High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Resumo

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

Resumo

as medidas tradicionais de atividade antimicrobiana intracelular e citotoxicidade de célula eucariótica contar com ensaios de ponto de extremidade. Tais ensaios de ponto final requerem vários passos experimentais adicionais antes da leitura, tais como lise celular, a determinação da unidade de formação de colónias, ou adição de reagentes. Ao realizar milhares de ensaios, por exemplo, durante a triagem de alto rendimento, a jusante do esforço necessário para estes tipos de ensaios é considerável. Portanto, para facilitar a descoberta de alto rendimento antimicrobianos, foi desenvolvido um ensaio em tempo real simultaneamente para identificar inibidores de crescimento bacteriano intracelular e avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Especificamente, a detecção de crescimento bacteriano intracelular em tempo real foi habilitado pela marcação estirpes bacterianas de triagem, quer com um operon bacteriano lux (1 ensaio de geração de ^st) ou repórteres de proteínas fluorescentes (de ^2ª geração, ensaio ortogonal). Um não-tóxico, célula de membrana-impermeabilizante, corante de ligação de ácido nucleicoTambém foi adicionado durante a infecção inicial de macrófagos. Estes corantes são excluídos a partir de células viáveis. No entanto, as células hospedeiras não viáveis ​​perder a integridade da membrana permitindo a entrada e marcação fluorescente de DNA nuclear (ácido desoxirribonucléico). Notavelmente, ADN de ligação está associado a um grande aumento no rendimento quântico fluorescente que fornece uma leitura à base de solução de morte da célula hospedeira. Temos utilizado este ensaio combinado para executar uma tela de alto rendimento em formato de microplacas, e para avaliar o crescimento intracelular e citotoxicidade por microscopia. Notavelmente, os agentes antimicrobianos podem demonstrar sinergia em que o efeito combinado de dois ou mais agentes antimicrobianos, quando aplicados em conjunto seja maior do que quando aplicados separadamente. Teste para sinergia in vitro contra patógenos intracelulares é normalmente uma tarefa prodigiosa como permutações combinatórias de antibióticos em diferentes concentrações, devem ser avaliados. No entanto, descobrimos que nosso ensaio em tempo real combinada com automatizada, dispensando tecnologia digital permitted testes sinergia fácil. Usando estas abordagens, que foram capazes de levantamento sistematicamente acção de um grande número de agentes antimicrobianos sozinho e em combinação contra o patogénio intracelular, Legionella pneumophila.

Introdução

Os patógenos que crescem ou residem temporariamente em compartimentos intracelulares são difíceis de erradicar terapeuticamente. Patógenos intracelulares obrigatórios ou relativamente obrigatórios, como Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis e Mycobacterium spp. muitas vezes requerem cursos prolongados de terapia antimicrobiana para cura que podem variar de meses a até anos. Além disso, os patógenos extracelulares podem ocupar transitoriamente nichos intracelulares e, dessa forma, escapar da depuração por cursos normais de terapia antimicrobiana e, posteriormente, emergir para iniciar novas rodadas de infecção virulenta. As infecções por Staphylococcus aureus¹ e Enterobacteriaceae^2,3 uropatogênicas são dois exemplos cada vez mais reconhecidos. Portanto, um objetivo fundamental da descoberta de medicamentos é identificar novos antimicrobianos que penetram nos compartimentos intracelulares. A terapia ideal para erradicar rapidamente os organismos intracelulares e prevenir o desenvolvimento de resistência por meio da exposição antimicrobiana subinibitória é especialmente desejável.

Para esse fim, desenvolvemos uma tecnologia de triagem de alto rendimento para identificar antimicrobianos penetrantes intracelulares direcionados ao crescimento intracelular do patógeno modelo, Legionella pneumophila. ⁴ Observações clínicas anteriores indicam que o teste padrão de suscetibilidade antimicrobiana não previu com precisão a eficácia terapêutica in vivo contra esse organismo. ⁵ Especificamente, isso ocorreu porque as principais classes de antimicrobianos, como β-lactâmicos e aminoglicosídeos, embora altamente eficazes contra a Legionella cultivada axenicamente, não penetram suficientemente nos compartimentos intracelulares onde a Legionella reside. ^5,6 Evidências posteriores sugeriram que ensaios de crescimento intracelular tecnicamente mais complexos previram efetivamente a eficácia clínica. ⁷ Infelizmente, esses ensaios foram ensaios de desfechos extremamente trabalhosos, exigindo macrófagos infectados, tratados com antimicrobianos, para serem lisados em diferentes momentos para enumeração de unidades formadoras de colônias. Esses ensaios são impraticáveis de fazer em larga escala e são inadequados para a descoberta de medicamentos de alto rendimento.

