 rpm para alcançar um crescimento exponencial (óptico densidade a 595 nm (OD 595) entre 0,2 e 0,6).
    NOTA: Este passo requer otimização específicas de tensão.

2. formação de biofilme: pré e pós-exposição

  1. Diluir os crescido exponencialmente cultura 100 vezes (o que equivale a aproximadamente 10 6 unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC / ml)).
  2. Protocolo de pré-exposição
    1. Para as amostras de controlo não tratadas, adicionar 200 ul da cultura bacteriana diluída por poço de uma placa de 96 microcavidades estéril.
    2. Adicionar 4 ul de um composto de teste ou um controleantibiótico (solução 50x estoque) e 196 ul da cultura bacteriana diluída por poço.
    3. Incubar-lo a 37 ° C num agitador de placas a 200 rpm durante 18 horas.
      Nota: Aqui usamos uma coqueteleira com uma órbita 2 mm.
  3. Protocolo pós-exposição
    1. Para todas as amostras, adicionar 200 ul da cultura bacteriana diluída por poço de uma placa de 96 microcavidades estéril.
    2. Incubar-lo a 37 ° C num agitador de placas a 200 rpm durante 18 horas.
      Nota: Aqui usamos uma coqueteleira com uma órbita 2 mm.
    3. Remover a solução planctônicas todo cuidadosamente, sem tocar no biofilme, utilizando uma pipeta de canais múltiplos.
    4. Adicionar 4 ul de um composto de teste ou um antibiótico de controlo (50x solução de estoque) e 196 ul de TSB por poço.
    5. Incubar-lo a 37 ° C num agitador de placas a 200 rpm durante uma 24 horas adicionais.
      Nota: Aqui usamos uma coqueteleira com uma órbita 2 mm.

3. resazurina Coloração Protocol para a avaliação da viabilidade de biofilmes

  1. Prepara-se uma solução de estoque de 0,1 mg / mL de resazurina (0,4 mM) em PBS estéril. Manter esta unidade estéril, protegida da exposição à luz, e a 4 ° C.
  2. Dilui-se a 1:50 da resazurina em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para obter uma concentração final de 20 uM.
  3. Transferir a solução inteira planctônicas (deixando os biofilmes nas cavidades) cuidadosamente, sem tocar nos biofilmes ou a criação de bolhas de ar, a uma placa de 96 poços separada, limpo, utilizando uma pipeta multicanal.
  4. Lave os biofilmes uma vez com PBS esterilizado adicionando 200 ul por poço, e retire-o cuidadosamente com uma pipeta multicanal.
  5. Adicionar 200 ul da resazurina diluída por poço da placa de biofilme usando uma pipeta de canais múltiplos.
  6. Incubar-lo na escuridão, à temperatura ambiente (RT), e a 200 rpm, com agitação durante aproximadamente 20 min, até que os controlos não tratados de biofilme são uniformemente rosa.
  7. Medir a fluorescência aλ exc = 560 nm e λ em = 590 nm com um leitor de placas (leitura superior).

4. A coloração de violeta de cristal Protocolo para Biomassa Quantificação de biofilmes Usando a mesma placa como no Passo 3

  1. Remover cuidadosamente a mancha resazurina dos poços utilizando uma pipeta multicanal.
  2. Fixar os biofilmes com 200 ul de metanol durante 15 min.
  3. Deixe que a placa de ar seco, durante 10 min.
  4. Adicionar 190 uL de 0,02% (vol / vol, diluída em água desionizada) de solução de violeta de cristal, cuidadosamente, utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Evitar tocar os lados dos poços com a mancha enquanto pipetagem e evitar a formação de bolhas de ar não premindo a pipeta para completar blow-out.
  5. Incubar durante 5 min à TA.
  6. Remover cuidadosamente a mancha, utilizando uma pipeta de canais múltiplos.
  7. Lavá-lo duas vezes com água desionizada (200 mL de cada vez).
  8. Deixe os poços secar durante 5 min à temperatura ambiente e dissolve-se a mancha remanescenteem 96% de etanol ou 33% de ácido acético.
  9. Incubar por 1 h à TA e ler a absorvância a 595 nm.

5. Avaliar o efeito bactericida sobre bactérias planctônicas Usando a placa de amostra mesmo que para os biofilmes

  1. Medir a turbidez a 595 nm da placa com a solução de 3,3 planctônicas.
  2. Manchar as bactérias planctônicas com resazurina pela adição de 10 ul do estoque resazurina por poço. Misturar bem por pipetagem.
  3. Incubar-lo no escuro a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos, até que os controlos não tratados são uniformemente rosa.
  4. Medir a fluorescência a λ exc = 560 nm e λ em = 590 nm.

