Medição de diferencialmente metilada INS Espécies DNA em amostras de soro humano como um Cell Death Biomarcador de Ilhota β

A diabetes de tipo 1 (DM1) é uma doença auto-imune que se caracteriza pela destruição do produtoras de insulina β células por células T auto-reactivas ^1. O diagnóstico de DM1 é tipicamente feito na medição (glucose no sangue> 200 mg / dl) em hiperglicemia, um indivíduo jovem magra, que pode apresentar-se com cetoacidose como evidência da deficiência de insulina. No momento do diagnóstico de DM1, existe evidência substancial de perda de função celular e β massa (50-90%) ^2. Em estudos clínicos, vários fármacos imunomoduladores que foram instituídos no momento do diagnóstico resultou na estabilização da função das células β (e, presumivelmente, de massa), mas nenhum deles resultou em remissão clínica de doença, uma descoberta que elevou a chamada para o desenvolvimento de biomarcadores para a detecção precoce da doença e para o acompanhamento longitudinal da eficácia da combinação de terapias de ^3,4. Os esforços dos consórcios internacionais, como ado Consórcio Rede de Investigação Islet Humano dos Institutos Nacionais de Heath ^5, têm enfatizado a necessidade de desenvolver biomarcadores que incidem sobre o stress celular β e morte em DM1.

Em linha com estes esforços, o nosso grupo e outros têm desenvolvido recentemente ensaios de biomarcadores que medem circulantes, fragmentos de DNA epigenetically modificados que surgem principalmente de morrer células p ^6-9. Em todos os ensaios publicados até à data, o foco tem sido sobre a quantificação do gene humano que codifica preproinsulina (INS), o que demonstra maiores graus de locais de CpG não metiladas nas regiões de codificação e o promotor, em comparação com outros tipos de células. A libertação de fragmentos de DNA INS não metiladas foi levantada a hipótese como decorrente principalmente de morrer (necróticas, apoptóticos) células beta. Os nossos estudos recentes mostraram que na juventude, as elevações da ADN INS ambos não metilado e metilado na posição -69 pb (em relação a tele transcricional começar local) foram observados em novo início DM1, e juntos servido biomarcadores como específicos para esta população ^6. Estes ensaios de biomarcadores envolvem o isolamento de ADN isento de células a partir do soro ou plasma utilizando estojos comerciais de rotação, seguida de uma conversão de bissulfito de DNA isolado (para converter citosinas não metiladas em uracilos, deixando as citosinas metiladas intacta).

Neste relatório, nós descrevemos os aspectos técnicos da coleta de amostra de soro, o isolamento de DNA livre de células a partir do soro, a conversão de bissulfito, eo desempenho de PCR digital de gota (de agora em diante, PCR digital) para DNA INS diferencialmente metilado.

Declaração de ética: Os protocolos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Indiana. Os pais dos sujeitos forneceram consentimento informado por escrito e as crianças com mais de 7 anos forneceram consentimento para sua participação.

1. Processamento de soro

NOTA: O ensaio descrito foi rigorosamente testado usando soro humano isolado da seguinte forma.

1. Colete sangue em um tubo de coleta de sangue vermelho (sem aditivo; sem revestimento).
2. Deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min para permitir a formação do coágulo.
3. Tubo de centrífuga a 2.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante (soro) para um novo tubo designado para armazenamento de soro (tubos de rosca de polipropileno, tamanho dependente das amostras).
4. Armazenar as amostras a -80 ºC até estarem prontas para o isolamento do ADN.

2. Extração de DNA sérico

NOTA: O DNA é extraído com um kit de extração de DNA usando 50 μl de soro (recomendado), seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.

