High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Resumo

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

Resumo

as medidas tradicionais de atividade antimicrobiana intracelular e citotoxicidade de célula eucariótica contar com ensaios de ponto de extremidade. Tais ensaios de ponto final requerem vários passos experimentais adicionais antes da leitura, tais como lise celular, a determinação da unidade de formação de colónias, ou adição de reagentes. Ao realizar milhares de ensaios, por exemplo, durante a triagem de alto rendimento, a jusante do esforço necessário para estes tipos de ensaios é considerável. Portanto, para facilitar a descoberta de alto rendimento antimicrobianos, foi desenvolvido um ensaio em tempo real simultaneamente para identificar inibidores de crescimento bacteriano intracelular e avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Especificamente, a detecção de crescimento bacteriano intracelular em tempo real foi habilitado pela marcação estirpes bacterianas de triagem, quer com um operon bacteriano lux (1 ensaio de geração de ^st) ou repórteres de proteínas fluorescentes (de ^2ª geração, ensaio ortogonal). Um não-tóxico, célula de membrana-impermeabilizante, corante de ligação de ácido nucleicoTambém foi adicionado durante a infecção inicial de macrófagos. Estes corantes são excluídos a partir de células viáveis. No entanto, as células hospedeiras não viáveis ​​perder a integridade da membrana permitindo a entrada e marcação fluorescente de DNA nuclear (ácido desoxirribonucléico). Notavelmente, ADN de ligação está associado a um grande aumento no rendimento quântico fluorescente que fornece uma leitura à base de solução de morte da célula hospedeira. Temos utilizado este ensaio combinado para executar uma tela de alto rendimento em formato de microplacas, e para avaliar o crescimento intracelular e citotoxicidade por microscopia. Notavelmente, os agentes antimicrobianos podem demonstrar sinergia em que o efeito combinado de dois ou mais agentes antimicrobianos, quando aplicados em conjunto seja maior do que quando aplicados separadamente. Teste para sinergia in vitro contra patógenos intracelulares é normalmente uma tarefa prodigiosa como permutações combinatórias de antibióticos em diferentes concentrações, devem ser avaliados. No entanto, descobrimos que nosso ensaio em tempo real combinada com automatizada, dispensando tecnologia digital permitted testes sinergia fácil. Usando estas abordagens, que foram capazes de levantamento sistematicamente acção de um grande número de agentes antimicrobianos sozinho e em combinação contra o patogénio intracelular, Legionella pneumophila.

Introdução

Os patógenos que crescem ou residem temporariamente em compartimentos intracelulares são difíceis de erradicar terapeuticamente. Patógenos intracelulares obrigatórios ou relativamente obrigatórios, como Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis e Mycobacterium spp. muitas vezes requerem cursos prolongados de terapia antimicrobiana para cura que podem variar de meses a até anos. Além disso, os patógenos extracelulares podem ocupar transitoriamente nichos intracelulares e, dessa forma, escapar da depuração por cursos normais de terapia antimicrobiana e, posteriormente, emergir para iniciar novas rodadas de infecção virulenta. As infecções por Staphylococcus aureus¹ e Enterobacteriaceae^2,3 uropatogênicas são dois exemplos cada vez mais reconhecidos. Portanto, um objetivo fundamental da descoberta de medicamentos é identificar novos antimicrobianos que penetram nos compartimentos intracelulares. A terapia ideal para erradicar rapidamente os organismos intracelulares e prevenir o desenvolvimento de resistência por meio da exposição antimicrobiana subinibitória é especialmente desejável.

