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Artigo de método

Medição de diferencialmente metilada

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DOI:

10.3791/54838

⸱

21 de dezembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, 3Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 4Indiana Biosciences Research Institute

Neste artigo

Resumo

A morte celular das ilhotas β precede o desenvolvimento do diabetes tipo 1, e a detecção desse processo pode permitir uma intervenção terapêutica precoce. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de como medir espécies de DNA INS diferencialmente metiladas no soro humano como um biomarcador de morte celular β.

Resumo

Acredita-se que a morte das células β ilhotas esteja subjacente à patogênese de praticamente todas as formas de diabetes e preceda o desenvolvimento de hiperglicemia franca, especialmente no diabetes tipo 1. O desenvolvimento de biomarcadores sensíveis e confiáveis de morte celular β pode permitir uma intervenção terapêutica precoce para prevenir ou retardar o desenvolvimento do diabetes. Recentemente, vários grupos, incluindo o nosso, relataram que o DNA diferencialmente metilado que codifica a pré-pró-insulina (INS) livre de células na circulação está correlacionado à morte celular β no diabetes pré-tipo 1 e no diabetes tipo 1 de início recente. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo usando PCR digital para a medição do DNA INS livre de células que é diferencialmente metilado na citosina na posição -69 bp (em relação ao local de início da transcrição). Demonstramos que o ensaio pode distinguir entre citosina metilada e não metilada na posição -69 pb, é linear em várias ordens de magnitude, fornece quantificação absoluta do número de cópias de DNA e pode ser aplicado a amostras de soro humano de indivíduos com diabetes tipo 1 de início recente e controles livres de doença. O protocolo aqui descrito pode ser adaptado a qualquer espécie de DNA para a qual a detecção de citosinas diferencialmente metiladas seja desejada, seja da circulação ou de células e tecidos isolados, e pode fornecer quantificação absoluta de fragmentos de DNA.

Introdução

A diabetes de tipo 1 (DM1) é uma doença auto-imune que se caracteriza pela destruição do produtoras de insulina β células por células T auto-reactivas 1. O diagnóstico de DM1 é tipicamente feito na medição (glucose no sangue> 200 mg / dl) em hiperglicemia, um indivíduo jovem magra, que pode apresentar-se com cetoacidose como evidência da deficiência de insulina. No momento do diagnóstico de DM1, existe evidência substancial de perda de função celular e β massa (50-90%) 2. Em estudos clínicos, vários fármacos imunomoduladores que foram instituídos no momento do diagnóstico resultou na estabilização da função das células β (e, presumivelmente, de massa), mas nenhum deles resultou em remissão clínica de doença, uma descoberta que elevou a chamada para o desenvolvimento de biomarcadores para a detecção precoce da doença e para o acompanhamento longitudinal da eficácia da combinação de terapias de 3,4. Os esforços dos consórcios internacionais, como ado Consórcio Rede de Investigação Islet Humano dos Institutos Nacionais de Heath 5, têm enfatizado a necessidade de desenvolver biomarcadores que incidem sobre o stress celular β e morte em DM1.

Em linha com estes esforços, o nosso grupo e outros têm desenvolvido recentemente ensaios de biomarcadores que medem circulantes, fragmentos de DNA epigenetically modificados que surgem principalmente de morrer células p 6-9. Em todos os ensaios publicados até à data, o foco tem sido sobre a quantificação do gene humano que codifica preproinsulina (INS), o que demonstra maiores graus de locais de CpG não metiladas nas regiões de codificação e o promotor, em comparação com outros tipos de células. A libertação de fragmentos de DNA INS não metiladas foi levantada a hipótese como decorrente principalmente de morrer (necróticas, apoptóticos) células beta. Os nossos estudos recentes mostraram que na juventude, as elevações da ADN INS ambos não metilado e metilado na posição -69 pb (em relação a tele transcricional começar local) foram observados em novo início DM1, e juntos servido biomarcadores como específicos para esta população 6. Estes ensaios de biomarcadores envolvem o isolamento de ADN isento de células a partir do soro ou plasma utilizando estojos comerciais de rotação, seguida de uma conversão de bissulfito de DNA isolado (para converter citosinas não metiladas em uracilos, deixando as citosinas metiladas intacta).

Neste relatório, nós descrevemos os aspectos técnicos da coleta de amostra de soro, o isolamento de DNA livre de células a partir do soro, a conversão de bissulfito, eo desempenho de PCR digital de gota (de agora em diante, PCR digital) para DNA INS diferencialmente metilado.