1. Preparar 200 μl de tampão de lise + 1 μl de poli(A) (5 μg) por amostra num tubo de microcentrífuga. Vórtice por 15 seg. Reserve até a Etapa 2.3.
2. Colher amostras de soro do congelador a -80 ºC e descongelar à temperatura ambiente. Aumente o volume da amostra de soro até 200 μl no total usando solução salina tamponada com fosfato (PBS, com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio).
3. Lise a amostra adicionando 20 μl de protease (1,4 unidades Anson/ml) à amostra, seguida de 200 μl de tampão de lise / mistura de poliA (da Etapa 2.2) e vórtice por 8 segundos. Incube a amostra a 56 ° C por 10 min e, em seguida, centrifugue brevemente por 7 segundos em velocidade máxima em uma microcentrífuga (>10.000 x g).
4. Precipite o DNA adicionando 230 μl de etanol 100% à amostra e vórtice por 8 segundos. Centrifugue brevemente por 7 segundos na velocidade máxima (>10.000 x g).
5. Aplique o DNA na coluna de centrifugação adicionando 600 μl de mistura de amostra à mini coluna de centrifugação. Centrifugue a 6.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo e coloque a coluna em um tubo limpo.
6. Lave o DNA adicionando 500 μl de tampão de lavagem 1 à coluna. Centrifugue a 6.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo e coloque a coluna em um tubo limpo. Adicione 500 μl de tampão de lavagem 2 à coluna e centrifugue na velocidade máxima (>10.000 x g) por 3 min. Coloque a coluna em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugue novamente em velocidade máxima por 1 min.
7. Eluir o ADN colocando a coluna num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionando 60 μl de tampão de eluição directamente no filtro. É importante trocar as pontas entre as amostras para evitar a contaminação cruzada. Incube em temperatura ambiente por 5 min e depois centrifugue a 6.000 x g por 1 min. Adicione mais 60 μl de tampão de eluição e centrifugue a 6.000 x g por 1 min.
8. Armazenar o ADN a -20 ºC para utilização posterior ou proceder imediatamente à conversão do bissulfito.

3. Conversão de bissulfito

NOTA: A conversão de bissulfito é realizada usando um kit de conversão de bissulfito, seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.

1. Para converter citosinas não metiladas em uracilas, adicione 130 μl de reagente de conversão de bissulfito a 20 μl de DNA da etapa 2.7 em um tubo de PCR (tubo de PCR único de 0,2 ml ou tubos de PCR de 8 tiras). Guardar os restantes 40 μl de ADN para utilização futura ou utilizar em reacções replicadas. Misture 20 vezes pipetando para cima e para baixo e centrifugue brevemente para garantir que não haja gotas nas laterais ou na tampa. Incubar em banho-maria ou termociclador da seguinte forma: 98 °C durante 8 min, 54 °C durante 60 min, 4 °C durante 5 min.
   1. Prossiga para a etapa 3.2 ou armazene a 4 °C por até 20 horas.
2. Adicione 600 μl de tampão de ligação à coluna de centrifugação e coloque a coluna no tubo de coleta fornecido. Aplique o DNA bissulfito na coluna e misture pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Centrifugue na velocidade máxima (>10.000 x g) por 30 segundos.
3. Lave o DNA adicionando 100 μl de tampão de lavagem à coluna e centrifugue na velocidade máxima (>10.000 x g) por 30 segundos.
4. Realizar a dessulfonação para remover o grupo sulfonato para finalizar a conversão de citosinas não metiladas em uracila, adicionando 200 μl de tampão de dessulfonação à coluna. Deixe repousar em temperatura ambiente por 20 min e, em seguida, centrifugue em velocidade máxima (>10.000 x g) por 30 segundos.
5. Lavar o ADN adicionando 200 μl de tampão de lavagem à coluna e centrifugar à velocidade máxima durante 30 segundos. Rejeitar o fluxo e repetir esta etapa de lavagem.
6. Colocar a coluna num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluir o DNA adicionando 10 μl de tampão de eluição diretamente ao filtro de coluna. Incubar por 1 min. Centrifugue por 30 s em velocidade máxima para eluir o DNA. Quantificar o DNA recuperado por espectrofotometria em A260.
   NOTA: O DNA detectado por espectrofotometria representa principalmente o DNA poliA portador que foi adicionado no passo 2.3 acima. Normalmente, a recuperação de poliA é de ≥85% da entrada (>4,25 μg).
7. Conservar o ADN a -20 °C até estar pronto para prosseguir com a PCR digital.