Para esse fim, desenvolvemos uma tecnologia de triagem de alto rendimento para identificar antimicrobianos penetrantes intracelulares direcionados ao crescimento intracelular do patógeno modelo, Legionella pneumophila. ⁴ Observações clínicas anteriores indicam que o teste padrão de suscetibilidade antimicrobiana não previu com precisão a eficácia terapêutica in vivo contra esse organismo. ⁵ Especificamente, isso ocorreu porque as principais classes de antimicrobianos, como β-lactâmicos e aminoglicosídeos, embora altamente eficazes contra a Legionella cultivada axenicamente, não penetram suficientemente nos compartimentos intracelulares onde a Legionella reside. ^5,6 Evidências posteriores sugeriram que ensaios de crescimento intracelular tecnicamente mais complexos previram efetivamente a eficácia clínica. ⁷ Infelizmente, esses ensaios foram ensaios de desfechos extremamente trabalhosos, exigindo macrófagos infectados, tratados com antimicrobianos, para serem lisados em diferentes momentos para enumeração de unidades formadoras de colônias. Esses ensaios são impraticáveis de fazer em larga escala e são inadequados para a descoberta de medicamentos de alto rendimento.

Portanto, desenvolvemos tecnologia para determinação em tempo real do crescimento bacteriano intracelular. ⁶ Isso foi realizado por meio do uso de uma cepa bacteriana modificada pela integração de um^{operon 8} de luciferase bacteriana (ensaio de primeira geração, descrito anteriormente)⁴ ou repórteres de proteína fluorescente⁹ (ensaio ortogonal de segunda geração, descrito aqui) no cromossomo bacteriano. Desta forma, o sinal luminescente ou fluorescente fornece uma leitura substituta em tempo real do número bacteriano.

No entanto, esses atributos não abordam um grande fator de confusão nos ensaios de infecção intracelular, efeitos fora do alvo nas células hospedeiras. Em particular, a morte da célula hospedeira limita inerentemente o crescimento intracelular e leva à identificação falsa positiva do efeito antimicrobiano. Como muitos compostos em bibliotecas de triagem são tóxicos para células eucarióticas, esses falsos positivos sobrecarregariam os verdadeiros antimicrobianos, necessitando de um grande número de ensaios de citotoxicidade de ponto final de acompanhamento para resolução.

Assim, foi de grande interesse poder avaliar a viabilidade celular eucariótica e o crescimento intracelular simultaneamente. Notavelmente, uma característica das células eucarióticas não viáveis é a perda da integridade da membrana celular. Sondas que testam a permeabilidade da membrana celular podem, portanto, ser usadas para avaliar a viabilidade celular. Anteriormente, caracterizamos a capacidade de uma série de corantes de ligação ao DNA, fluorescentes, supostamente impermeáveis à membrana celular, de acessar e corar o DNA nuclear de células mortas. ⁴ Ao ligar o DNA nuclear, esses corantes exibem um grande aumento no rendimento fluorescente quântico, resultando em aumento do sinal sobre a fluorescência da solução de fundo. Como tal, esses corantes forneceram uma leitura quantitativa da morte celular eucariótica. ⁴ Notavelmente, descobrimos que vários não eram tóxicos durante a co-incubação prolongada com macrófagos J774. Quando adicionados durante a infecção inicial, eles forneceram uma leitura fluorescente em tempo real da morte celular eucariótica que pode ser medida por um fluorímetro de microplaca ou observada microscopicamente.

Portanto, combinando o uso de um repórter bacteriano e corantes não tóxicos, impermeantes à membrana e de ligação ao DNA, fomos capazes de desenvolver um ensaio simples, não destrutivo e em tempo real para medir a carga bacteriana e a citotoxicidade das células eucarióticas simultaneamente. Este ensaio nos permitiu rastrear em formato de placa de 384 poços ~ 10.000 bioativos conhecidos, incluindo ~ 250 antimicrobianos e > 240.000 pequenas moléculas com atividade funcionalmente não caracterizada para a capacidade de inibir o crescimento intracelular de Legionella pneumophila, ao mesmo tempo em que gera dados de citotoxicidade de células eucarióticas para cada composto. ⁶ Nossa análise de antimicrobianos conhecidos contra o crescimento intracelular de Legionella foi a exploração mais abrangente desse tipo até o momento. ⁶

Com base na eficiência do nosso formato de ensaio, também exploramos posteriormente os efeitos potencialmente sinérgicos de antimicrobianos conhecidos quando usados em combinação. Um dos testes de sinergia mais comuns, o chamado ensaio quadriculado, é realizado de forma padrão avaliando os efeitos combinatórios de diluições seriais duplas de dois ou mais antimicrobianos. ¹⁰ Nesses ensaios, a sinergia é definida pela observação de maior efeito quando dois ou mais antimicrobianos são aplicados juntos do que a soma dos efeitos de cada um aplicado separadamente. É importante notar que, até agora, apenas testes de sinergia focados e seletivos foram realizados contra Legionella pneumophila intracelular devido ao grande esforço envolvido nos ensaios de endpoint tradicionais multiplicados pelas permutações combinatórias necessárias.