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Protocolo

Declaração de ética: Os protocolos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Indiana. Os pais dos sujeitos forneceram consentimento informado por escrito e as crianças com mais de 7 anos forneceram consentimento para sua participação.

1. Processamento de soro

NOTA: O ensaio descrito foi rigorosamente testado usando soro humano isolado da seguinte forma.

  1. Colete sangue em um tubo de coleta de sangue vermelho (sem aditivo; sem revestimento).
  2. Deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min para permitir a formação do coágulo.
  3. Tubo de centrífuga a 2.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante (soro) para um novo tubo designado para armazenamento de soro (tubos de rosca de polipropileno, tamanho dependente das amostras).
  4. Armazenar as amostras a -80 ºC até estarem prontas para o isolamento do ADN.

2. Extração de DNA sérico

NOTA: O DNA é extraído com um kit de extração de DNA usando 50 μl de soro (recomendado), seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.

  1. Preparar 200 μl de tampão de lise + 1 μl de poli(A) (5 μg) por amostra num tubo de microcentrífuga. Vórtice por 15 seg. Reserve até a Etapa 2.3.
  2. Colher amostras de soro do congelador a -80 ºC e descongelar à temperatura ambiente. Aumente o volume da amostra de soro até 200 μl no total usando solução salina tamponada com fosfato (PBS, com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio).
  3. Lise a amostra adicionando 20 μl de protease (1,4 unidades Anson/ml) à amostra, seguida de 200 μl de tampão de lise / mistura de poliA (da Etapa 2.2) e vórtice por 8 segundos. Incube a amostra a 56 ° C por 10 min e, em seguida, centrifugue brevemente por 7 segundos em velocidade máxima em uma microcentrífuga (>10.000 x g).
  4. Precipite o DNA adicionando 230 μl de etanol 100% à amostra e vórtice por 8 segundos. Centrifugue brevemente por 7 segundos na velocidade máxima (>10.000 x g).
  5. Aplique o DNA na coluna de centrifugação adicionando 600 μl de mistura de amostra à mini coluna de centrifugação. Centrifugue a 6.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo e coloque a coluna em um tubo limpo.
  6. Lave o DNA adicionando 500 μl de tampão de lavagem 1 à coluna. Centrifugue a 6.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo e coloque a coluna em um tubo limpo. Adicione 500 μl de tampão de lavagem 2 à coluna e centrifugue na velocidade máxima (>10.000 x g) por 3 min. Coloque a coluna em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugue novamente em velocidade máxima por 1 min.
  7. Eluir o ADN colocando a coluna num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionando 60 μl de tampão de eluição directamente no filtro. É importante trocar as pontas entre as amostras para evitar a contaminação cruzada. Incube em temperatura ambiente por 5 min e depois centrifugue a 6.000 x g por 1 min. Adicione mais 60 μl de tampão de eluição e centrifugue a 6.000 x g por 1 min.
  8. Armazenar o ADN a -20 ºC para utilização posterior ou proceder imediatamente à conversão do bissulfito.

3. Conversão de bissulfito

NOTA: A conversão de bissulfito é realizada usando um kit de conversão de bissulfito, seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.