4. PCR digital multiplex

1. Faça uma mistura mestre com solução suficiente para cada amostra e controle. Incluir pelo menos uma amostra contendo água (controlo negativo), uma amostra de um plasmídeo contendo INS não metilado (1 pg, controlo positivo), uma amostra de plasmídeo contendo INS metilado (1 pg, controlo positivo) e uma amostra contendo uma mistura de plasmídeos 1:1.
   1. Para preparar a mistura principal de PCR, adicione 12,5 μl por reação de tampão de PCR (por exemplo, 125 μl por 10 amostras), 1,25 μl por mistura de primer/sonda de reação (por exemplo, 12,5 μl por 10 amostras), 8,25 μl por água de reação (por exemplo, 82,5 μl por 10 amostras), 0,5 μl por enzima EcoR1 de reação (por exemplo, 5 μl por 10 amostras).
      NOTA: Os primers e sondas usados aqui são os seguintes: Primer direto: 5'-GGAAATTGTAGTTTTAGTTTTTTTTTTTTGT-3'; Primer reverso: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; Sonda FAM: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; Sonda VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
2. Configure a reação de PCR multiplex em uma placa de 96 poços. Adicione 19,5 μl de master mix a cada poço. Adicionar 2,5 μl de amostra de ADN convertida em bissulfito em cada alvéolo adequado (guardar os restantes 7,5 μl de ADN convertido em bissulfito ou utilizar em reacções replicadas). Misture pipetando para cima e para baixo várias vezes.
   NOTA: Todos os 8 poços em uma linha devem conter controle de amostra ou tampão.
3. Sele com um selo de alumínio usando um selador de placas e centrifugue em um girador de placas até que não haja líquido nas laterais dos poços.
4. Configure o gerador de gotículas automatizado na tela sensível ao toque.
   NOTA: Todos os 8 poços do cartucho devem conter sample ou controle tampão.
   1. Defina o número de linhas que estão sendo usadas tocando na(s) linha(s) em que as amostras são carregadas na placa de 96 poços da etapa 4.2 e realce a linha em azul para indicar uma linha ativa.
   2. Carregue os consumíveis de trás para frente para evitar contaminação. Para começar, adicione cartuchos ao longo da fileira de trás do instrumento. Coloque as pontas na linha central do instrumento.
      NOTA: Os cartuchos só podem caber nos suportes na orientação correta.
   3. Coloque a placa de 96 poços no instrumento. Remova um bloco frio do freezer a -20 ° C e coloque uma nova placa de 96 poços com rodapé nele. Coloque-o dentro do instrumento ao lado da placa de 96 poços carregada com amostra.
   4. Adicione óleo ao dispensador na frente do instrumento. Selecione o tipo de óleo na tela sensível ao toque.
   5. Toque no botão azul Iniciar para iniciar a corrida. Confirme a configuração da placa e toque no botão iniciar execução para começar.
5. Quando terminar, remova a placa de 96 poços que contém as gotículas recém-formadas e sele com uma vedação de alumínio usando um selador de placas.
6. Realize a PCR₁₀ em um termociclador usando o seguinte programa: 95 °C por 10:00 min; 40 ciclos a: 94 °C por 00:30 min, 57,5 °C por 01:00 min; 98 °C por 10:00 min; 12 °C por 10 min ou até 24 horas.
7. Coloque a placa no leitor de gotículas e configure o leitor.
   1. Clique na guia de configuração. Abra um novo modelo clicando em modelo > novo. Insira um nome de arquivo.
   2. Use o editor de poços para definir os parâmetros para cada amostra. Dê a cada amostra um nome exclusivo, defina o experimento como Detecção de Eventos Raros (R-RED) e defina o master mix para a mixagem usada na etapa 4.1.
   3. Dê um nome ao Alvo 1 (ou seja, não metilado) e defina o Alvo 1 como desconhecido (U). Dê um nome ao Alvo 2 (ou seja, metilado) e defina o Alvo 2 como referência (R).
   4. Clique na guia Executar para iniciar a execução. Na janela de opções de execução, selecione o produto químico de detecção (FAM/VIC).

5. Análise dos dados

1. Abra os resultados na guia analisar e analise usando o gráfico 2D com base em controles positivos (consulte a Figura 1).
2. Exporte o arquivo CSV gerado pelo leitor de gotículas para um programa de planilha para análise de dados.
3. Para gerar "cópias por μl" de soro, use a fórmula: (concentração * 250) / (volume de soro usado para isolamento de DNA em μl). ⁶
   NOTA: Os dados são normalmente convertidos em log₁₀ quando adquiridos do soro humano para garantir a distribuição normal. Alternativamente, os dados podem ser plotados em uma escala de log₁₀ e analisados por estatísticas não paramétricas.