Para facilitar o teste de sinergia, usamos nosso ensaio de crescimento intracelular/citotoxicidade eucariótica em tempo real em combinação com a tecnologia de dispensação digital automatizada⁶. Essa automação nos permitiu dispensar diluições em série de compostos dissolvidos em DMSO ou solução aquosa isoladamente ou em combinação no formato de 384 poços. ¹¹ Além disso, essa tecnologia robusta de manuseio de líquidos nos permitiu realizar facilmente combinações de diluição de raiz quadrada de dois (em vez da padrão, resolução mais baixa, duplicação) para alcançar níveis mais altos de especificidade em nossa análise de sinergia quadridimensional e quadriculada. Esta resolução foi especialmente valiosa para abordar as preocupações no campo da sinergia sobre a reprodutibilidade ao usar a série de diluição dupla¹². Por fim, nosso ensaio foi quantitativo e, portanto, também mediu gradações de inibição. Como resultado, o ensaio capturou a totalidade das informações inibitórias, expressas em isobologramas de isocontorno nos quais os isocontornos conectam concentrações combinatórias com níveis semelhantes de inibição do crescimento. ⁶ Essa estratégia de plotagem permitiu a visualização de curvas combinatórias de dose-resposta. Para ilustrar nossa metodologia, descrevemos nosso protocolo para a realização desses ensaios e mostramos resultados representativos.