Portanto, desenvolvemos tecnologia para determinação em tempo real do crescimento bacteriano intracelular. ⁶ Isso foi realizado por meio do uso de uma cepa bacteriana modificada pela integração de um^{operon 8} de luciferase bacteriana (ensaio de primeira geração, descrito anteriormente)⁴ ou repórteres de proteína fluorescente⁹ (ensaio ortogonal de segunda geração, descrito aqui) no cromossomo bacteriano. Desta forma, o sinal luminescente ou fluorescente fornece uma leitura substituta em tempo real do número bacteriano.

No entanto, esses atributos não abordam um grande fator de confusão nos ensaios de infecção intracelular, efeitos fora do alvo nas células hospedeiras. Em particular, a morte da célula hospedeira limita inerentemente o crescimento intracelular e leva à identificação falsa positiva do efeito antimicrobiano. Como muitos compostos em bibliotecas de triagem são tóxicos para células eucarióticas, esses falsos positivos sobrecarregariam os verdadeiros antimicrobianos, necessitando de um grande número de ensaios de citotoxicidade de ponto final de acompanhamento para resolução.

Assim, foi de grande interesse poder avaliar a viabilidade celular eucariótica e o crescimento intracelular simultaneamente. Notavelmente, uma característica das células eucarióticas não viáveis é a perda da integridade da membrana celular. Sondas que testam a permeabilidade da membrana celular podem, portanto, ser usadas para avaliar a viabilidade celular. Anteriormente, caracterizamos a capacidade de uma série de corantes de ligação ao DNA, fluorescentes, supostamente impermeáveis à membrana celular, de acessar e corar o DNA nuclear de células mortas. ⁴ Ao ligar o DNA nuclear, esses corantes exibem um grande aumento no rendimento fluorescente quântico, resultando em aumento do sinal sobre a fluorescência da solução de fundo. Como tal, esses corantes forneceram uma leitura quantitativa da morte celular eucariótica. ⁴ Notavelmente, descobrimos que vários não eram tóxicos durante a co-incubação prolongada com macrófagos J774. Quando adicionados durante a infecção inicial, eles forneceram uma leitura fluorescente em tempo real da morte celular eucariótica que pode ser medida por um fluorímetro de microplaca ou observada microscopicamente.

Portanto, combinando o uso de um repórter bacteriano e corantes não tóxicos, impermeantes à membrana e de ligação ao DNA, fomos capazes de desenvolver um ensaio simples, não destrutivo e em tempo real para medir a carga bacteriana e a citotoxicidade das células eucarióticas simultaneamente. Este ensaio nos permitiu rastrear em formato de placa de 384 poços ~ 10.000 bioativos conhecidos, incluindo ~ 250 antimicrobianos e > 240.000 pequenas moléculas com atividade funcionalmente não caracterizada para a capacidade de inibir o crescimento intracelular de Legionella pneumophila, ao mesmo tempo em que gera dados de citotoxicidade de células eucarióticas para cada composto. ⁶ Nossa análise de antimicrobianos conhecidos contra o crescimento intracelular de Legionella foi a exploração mais abrangente desse tipo até o momento. ⁶

Com base na eficiência do nosso formato de ensaio, também exploramos posteriormente os efeitos potencialmente sinérgicos de antimicrobianos conhecidos quando usados em combinação. Um dos testes de sinergia mais comuns, o chamado ensaio quadriculado, é realizado de forma padrão avaliando os efeitos combinatórios de diluições seriais duplas de dois ou mais antimicrobianos. ¹⁰ Nesses ensaios, a sinergia é definida pela observação de maior efeito quando dois ou mais antimicrobianos são aplicados juntos do que a soma dos efeitos de cada um aplicado separadamente. É importante notar que, até agora, apenas testes de sinergia focados e seletivos foram realizados contra Legionella pneumophila intracelular devido ao grande esforço envolvido nos ensaios de endpoint tradicionais multiplicados pelas permutações combinatórias necessárias.