Para interpretar os dados de forma adequada, usamos controles plasmídeo tanto para o DNA não metilado e metilado INS alvo em cada corrida PCR digital. Estes controlos asseguram que os sinais correspondentes para ADN metilado e não metilado são claramente distinguíveis. A Figura 1 mostra os gráficos de dispersão 2-D correspondentes às gotas para os controlos de plasmídeo contendo converteu-bissulfito não metilado ADN INS (Figura 1A), ADN INS metilado (Figura 1B), e uma mistura 1: 1 dos dois plasmídeos (Figura 1C). O plasmídeo não metilado contendo INS está indicado pelas gotículas positivos para o sinal de 6-carboxifluoresceína (FAM), enquanto que o INS plasmídeo contendo metilado é indicado pelas gotículas positivos para o sinal VIC. Na mistura 1: 1 de plasmídeo, uma população de gotículas de duplo-positivos é vista, correspondente às gotas que contenham ambas as espécies deADN. Para distinguir gotículas positivos de negativos gotas, os dados são fechadas utilizando estas parcelas 2-D. Note-se que na Figura 1A, existe um ligeiro deslocamento das gotículas FAM-positiva para o canal VIC, indicando que a sonda para o ADN metilado INS apresenta alguma reactividade cruzada para o ADN não metilado INS. Do mesmo modo, na Figura 1B, existe uma muito ligeira mudança das gotículas VIC-positivas no interior do canal FAM, indicando a reactividade cruzada da sonda para o ADN não metilado com ADN metilado. Uma grande vantagem de PCR digital é ainda possível discriminar sinais específicos, mesmo quando as sondas são 100% não específica. Para Poisson cálculos estatísticos apropriados pelo software, cada reacção de PCR deverá particionar em pelo menos 10.000 gotículas totais, exibir um conjunto de gotículas negativos, e mostram uma diferença de amplitude clara entre gotículas negativos e positivos (para gating confiável). Para demonstrar a linearidade dos nossos iniciadores, que Performed misturas dos dois plasmídeos em diversas ordens de magnitude. Como mostrado na Figura 2, variando as concentrações de um plasmídeo pode ser detectada de forma linear na presença de uma quantidade constante de o segundo plasmídeo. Para os novos laboratórios de realizar este procedimento, recomendamos a construção de uma experiência de mistura semelhante para assegurar que o ensaio está a funcionar de uma forma de detecção linear.

Em seguida, obteve-se soro de três indivíduos com DM1 de início recente (dentro de 2 dias de diagnóstico) e três indivíduos de controlo sem DM1 (ver Tabela 1 para características clínicas). Protocolos foram aprovados pela Universidade de Indiana Institutional Review Board. Os pais de indivíduos forneceram consentimento informado por escrito. A Figura 3 mostra a quantificação de ADN não metilado e metilado INS copiar números / ul de soro, convertido em log 10 a partir destes controlos e sujeitos DM1. Os dados mostram que i ndivíduos com DM1 apresentam níveis elevados de DNA INS tanto metilado e não metilado, em comparação com os controles, semelhantes aos dados reportados anteriormente 6.

Figura 1: Representante Lotes 2-D de Controles de plasmídeos. Padrões de plasmídeos foram gerados por clonagem de fragmentos de ADN convertidos INS-bissulfito abrigando a citosina não metilada ou metilado na posição -69 pb em relação ao INS transcricional iniciar local. Mostram-se parcelas de 2-D, utilizando plasmídeo não metilado contendo (A) e metilado (B) ADN INS e para uma mistura 1: 1 dos dois plasmídeos (C). As setas identificam o não metilado, metilado e não metilado + metilado (um duplo positivo) INS-DNA contendo gotículas. FAM = Meta 1; VIC = Target 2.ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação de Metas de DNA usando o controle de plasmídeo misturas. Padrões de plasmídeo contendo os fragmentos clonados de ADN convertido INS-bissulfito abrigando a citosina não metilada ou metilado na posição -69 pb em relação ao INS transcricional iniciar local foram misturados em várias combinações indicadas, em seguida, submetidos a PCR multiplex digital. A figura mostra a quantificação de fragmentos de DNA alvo, apresentadas como cópias / mL; r 2 = 0,989 para o ADN não metilado INS e r 2 = 0,998 para o ADN metilado INS. Por favor clique aqui paraver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Os níveis circulantes não metilado e de DNA INS metilatados Controles e indivíduos com DM1. As amostras de soro foram coletadas de 4 juventude com novo início DM1, e de 4, controles independentes livres da doença, então processado para medição de DNA INS diferencialmente metilado por PCR digital. São mostrados os resultados de ensaios de PCR digital para não metilado (A) e metilado (B) ADN INS. Os dados são apresentados como pontos individuais e médios ± SEM. As estatísticas foram analisadas por um teste de duas caudas Estudantes paramétricos t. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do this figura.

Tabela 1: Demografia de Controles e Indivíduos com DM1.

Os autores não têm nada a divulgar.