Medição de diferencialmente metilada<em&gt; INS</em&gt; Espécies DNA em amostras de soro humano como um Cell Death Biomarcador de Ilhota β

Resumo

A morte celular das ilhotas β precede o desenvolvimento do diabetes tipo 1, e a detecção desse processo pode permitir uma intervenção terapêutica precoce. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de como medir espécies de DNA INS diferencialmente metiladas no soro humano como um biomarcador de morte celular β.

Resumo

Acredita-se que a morte das células β ilhotas esteja subjacente à patogênese de praticamente todas as formas de diabetes e preceda o desenvolvimento de hiperglicemia franca, especialmente no diabetes tipo 1. O desenvolvimento de biomarcadores sensíveis e confiáveis de morte celular β pode permitir uma intervenção terapêutica precoce para prevenir ou retardar o desenvolvimento do diabetes. Recentemente, vários grupos, incluindo o nosso, relataram que o DNA diferencialmente metilado que codifica a pré-pró-insulina (INS) livre de células na circulação está correlacionado à morte celular β no diabetes pré-tipo 1 e no diabetes tipo 1 de início recente. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo usando PCR digital para a medição do DNA INS livre de células que é diferencialmente metilado na citosina na posição -69 bp (em relação ao local de início da transcrição). Demonstramos que o ensaio pode distinguir entre citosina metilada e não metilada na posição -69 pb, é linear em várias ordens de magnitude, fornece quantificação absoluta do número de cópias de DNA e pode ser aplicado a amostras de soro humano de indivíduos com diabetes tipo 1 de início recente e controles livres de doença. O protocolo aqui descrito pode ser adaptado a qualquer espécie de DNA para a qual a detecção de citosinas diferencialmente metiladas seja desejada, seja da circulação ou de células e tecidos isolados, e pode fornecer quantificação absoluta de fragmentos de DNA.

Introdução

A diabetes de tipo 1 (DM1) é uma doença auto-imune que se caracteriza pela destruição do produtoras de insulina β células por células T auto-reactivas ^1. O diagnóstico de DM1 é tipicamente feito na medição (glucose no sangue> 200 mg / dl) em hiperglicemia, um indivíduo jovem magra, que pode apresentar-se com cetoacidose como evidência da deficiência de insulina. No momento do diagnóstico de DM1, existe evidência substancial de perda de função celular e β massa (50-90%) ^2. Em estudos clínicos, vários fármacos imunomoduladores que foram instituídos no momento do diagnóstico resultou na estabilização da função das células β (e, presumivelmente, de ....

Protocolo

Declaração de ética: Os protocolos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Indiana. Os pais dos sujeitos forneceram consentimento informado por escrito e as crianças com mais de 7 anos forneceram consentimento para sua participação.

1. Processamento de soro

NOTA: O ensaio descrito foi rigorosamente testado usando soro humano isolado da seguinte forma.

1. Colete sangue em um tubo de coleta de sangue vermelho (sem aditivo; sem revestimento).
2. Deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min para permitir a formação do coágulo.
3. Tubo de centrífuga a 2.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. ....

Resultados

Para interpretar os dados de forma adequada, usamos controles plasmídeo tanto para o DNA não metilado e metilado INS alvo em cada corrida PCR digital. Estes controlos asseguram que os sinais correspondentes para ADN metilado e não metilado são claramente distinguíveis. A Figura 1 mostra os gráficos de dispersão 2-D correspondentes às gotas para os controlos de plasmídeo contendo converteu-bissulfito não metilado ADN INS (Figura 1A), ADN.......

Discussão

A metilação de citosinas de ADN metiltransferases permite o controlo da transcrição epigenética em muitos genes. O gene INS em seres humanos é expressa quase exclusivamente em células ilhéu β, e parece haver uma correlação entre a frequência de metilação de citosinas no gene INS para o silenciamento de ¹¹ a sua transcrição. Como tal, a maioria dos tipos de células apresentam frequências substancialmente mais elevados de metilação do gene INS em vários citosinas, em comparação com cé.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aspirador de Topo Vermelho	Beckon Dickinson	366441	sem aditivo, interior não revestido,
tubo criogênico	Simport	T310-3A	polipropileno, tubo com tampa de rosca, qualquer tamanho
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51106
Poly(A)	Sigma	P9403	desamado em tampão TE (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) para 5 µ g/µ l
Etanol Absoluto (200 Provas)	Fisher Scientific	BP2818-500
DPBS (com CaCl2 e MgCl2)	Sigma	D8662
0.2 ml PCR 8-strip Tubes	MidSci	AVST
8-strip Caps, Dome	MidSci	AVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo		D5031
ddPCR Supermix para Sondas (Sem dUTP)	Biorad	1863024
Controle de Tampão para Sondas	Biorad	1863052
Mistura de Primer/Sonda Humana Não Metilada/Metilada	Life Technologies	AH21BH1
EcoR1	New England Biolabs	R0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-rodapé	Eppendorf	951020346
Selagem térmica de folha perfurável	Biorad	1814040
PX1 PCR Seladora	de placas Biorad	1814000
QX200 AutoDG Sistema de PCR digital de gotículas	Biorad	1864101
Óleo de geração de gotículas automatizadas para sondas	Biorad	186-4110
Cartucho DG32 para gerador de gotículas automatizado	Biorad	186-4108
Pontas de pipeta para gerador de gotículas automatizado	Biorad	186-4120
Caixas de ponta de pipeta para gerador de gotículas automatizado	Biorad	186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler Leitor	Biorad	1851197
QX200	Biorad	186-4003
Óleo de leitor de gotículas ddPCR	Biorad	186-3004

de 10 ml de gotículas