Para facilitar o teste de sinergia, usamos nosso ensaio de crescimento intracelular/citotoxicidade eucariótica em tempo real em combinação com a tecnologia de dispensação digital automatizada⁶. Essa automação nos permitiu dispensar diluições em série de compostos dissolvidos em DMSO ou solução aquosa isoladamente ou em combinação no formato de 384 poços. ¹¹ Além disso, essa tecnologia robusta de manuseio de líquidos nos permitiu realizar facilmente combinações de diluição de raiz quadrada de dois (em vez da padrão, resolução mais baixa, duplicação) para alcançar níveis mais altos de especificidade em nossa análise de sinergia quadridimensional e quadriculada. Esta resolução foi especialmente valiosa para abordar as preocupações no campo da sinergia sobre a reprodutibilidade ao usar a série de diluição dupla¹². Por fim, nosso ensaio foi quantitativo e, portanto, também mediu gradações de inibição. Como resultado, o ensaio capturou a totalidade das informações inibitórias, expressas em isobologramas de isocontorno nos quais os isocontornos conectam concentrações combinatórias com níveis semelhantes de inibição do crescimento. ⁶ Essa estratégia de plotagem permitiu a visualização de curvas combinatórias de dose-resposta. Para ilustrar nossa metodologia, descrevemos nosso protocolo para a realização desses ensaios e mostramos resultados representativos.

Protocolo

1. Ensaio de crescimento intracelular em tempo real e citotoxicidade de células eucarióticas

1. Preparando células hospedeiras (células J774A.1)
   1. Cultura J774A.1 Mus musculus células semelhantes a macrófagos em suspensão em RPMI 1640 com 9% de soro de bezerro suplementado com ferro. Inicialmente passagem em frascos de cultura de tecidos. Depois de as células se terem tornado confluentes num balão de cultura de tecidos de 75 cm² em 15 ml de meio, divididas por raspagem e diluição para 65 ml com o mesmo tipo de meio, dos quais 15 ml são devolvidos ao balão de cultura de tecidos e 50 ml são transferidos para um agitador bacteriano de 250 ml.
   2. Para o aumento de escala, cultura em suspensão em frascos bacterianos de 250 ml e/ou 1.000 ml cheios até um quinto do volume com meio de cultura de tecidos. Arejar regulando a velocidade de rotação em cerca de 120 rotações por minuto. Para um crescimento consistente, incubar a exatamente 5% de CO₂ e 37 °C.
   3. Colha as células quando atingirem uma densidade na faixa de 2,5 x 10⁶ células/ml a 5 x 10⁶ células/ml. Certifique-se de que a porcentagem de células mortas (mais facilmente analisada pela coloração com azul de tripano) não exceda 25%, pois as células mortas aumentarão o ruído de fundo nos ensaios de citotoxicidade.
   4. Placa em microplacas brancas, tratadas com cultura de tecidos, de 384 poços, a 5 x 10⁴ células J774A.1 em 30 μl de meio de cultura de tecidos por alvéolo. Incube as microplacas durante a noite para atingir 90% de confluência no dia do experimento.
2. Preparando Legionella pneumophila luminescente ou fluorescente
   1. Passagem L. pneumophila (Lp02::flaA::lux⁸) bactérias em meio apropriado, ou seja, meio de extrato de levedura de carvão tamponado (BCYE). Se estiver usando uma cepa auxotrófica de timidina, suplementar o meio com 100 μg / ml de timidina. Prepare manchas de bactérias para experimentos espalhando organismos densamente em uma nova placa BCYE e incubando um dia (se de uma passagem anterior da placa) ou dois a três dias (se de estoque congelado) para obter crescimento confluente.