6. germe de trigo Agglutinin coloração para Matrix Quantificação e microscopia de fluorescência de imagem de biofilmes

  1. quantificação Matrix
    1. Prepara-se uma solução / ml 5 ug da sonda WGA em PBS estéril.
    2. Use um pla amostra paralelaTE para esta coloração. Remover a solução de planctônicas os poços e lava-se uma vez com PBS estéril (200 uL por poço), cuidadosamente, utilizando uma pipeta de canais múltiplos, sem tocar nos biofilmes.
    3. Adicionar 200 uL de solução de WGA por poço de serem coradas.
    4. Incubar-lo no escuro a 4 ° C durante 2 h.
    5. Remover a mancha não ligado por lavagem dos poços com 200 ul de PBS três vezes.
    6. Deixe a placa secar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
    7. Dissolve-se o corante ligado em ácido acético a 33%, utilizando-se 200 ul por poço.
    8. Selar os poços com tampas de tiras e sonicate-los usando um sonicador banho de água durante 30 segundos à temperatura ambiente e 40 kHz.
    9. Incubar a placa durante 1 hora à TA.
    10. Repita o passo de sonicação. Os poços podem permanecer selado entre os passos de sonicação.
    11. Medir a fluorescência a λ ex = 495 nm e λ em = 520 nm com um leitor de placas (leitura superior).
  2. Visualizando a matriz commicroscopia de fluorescência
    1. Usar o mesmo protocolo como acima até a etapa 6.1.6.
    2. Após o passo de secagem, as amostras de visualizar com um microscópio de fluorescência, utilizando um filtro FITC (ou outro filtro de excitação apropriada verde).

7. coloração de células viáveis ​​e mortas dentro do biofilmes for Imaging com microscopia de fluorescência e quantificação do sinal para o rácio de verde para vermelho (G / R)

  1. Imagem com microscopia de fluorescência
    1. Prepara-se uma solução de cada uma das sondas (uma coloração de células viáveis ​​e as outras células mortas uma coloração), de acordo com as orientações do fabricante.
    2. Remover a solução de planctônicas os poços e lava-se uma vez com PBS estéril (200 uL por cavidade) utilizando uma pipeta multicanal.
    3. Adicionar 6 ml da solução de coloração por poço.
    4. Incubar a placa no escuro durante 15 min.
    5. Antes da microscopia, remover o excesso de líquido manualmente utilizando uma pipeta multicanal.
    6. Capturar as imagens usando um microscópio de fluorescência, utilizando por exemplo um filtro FITC (fluorescência verde, para células viáveis) ou um filtro de TRITC (vermelho de fluorescência, as células mortas).
  2. A quantificação do sinal como uma relação de fluorescência de verde para vermelho (L / R)
    1. Siga o mesmo protocolo como nos passos 7.1.1 e 7.1.2.
    2. Adicionar 200 ul da solução de coloração por poço e incubar durante 15 min no escuro.
    3. Medir a fluorescência com um leitor de placas a excitação comprimentos de onda / emissão 485/535 nm e 485/635 para fluorescência verde e vermelho, respectivamente (leitura superior).

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Resultados

Na plataforma proposta, os efeitos sobre a viabilidade, a biomassa, e a matriz do biofilme são quantificadas. Na sequência de trabalho (Figura 1), uma placa de amostra sejam marcadas com resazurina e subsequentemente com violeta de cristal para avaliar simultaneamente os efeitos sobre a viabilidade do biofilme bacteriano e na biomassa total do biofilme. Ambos os ensaios podem ser realizados consecutivamente na mesma placa, porque foi demonstrado anteriormente que uma pri...

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Discussão

Não há nenhum método único que pode medir simultaneamente o efeito de um composto sobre a viabilidade, a biomassa, e a matriz do biofilme. Por conseguinte, existe uma necessidade para a combinação de ensaios, a fim de detectar um efeito sobre os três pontos de extremidade, de preferência a uma etapa de rastreio primário.

Resazurina é um protocolo de coloração muito simples, consistindo apenas da adição da sonda redox. No entanto, o estabelecimento do tempo de incubação óptimo dos biofilmes c...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem o professor Paul Cos e LMPH, Universidade de Antuérpia, Bélgica por seu apoio durante o processo de filmagem em seu laboratório. Este trabalho foi financiado pela Academia de projectos Finlândia (projectos 272266 e 282981) e Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlândia. As contribuições técnicas de MSc Janni Kujala são reconhecidas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ResazurinSigma AldrichR7017
Cristal violetaSigma AldrichHT90132 
Aglutinina de Gérmen de Trigo, Conjugado Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificW11261
VIVO/MORTO BacLight Sondas molecularesL7012SYTO 9 para coloração de células viáveis verdes e iodeto de propídio para coloração de células mortas vermelhas
Fosfato Tampolado Ácido
Triptona de sojaLab M, NeogenLAB011
Caldo de soja triptinaLab M, NeogenLAB004
F96 Placa de poço Poliestireno Estéril Transparente Fundo planoThermo Fisher Scientific161093
Tampas de marca, tiras de 8Sigma AldrichBR781413-300EA
Banho ultrassônico da série Branson CPXSigma AldrichZ769428-1EA
MultipipetaThermo Fisher Scientific
Dispensador MultidropThermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Coulter
Leitor Multiplaca Varioskan FlashThermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC Rolamento 25923

Referências

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