  1. Para converter citosinas não metiladas em uracilas, adicione 130 μl de reagente de conversão de bissulfito a 20 μl de DNA da etapa 2.7 em um tubo de PCR (tubo de PCR único de 0,2 ml ou tubos de PCR de 8 tiras). Guardar os restantes 40 μl de ADN para utilização futura ou utilizar em reacções replicadas. Misture 20 vezes pipetando para cima e para baixo e centrifugue brevemente para garantir que não haja gotas nas laterais ou na tampa. Incubar em banho-maria ou termociclador da seguinte forma: 98 °C durante 8 min, 54 °C durante 60 min, 4 °C durante 5 min.
    1. Prossiga para a etapa 3.2 ou armazene a 4 °C por até 20 horas.
  2. Adicione 600 μl de tampão de ligação à coluna de centrifugação e coloque a coluna no tubo de coleta fornecido. Aplique o DNA bissulfito na coluna e misture pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Centrifugue na velocidade máxima (>10.000 x g) por 30 segundos.
  3. Lave o DNA adicionando 100 μl de tampão de lavagem à coluna e centrifugue na velocidade máxima (>10.000 x g) por 30 segundos.
  4. Realizar a dessulfonação para remover o grupo sulfonato para finalizar a conversão de citosinas não metiladas em uracila, adicionando 200 μl de tampão de dessulfonação à coluna. Deixe repousar em temperatura ambiente por 20 min e, em seguida, centrifugue em velocidade máxima (>10.000 x g) por 30 segundos.
  5. Lavar o ADN adicionando 200 μl de tampão de lavagem à coluna e centrifugar à velocidade máxima durante 30 segundos. Rejeitar o fluxo e repetir esta etapa de lavagem.
  6. Colocar a coluna num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluir o DNA adicionando 10 μl de tampão de eluição diretamente ao filtro de coluna. Incubar por 1 min. Centrifugue por 30 s em velocidade máxima para eluir o DNA. Quantificar o DNA recuperado por espectrofotometria em A260.
    NOTA: O DNA detectado por espectrofotometria representa principalmente o DNA poliA portador que foi adicionado no passo 2.3 acima. Normalmente, a recuperação de poliA é de ≥85% da entrada (>4,25 μg).
  7. Conservar o ADN a -20 °C até estar pronto para prosseguir com a PCR digital.

4. PCR digital multiplex

  1. Faça uma mistura mestre com solução suficiente para cada amostra e controle. Incluir pelo menos uma amostra contendo água (controlo negativo), uma amostra de um plasmídeo contendo INS não metilado (1 pg, controlo positivo), uma amostra de plasmídeo contendo INS metilado (1 pg, controlo positivo) e uma amostra contendo uma mistura de plasmídeos 1:1.
    1. Para preparar a mistura principal de PCR, adicione 12,5 μl por reação de tampão de PCR (por exemplo, 125 μl por 10 amostras), 1,25 μl por mistura de primer/sonda de reação (por exemplo, 12,5 μl por 10 amostras), 8,25 μl por água de reação (por exemplo, 82,5 μl por 10 amostras), 0,5 μl por enzima EcoR1 de reação (por exemplo, 5 μl por 10 amostras).
      NOTA: Os primers e sondas usados aqui são os seguintes: Primer direto: 5'-GGAAATTGTAGTTTTAGTTTTTTTTTTTTGT-3'; Primer reverso: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; Sonda FAM: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; Sonda VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
  2. Configure a reação de PCR multiplex em uma placa de 96 poços. Adicione 19,5 μl de master mix a cada poço. Adicionar 2,5 μl de amostra de ADN convertida em bissulfito em cada alvéolo adequado (guardar os restantes 7,5 μl de ADN convertido em bissulfito ou utilizar em reacções replicadas). Misture pipetando para cima e para baixo várias vezes.
    NOTA: Todos os 8 poços em uma linha devem conter controle de amostra ou tampão.
  3. Sele com um selo de alumínio usando um selador de placas e centrifugue em um girador de placas até que não haja líquido nas laterais dos poços.
  4. Configure o gerador de gotículas automatizado na tela sensível ao toque.
    NOTA: Todos os 8 poços do cartucho devem conter sample ou controle tampão.
    1. Defina o número de linhas que estão sendo usadas tocando na(s) linha(s) em que as amostras são carregadas na placa de 96 poços da etapa 4.2 e realce a linha em azul para indicar uma linha ativa.
    2. Carregue os consumíveis de trás para frente para evitar contaminação. Para começar, adicione cartuchos ao longo da fileira de trás do instrumento. Coloque as pontas na linha central do instrumento.
      NOTA: Os cartuchos só podem caber nos suportes na orientação correta.
    3. Coloque a placa de 96 poços no instrumento. Remova um bloco frio do freezer a -20 ° C e coloque uma nova placa de 96 poços com rodapé nele. Coloque-o dentro do instrumento ao lado da placa de 96 poços carregada com amostra.
    4. Adicione óleo ao dispensador na frente do instrumento. Selecione o tipo de óleo na tela sensível ao toque.
    5. Toque no botão azul Iniciar para iniciar a corrida. Confirme a configuração da placa e toque no botão iniciar execução para começar.
  5. Quando terminar, remova a placa de 96 poços que contém as gotículas recém-formadas e sele com uma vedação de alumínio usando um selador de placas.
  6. Realize a PCR10 em um termociclador usando o seguinte programa: 95 °C por 10:00 min; 40 ciclos a: 94 °C por 00:30 min, 57,5 °C por 01:00 min; 98 °C por 10:00 min; 12 °C por 10 min ou até 24 horas.
  7. Coloque a placa no leitor de gotículas e configure o leitor.
    1. Clique na guia de configuração. Abra um novo modelo clicando em modelo > novo. Insira um nome de arquivo.
    2. Use o editor de poços para definir os parâmetros para cada amostra. Dê a cada amostra um nome exclusivo, defina o experimento como Detecção de Eventos Raros (R-RED) e defina o master mix para a mixagem usada na etapa 4.1.
    3. Dê um nome ao Alvo 1 (ou seja, não metilado) e defina o Alvo 1 como desconhecido (U). Dê um nome ao Alvo 2 (ou seja, metilado) e defina o Alvo 2 como referência (R).
    4. Clique na guia Executar para iniciar a execução. Na janela de opções de execução, selecione o produto químico de detecção (FAM/VIC).