      1. Prepare as placas BCYE dissolvendo 10 g de extrato de levedura, 10 g de ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanossulfônico, 0,35 g K₂HPO₄ e 1 g de α-cetoglutarato de potássio monobásico em 950 ml de água deionizada. Ajustar para pH 6,9 com hidróxido de potássio (≥2,5 ml de solução 11,9 molar).
      2. Adicionar 15 g de ágar e 2 g de carvão activado e levar a 1 L de volume final. Adicione uma barra de agitação magnética e autoclave. Arrefecer o meio a 55 °C e adicionar soluções esterilizadas por filtro contendo 0,4 g de L-cisteína e 0,42 g de citrato de ferro (III) de amónio dissolvido em água desionizada. Use a placa de agitação magnética para misturar antes de despejar as placas de Petri.
      3. Para testar o crescimento de L. pneumophila em meio de crescimento axênico, preparar o caldo de extrato de levedura ACES (AYE) combinando todos os reagentes químicos usados para BCYE, exceto carvão e ágar. Filtre, esterilize e use imediatamente ou congele para experimentos posteriores.
   2. Ressuspender os organismos no mesmo meio de cultura de tecidos utilizado para as células J774A.1 com 100 μg/ml de suplementação de timidina, conforme adequado.
3. Infecção por macrófagos
   1. Adicionar compostos de teste de interesse (compostos de triagem e controles positivos e negativos para inibição do crescimento bacteriano e lise de células eucarióticas). De preferência, dissolver as soluções-mãe a ≥500x em DMSO (dimetilsulfóxido) ou numa solução aquosa para permitir uma diluição suficiente do veículo.
      1. Embora as soluções de estoque possam ser armazenadas congeladas, evite ciclos de congelamento e descongelamento para compostos lábeis e antimicrobianos.
   2. Dilua as bactérias luminescentes para atingir 2,5 x 10⁶ UFC (unidade formadora de colônias) / m e as bactérias fluorescentes marcadas com repórter para 1,0 x 10⁷ UFC / ml em meio de cultura de tecidos e adicione o corante de ligação a ácidos nucleicos não tóxico e impermeável à membrana apropriado na concentração final do ensaio de 2,5x.
   3. Adicione 20 μl de mistura a cada poço de cultura J774A.1, volume final do ensaio 50 μl, concentração bacteriana final 1 x 10⁶ UFC/ml (repórter de operon lux) ou 4 x 10^{10 6} UFC/ml (repórter de proteína fluorescente).
   4. Incubar a 37 °C por 1-3 dias em 5% de CO₂ a 100% de umidade relativa para evitar efeitos de borda evaporativa.
4. Leitura do ensaio
   1. Leia o crescimento bacteriano e a toxicidade das células eucarióticas em um luminômetro de microplaca e fluorímetro, conforme apropriado para os repórteres que estão sendo usados.
      1. Para evitar efeitos de borda associados à temperatura, equilibre termicamente as microplacas antes da leitura de luminescência, colocando-as em uma única camada em uma bancada de laboratório com as tampas entreabertas por aproximadamente 20 min (ou em um gabinete de segurança biológica com as tampas abertas por aproximadamente 10 min).
   2. Retorne as microplacas à incubadora se desejar a leitura em tempo real em momentos posteriores.

