High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Resumo

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

Resumo

as medidas tradicionais de atividade antimicrobiana intracelular e citotoxicidade de célula eucariótica contar com ensaios de ponto de extremidade. Tais ensaios de ponto final requerem vários passos experimentais adicionais antes da leitura, tais como lise celular, a determinação da unidade de formação de colónias, ou adição de reagentes. Ao realizar milhares de ensaios, por exemplo, durante a triagem de alto rendimento, a jusante do esforço necessário para estes tipos de ensaios é considerável. Portanto, para facilitar a descoberta de alto rendimento antimicrobianos, foi desenvolvido um ensaio em tempo real simultaneamente para identificar inibidores de crescimento bacteriano intracelular e avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Especificamente, a detecção de crescimento bacteriano intracelular em tempo real foi habilitado pela marcação estirpes bacterianas de triagem, quer com um operon bacteriano lux (1 ensaio de geração de ^st) ou repórteres de proteínas fluorescentes (de ^2ª geração, ensaio ortogonal). Um não-tóxico, célula de membrana-impermeabilizante, corante de ligação de ácido nucleicoTambém foi adicionado durante a infecção inicial de macrófagos. Estes corantes são excluídos a partir de células viáveis. No entanto, as células hospedeiras não viáveis ​​perder a integridade da membrana permitindo a entrada e marcação fluorescente de DNA nuclear (ácido desoxirribonucléico). Notavelmente, ADN de ligação está associado a um grande aumento no rendimento quântico fluorescente que fornece uma leitura à base de solução de morte da célula hospedeira. Temos utilizado este ensaio combinado para executar uma tela de alto rendimento em formato de microplacas, e para avaliar o crescimento intracelular e citotoxicidade por microscopia. Notavelmente, os agentes antimicrobianos podem demonstrar sinergia em que o efeito combinado de dois ou mais agentes antimicrobianos, quando aplicados em conjunto seja maior do que quando aplicados separadamente. Teste para sinergia in vitro contra patógenos intracelulares é normalmente uma tarefa prodigiosa como permutações combinatórias de antibióticos em diferentes concentrações, devem ser avaliados. No entanto, descobrimos que nosso ensaio em tempo real combinada com automatizada, dispensando tecnologia digital permitted testes sinergia fácil. Usando estas abordagens, que foram capazes de levantamento sistematicamente acção de um grande número de agentes antimicrobianos sozinho e em combinação contra o patogénio intracelular, Legionella pneumophila.

Introdução

Os patógenos que crescem ou residem temporariamente em compartimentos intracelulares são difíceis de erradicar terapeuticamente. Patógenos intracelulares obrigatórios ou relativamente obrigatórios, como Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis e Mycobacterium spp. muitas vezes requerem cursos prolongados de terapia antimicrobiana para cura que podem variar de meses a até anos. Além disso, os patógenos extracelulares podem ocupar transitoriamente nichos intracelulares e, dessa forma, escapar da depuração por cursos normais de terapia antimicrobiana e, posteriormente, emergir p....

Protocolo

1. Ensaio em Tempo Real de Crescimento Intracelular e Citotoxicidade em Células Eucarióticas

1. Preparação das Células Hospedeiras (Células J774A.1)
   1. Cultura J774A.1 Mus musculus células semelhantes a macrófagos em suspensão em RPMI 1640 com 9% de soro de bezerro suplementado com ferro. Passagem inicial em frascos de cultura de tecidos. Após as células atingirem confluência em um frasco de 75 cm² frasco de cultura de tecidos com 15 ml de meio, dividido por raspagem e diluição para 65 ml com o mesmo tipo de meio, dos quais 15 ml são retornados ao frasco de cultura de tecidos e 50 ml são transferidos para um frasco agitador bacte....

Resultados

Ensaio de crescimento intracelular em microplaca

Figura 1 esquematiza as etapas do ensaio. As etapas automatizadas mostradas podem ser realizadas manualmente. No entanto, o rendimento é grandemente facilitado com o uso de sistemas de manipulação de líquidos.

Figura 2 mostra resultados representativos de um ensaio em microplaca de 384 p.......