5. Análise dos dados

  1. Abra os resultados na guia analisar e analise usando o gráfico 2D com base em controles positivos (consulte a Figura 1).
  2. Exporte o arquivo CSV gerado pelo leitor de gotículas para um programa de planilha para análise de dados.
  3. Para gerar "cópias por μl" de soro, use a fórmula: (concentração * 250) / (volume de soro usado para isolamento de DNA em μl). 6
    NOTA: Os dados são normalmente convertidos em log10 quando adquiridos do soro humano para garantir a distribuição normal. Alternativamente, os dados podem ser plotados em uma escala de log10 e analisados por estatísticas não paramétricas.

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Resultados

Para interpretar os dados de forma adequada, usamos controles plasmídeo tanto para o DNA não metilado e metilado INS alvo em cada corrida PCR digital. Estes controlos asseguram que os sinais correspondentes para ADN metilado e não metilado são claramente distinguíveis. A Figura 1 mostra os gráficos de dispersão 2-D correspondentes às gotas para os controlos de plasmídeo contendo converteu-bissulfito não metilado ADN INS (Figura 1A), ADN...

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Discussão

A metilação de citosinas de ADN metiltransferases permite o controlo da transcrição epigenética em muitos genes. O gene INS em seres humanos é expressa quase exclusivamente em células ilhéu β, e parece haver uma correlação entre a frequência de metilação de citosinas no gene INS para o silenciamento de 11 a sua transcrição. Como tal, a maioria dos tipos de células apresentam frequências substancialmente mais elevados de metilação do gene INS em vários citosinas, em comparação com cé...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (para RGM). Gostaríamos de agradecer a assistência do Núcleo de Tradução do Centro de Pesquisa em Diabetes de Indiana, apoiado pelo National Institutes of Health grant P30 DK097512.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Aspirador de Topo Vermelho Beckon Dickinson366441sem aditivo, interior não revestido,
tubo criogênicoSimportT310-3Apolipropileno, tubo com tampa de rosca, qualquer tamanho
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51106
Poly(A)SigmaP9403desamado em tampão TE (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) para 5 µ g/µ l 
Etanol Absoluto (200 Provas)Fisher ScientificBP2818-500
DPBS (com CaCl2 e MgCl2)SigmaD8662
0.2 ml PCR 8-strip TubesMidSciAVST
8-strip Caps, DomeMidSciAVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit ZymoD5031
ddPCR Supermix para Sondas (Sem dUTP)Biorad1863024
Controle de Tampão para SondasBiorad1863052
Mistura de Primer/Sonda Humana Não Metilada/MetiladaLife TechnologiesAH21BH1
EcoR1New England BiolabsR0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-rodapéEppendorf951020346
Selagem térmica de folha perfurávelBiorad1814040
PX1 PCR Seladorade placas Biorad1814000
QX200 AutoDG Sistema de PCR digital de gotículasBiorad1864101
Óleo de geração de gotículas automatizadas para sondasBiorad186-4110
Cartucho DG32 para gerador de gotículas automatizadoBiorad186-4108
Pontas de pipeta para gerador de gotículas automatizadoBiorad186-4120
Caixas de ponta de pipeta para gerador de gotículas automatizadoBiorad186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler LeitorBiorad1851197
QX200Biorad186-4003
Óleo de leitor de gotículas ddPCRBiorad186-3004
de 10 ml de gotículas

Referências

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778(2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953(2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942(2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

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