2. Análise dos dados

1. Normalize os dados para controles positivos e negativos para calcular a porcentagem ou inibição de dobras para o crescimento bacteriano intracelular e a porcentagem de citotoxicidade para células eucarióticas.
2. Para avaliar a robustez do ensaio, calcule a separação estatística entre controles positivos e negativos para inibição do crescimento bacteriano e citotoxicidade usando a análise do fator Z (Z') onde Z' = 1 - 3(σ_p + σ_n)/|μ_p + μ_n|. Nesta equação, σ_p e σ_n são os desvios-padrão para os poços de controle positivo e negativo, respectivamente; μ_p e μ_n são os valores médios para os poços de controle positivo e negativo, respectivamente.
   1. Para ensaios de triagem de alto rendimento, calcule escores z padrão (ou outras medidas estatísticas quantitativas alternativas) para avaliar os efeitos dos compostos de teste de interesse. Alternativamente, calcule uma redução de dobra simples ou redução de dobra logarítmica como uma medida potencialmente fisiologicamente mais relevante da magnitude do efeito para bactérias que se replicam geometricamente.

3. Teste de dose-resposta e interpretação de dados unidimensionais e multidimensionais (ou seja, sinergia)

1. Prepare macrófagos e bactérias conforme descrito na seção 1 do protocolo.
2. Pouco antes da infecção ou incubação axênica, adicione antimicrobianos de interesse experimental em uma série de diluição dupla em série, com o objetivo de abranger na extremidade superior uma concentração que elimina completamente o crescimento (ou seja, a concentração inibitória mínima ou CIM) e na extremidade inferior uma concentração que não mostra atividade óbvia.
3. Use um sistema automatizado de manuseio de líquidos para facilitar a configuração de testes de sinergia combinatória e de dose única por meio da adição direta e automatizada de diluições antimicrobianas de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Considere o uso de diluições subduplicadas, por exemplo, vezes e replicações de ensaio para aumentar a precisão e a reprodutibilidade dos dados.
5. Para infecção por macrófagos, dilua as bactérias luminescentes até atingir 2,5 x 10⁶ UFC (unidade formadora de colônias) / ml em meio de cultura de tecidos. Adicionar 20 μl de mistura a cada poço de cultura J774A.1, volume final do ensaio 50 μl, concentração bacteriana final 1 x 10⁶ UFC/ml; e incubar a 37 °C em 5% de CO₂ a 100% de umidade relativa.
   1. Para o teste de crescimento axênico, diluir as bactérias luminescentes até a concentração final de 1 x 10⁶ UFC / ml em meio AYE, adicionar 50 μl a cada alvéolo de uma placa de 384 poços e incubar a 37 ° C em 5% CO₂ a 100% de umidade relativa.
6. Calcule o índice de concentração de inibidores fracionários para combinações antimicrobianas que inibem o crescimento bacteriano. Para cada medicamento na combinação (a, b, . . n) que resulta em inibição completa ou >99% do crescimento bacteriano, calcule a concentração inibitória fracionária individual (FIC_{a, b, . . n.}) da seguinte forma: FIC_a = a concentração do composto "a" dividida pela concentração inibidora mínima de "a" por si só. _. Usando a mesma fórmula, calcule FIC_b, etc. Em seguida, calcule o índice FIC combinatório ou FIC = FIC_a + FIC_b + . . . FIC_n para cada combinação inibitória.
   1. Use o índice combinatório que se desvia mais de 1,0 para avaliar a sinergia. Considere um ponto de corte de ≤0,5 como uma indicação conservadora de um efeito sinérgico e ≥4, um efeito antagonista. ¹²
   2. Plote isobologramas, isobologramas de isocontorno e/ou isobologramas de isosuperfície⁶ como representações gráficas alternativas de efeitos combinatórios.

Resultados

Ensaio de crescimento intracelular em microplacas

A Figura 1 diagrama as etapas do ensaio. As etapas automatizadas mostradas podem ser executadas manualmente. No entanto, o rendimento é muito facilitado usando sistemas de manuseio de líquidos.

A Figura 2 mostra resultados representativos de um ensaio de microplaca de 384 poços, leitura...