Discussão

Descrevemos ensaios em tempo real para detecção simultânea de crescimento bacteriano intracelular e citotoxicidade da célula hospedeira. Existem várias etapas críticas no protocolo. Primeiro, para um desempenho robusto do ensaio, deve haver separação espectral suficiente entre as leituras bacterianas e de citotoxicidade. Essa separação é intrínseca para combinações de repórteres de operon de luciferase e corantes fluorescentes de ligação ao DNA. No entanto, com base em nossa experiência (Tabela 1-3,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células J774A.1	American Type Culture Collection	TIB-67	Célula hospedeira
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Extrato de levedura, ultrafiltrado	Becton-Dickinson / Difco	210929	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado; graus mais baixos podem causar crescimento prejudicado e / ou alterar a sensibilidade de Legionella a inibidores de crescimento
Ácido alfa-cetoglutárico, sal monopotássico	Sigma-Aldrich	K2000	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P5280	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Fosfato de potássio, dibásico	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
L-cisteína	Sigma-Aldrich	C-7755	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio
de extrato de levedura tamponadoCitrato de ferro amônio (III)	Sigma-Aldrich	F5879	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado; pirofosfato férrico pode ser usado, mas é mais difícil pesar com precisão
Solução de hidróxido de potássio, concentrada	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
deonizada	N / A	N / A	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Timidina (grau de cultura de tecidos)	Sigma-Aldrich	T1895	Para suplementar tanto o RPMI 1640 quanto o extrato de levedura tamponado ágar / meio - a timidina de grau inferior pode ser usada para o último, mas pode causar crescimento celular prejudicado e/ou morte celular em RPMI 1640
RPMI 1640, formulação padrão	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Para o crescimento de células J774A.1 antes do plaqueamento; inclui 2 mM L-glutamina
RPMI 1640 sem vermelho de fenol	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Para o revestimento de células J774A.1 em placas de 384 poços (não adequado para crescimento antes do revestimento); também falta L-glutamina - suplemento para 2 mM antes
do uso de L-glutamina, 200 mM em 0,85% de NaCl (grau de cultura de tecidos)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Para suplementar RPMI 1640 sem L-glutamina, a 2 mM de concentração final Soro
de bezerro suplementado com ferro	Gemini Bioproducts	100-510	Para suplementar RPMI 1640, a 9,1% de concentração final
Solução de Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154	Para coloração para determinação da morte celular J774A.1 durante a contagem da densidade celular
SYTOX Green, solução de 5 mM em DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Para coloração para determinação da morte celular J774A.1 por leitura de fluorescência ou microscopia de epifluorescência (em conjunto com bactérias fluorescentes vermelho-alaranjadas ou vermelhas distantes). Use na concentração final de 125 nM.
Incubadora de cultura de células	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Para incubação de células J774A.1 (antes e depois da infecção); também pode ser usado para incubação de bactérias, ou uma incubadora de atmosfera padrão pode ser usada em seu lugar)
Agitador orbital	BellCo Glass	7744-01010	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção; cabe dentro da incubadora de cultura de células; inclui base agitadora 7744-01000 e bandeja 7740-01010 (estes também estão disponíveis separadamente)
Frascos agitadores (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Grampos agitadores para frascos (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Frascos agitados (1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Grampos agitadores para frascos (1.000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Tampas de espuma de esponja para frascos (250 ml-1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção; reduz o risco de contaminação em relação às tampas metálicas padrão
Bomba peristáltica multicanal programável MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Para dispensar células J774A.1, meio e suspensão bacteriana contendo fluoróforos para um grande número de pratos de 384 poços
Coletor de furo padrão Combi	Thermo Fisher Scientific	24072670	Volume de pré-distribuição padrão de 20 μ l é insuficiente para compensar o assentamento — aumentar para 80 μ l
Branco 384 pratos de poço tratados para cultura de tecidos	Corning	3570	Para leitura de luminescência e fluorescência; Catálogo Greiner # 781080 também testado com sucesso
DMSO (grau de cultura de tecidos, em ampolas seladas)	Sigma-Aldrich	D2650	Para dissolver o controle positivo e testar compostos
Azitromicina	Sigma-Aldrich	PHR1088	positivo
de antibióticos Saponina (da casca de Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Pipetador
	multicanal de controle positivo de citoxicidadeThermo Fisher Scientific	Finnpipette	Para transferência de quantidades fixas de compostos de controle positivo; pipetador deve ter dispensação digital com detentores para permitir a distribuição repetitiva de volume fixo
Robô de transferência de pinos Epson	Epson/ICCB-L	(equipamento personalizado)	Para transferência de quantidades fixas de compostos de teste de matrizes de bibliotecas
Sistema de dosagem digital D300	Hewlett-Packard via Tecan	D300	Para transferência de quantidades variáveis de compostos de teste variando de 11 picolitros a 10 µ l
Cartuchos T8+ para sistema de dosagem digital D300	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	Para distribuição de compostos de teste
Microscópio de epifluorescência com câmera digital conectada ao computador	Nikon	Ti	Para imagens de células vivas; qualquer microscópio fluorescente padrão pode substituir, com contraste de fase ou óptica DIC, capaz de imagens de fluorescência verde (fluoresceína), vermelho-alaranjado a vermelho (Texas Red) e vermelho distante (Cy5), com óleo 100X objetiva para
placas de cultura de tecidos com fundo de vidro	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Para imagens de células vivas. Pratos como o MatTek permitem a visualização microscópica com ampliação de 600X ou 1.000X através do uso de um microscópio epifluorescente ou confocal invertido. Esses pratos específicos têm 3,5 cm de diâmetro nominal, 3,3 cm de diâmetro interno, com lamínulas de 20 mm de diâmetro #1,5 de espessura inseridas no fundo.
Photoshop CS6	Adobe		, Adobe Photoshop ou programas semelhantes podem ser usados para pseudocolorir e mesclar imagens microscópicas e fluorescentes de luz.
Mathematica 10	Wolfam		Para geração de isobologramas de isocontorno bidimensionais e isobologramas tridimensionais de superfície.

Água Controle da mais alta resolução ,