Discussão

Descrevemos ensaios em tempo real para detecção simultânea de crescimento bacteriano intracelular e citotoxicidade da célula hospedeira. Existem várias etapas críticas no protocolo. Primeiro, para um desempenho robusto do ensaio, deve haver separação espectral suficiente entre as leituras bacterianas e de citotoxicidade. Essa separação é intrínseca para combinações de repórteres de operon de luciferase e corantes fluorescentes de ligação ao DNA. No entanto, com base em nossa experiência (Tabela 1-3,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células J774A.1	American Type Culture Collection	TIB-67	Célula hospedeira
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Extrato de levedura, ultrafiltrado	Becton-Dickinson / Difco	210929	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado; graus mais baixos podem causar crescimento prejudicado e / ou alterar a sensibilidade de Legionella a inibidores de crescimento
Ácido alfa-cetoglutárico, sal monopotássico	Sigma-Aldrich	K2000	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P5280	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Fosfato de potássio, dibásico	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
L-cisteína	Sigma-Aldrich	C-7755	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio
de extrato de levedura tamponadoCitrato de ferro amônio (III)	Sigma-Aldrich	F5879	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado; pirofosfato férrico pode ser usado, mas é mais difícil pesar com precisão
Solução de hidróxido de potássio, concentrada	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
deonizada	N / A	N / A	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Timidina (grau de cultura de tecidos)	Sigma-Aldrich	T1895	Para suplementar tanto o RPMI 1640 quanto o extrato de levedura tamponado ágar / meio - a timidina de grau inferior pode ser usada para o último, mas pode causar crescimento celular prejudicado e/ou morte celular em RPMI 1640
RPMI 1640, formulação padrão	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Para o crescimento de células J774A.1 antes do plaqueamento; inclui 2 mM L-glutamina
RPMI 1640 sem vermelho de fenol	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Para o revestimento de células J774A.1 em placas de 384 poços (não adequado para crescimento antes do revestimento); também falta L-glutamina - suplemento para 2 mM antes
do uso de L-glutamina, 200 mM em 0,85% de NaCl (grau de cultura de tecidos)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Para suplementar RPMI 1640 sem L-glutamina, a 2 mM de concentração final Soro
de bezerro suplementado com ferro	Gemini Bioproducts	100-510	Para suplementar RPMI 1640, a 9,1% de concentração final
Solução de Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154	Para coloração para determinação da morte celular J774A.1 durante a contagem da densidade celular
SYTOX Green, solução de 5 mM em DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Para coloração para determinação da morte celular J774A.1 por leitura de fluorescência ou microscopia de epifluorescência (em conjunto com bactérias fluorescentes vermelho-alaranjadas ou vermelhas distantes). Use na concentração final de 125 nM.
Incubadora de cultura de células	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Para incubação de células J774A.1 (antes e depois da infecção); também pode ser usado para incubação de bactérias, ou uma incubadora de atmosfera padrão pode ser usada em seu lugar)
Agitador orbital	BellCo Glass	7744-01010	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção; cabe dentro da incubadora de cultura de células; inclui base agitadora 7744-01000 e bandeja 7740-01010 (estes também estão disponíveis separadamente)
Frascos agitadores (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Grampos agitadores para frascos (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Frascos agitados (1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Grampos agitadores para frascos (1.000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Tampas de espuma de esponja para frascos (250 ml-1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção; reduz o risco de contaminação em relação às tampas metálicas padrão
Bomba peristáltica multicanal programável MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Para dispensar células J774A.1, meio e suspensão bacteriana contendo fluoróforos para um grande número de pratos de 384 poços
Coletor de furo padrão Combi	Thermo Fisher Scientific	24072670	Volume de pré-distribuição padrão de 20 μ l é insuficiente para compensar o assentamento — aumentar para 80 μ l
Branco 384 pratos de poço tratados para cultura de tecidos	Corning	3570	Para leitura de luminescência e fluorescência; Catálogo Greiner # 781080 também testado com sucesso
DMSO (grau de cultura de tecidos, em ampolas seladas)	Sigma-Aldrich	D2650	Para dissolver o controle positivo e testar compostos
Azitromicina	Sigma-Aldrich	PHR1088	positivo
de antibióticos Saponina (da casca de Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Pipetador
	multicanal de controle positivo de citoxicidadeThermo Fisher Scientific	Finnpipette	Para transferência de quantidades fixas de compostos de controle positivo; pipetador deve ter dispensação digital com detentores para permitir a distribuição repetitiva de volume fixo
Robô de transferência de pinos Epson	Epson/ICCB-L	(equipamento personalizado)	Para transferência de quantidades fixas de compostos de teste de matrizes de bibliotecas
Sistema de dosagem digital D300	Hewlett-Packard via Tecan	D300	Para transferência de quantidades variáveis de compostos de teste variando de 11 picolitros a 10 µ l
Cartuchos T8+ para sistema de dosagem digital D300	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	Para distribuição de compostos de teste
Microscópio de epifluorescência com câmera digital conectada ao computador	Nikon	Ti	Para imagens de células vivas; qualquer microscópio fluorescente padrão pode substituir, com contraste de fase ou óptica DIC, capaz de imagens de fluorescência verde (fluoresceína), vermelho-alaranjado a vermelho (Texas Red) e vermelho distante (Cy5), com óleo 100X objetiva para
placas de cultura de tecidos com fundo de vidro	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Para imagens de células vivas. Pratos como o MatTek permitem a visualização microscópica com ampliação de 600X ou 1.000X através do uso de um microscópio epifluorescente ou confocal invertido. Esses pratos específicos têm 3,5 cm de diâmetro nominal, 3,3 cm de diâmetro interno, com lamínulas de 20 mm de diâmetro #1,5 de espessura inseridas no fundo.
Photoshop CS6	Adobe		, Adobe Photoshop ou programas semelhantes podem ser usados para pseudocolorir e mesclar imagens microscópicas e fluorescentes de luz.
Mathematica 10	Wolfam		Para geração de isobologramas de isocontorno bidimensionais e isobologramas tridimensionais de superfície.