Protocolo

1. Ensaio em Tempo Real de Crescimento Intracelular e Citotoxicidade em Células Eucarióticas

1. Preparação das Células Hospedeiras (Células J774A.1)
   1. Cultura J774A.1 Mus musculus células semelhantes a macrófagos em suspensão em RPMI 1640 com 9% de soro de bezerro suplementado com ferro. Passagem inicial em frascos de cultura de tecidos. Após as células atingirem confluência em um frasco de 75 cm² frasco de cultura de tecidos com 15 ml de meio, dividido por raspagem e diluição para 65 ml com o mesmo tipo de meio, dos quais 15 ml são retornados ao frasco de cultura de tecidos e 50 ml são transferidos para um frasco agitador bacteriano de 250 ml.
   2. Para ampliação, cultive em suspensão em frascos bacteriológicos de 250 ml e/ou 1.000 ml, preenchidos com meio de cultura de tecidos até um quinto do volume. Areje ajustando a velocidade de rotação para aproximadamente 120 rotações por minuto. Para crescimento consistente, incube exatamente a 5% de CO₂ e 37 °C.
   3. Colete as células quando atingirem densidade na faixa de 2,5 x 10⁶ células/ml para 5 x 10⁶ células/ml. Certifique-se de que a porcentagem de células mortas (mais facilmente avaliada por coloração com azul de tripano) não exceda 25%, pois células mortas aumentarão o ruído de fundo nos ensaios de citotoxicidade.
   4. Plaque com microplacas brancas, tratadas para cultura de tecidos, de 384 poços, a 5 x 10⁴ células J774A.1 em 30 µl meio de cultura de tecidos por poço. Incubar as microplacas durante a noite para atingir 90% de confluência no dia do experimento.
2. Preparando Luminescência ou Fluorescência Legionella pneumophila
   1. Passagem L. pneumophila (Lp02::flaA::lux⁸) bactérias em meio apropriado, ou seja, meio buffered charcoal yeast extract (BCYE). Se estiver utilizando uma linhagem timidina-auxotrófica, suplemente o meio com 100 µg/ml tiridina. Prepare patches de bactérias para experimentos espalhando os organismos abundantemente em uma nova placa de BCYE e incubando por um dia (se provenientes de uma passagem anterior em placa) ou dois a três dias (se provenientes de estoque congelado) para obter crescimento confluente.
      1. Prepare placas BCYE dissolvendo 10 g de extrato de levedura, 10 g de N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfônico, 0,35 g K₂HPO₄e 1 g de α-cetoglutarato monobásico de potássio em 950 ml de água desionizada. Ajuste o pH para 6,9 com hidróxido de potássio (≥2,5 ml de solução 11,9 molar).
      2. Adicione 15 g de ágar e 2 g de carvão ativado; complete o volume para 1 L. Adicione uma barra de agitação magnética e autoclave. Resfrie o meio até 55 °C e adicione soluções filtradas e esterilizadas contendo 0,4 g de L-cisteína e 0,42 g de citrato férrico de amônio dissolvidos em água desionizada. Utilize uma placa de agitação magnética para misturar antes de verter as placas de Petri.
      3. Para testes de L. pneumophila crescimento em meio de cultura axênico, prepare o caldo AYE (ACES-extrato de levedura) combinando todos os reagentes químicos utilizados para o BCYE, exceto carvão e ágar. Estérilize por filtração e use imediatamente ou congele para experimentos posteriores.
   2. Resuspenda os organismos no mesmo meio de cultura de tecidos utilizado para as células J774A.1 com 100 µg/ml suplementação com timidina conforme apropriado.
3. Infecção por Macrófagos
   1. Adicione os compostos-teste de interesse (compostos de triagem, e controles positivo e negativo para inibição do crescimento bacteriano e lise de células eucarióticas). Preferencialmente, dissolva as soluções estoque em concentração ≥500x em DMSO (dimetilsulfóxido) ou em solução aquosa para permitir diluição suficiente do veículo.
      1. Embora as soluções estoque possam ser armazenadas congeladas, evite ciclos de congelamento-descongelamento para compostos lábeis e antimicrobianos.
   2. Dilua as bactérias luminescentes até a concentração-alvo de 2,5 x 10⁶ UFU (unidade formadora de colônia)/m e bactérias marcadas com repórter fluorescente para 1,0 x 10⁷ UFC/ml em meio de cultura de tecidos e adicione corante não tóxico, impermeável à membrana e ligante ao ácido nucleico na concentração final de 2,5x para o ensaio.
   3. Adicione 20 µl da mistura para cada poço de cultura de J774A.1, volume final do ensaio 50 µl, concentração bacteriana final 1 x 10⁶ UFC/ml (repetidor do operão lux) ou 4 x 10¹⁰⁶ UFC/ml (repórter de proteína fluorescente).
   4. Incubar a 37 °C por 1 a 3 dias em 5% CO₂ a 100% de umidade relativa para prevenir efeitos de borda por evaporação.
4. Leitura do ensaio
   1. Leia o crescimento bacteriano e a toxicidade em células eucarióticas em um luminômetro e fluorímetro de microplacas, conforme apropriado para os repórteres utilizados.
      1. Para evitar efeitos de borda associados à temperatura, equilibre termicamente as microplacas antes da leitura de luminiscência, colocando-as em uma única camada sobre uma bancada de laboratório com as tampas entreabertas por aproximadamente 20 min (ou em uma câmara de segurança biológica sem as tampas por aproximadamente 10 min).
   2. Retorne as microplacas ao incubador se for desejado um registro em tempo real em pontos temporais posteriores.

2. Análise de Dados

1. Normalize os dados em relação aos controles positivo e negativo para calcular a porcentagem ou a inibição em relação ao crescimento bacteriano intracelular e a citotoxicidade percentual para células eucarióticas.
2. Para avaliar a robustez do ensaio, calcule a separação estatística entre os controles positivo e negativo tanto para inibição do crescimento bacteriano quanto para citotoxicidade, utilizando a análise do fator Z (Z'), em que Z' = 1 - 3(σ_p + σ_n)/|µ_p + µ_n|. Nesta equação, σ_p e σ_n são os desvios-padrão das poças dos controles positivo e negativo, respectivamente; µ_p e µ_n são os valores médios das poças dos controles positivo e negativo, respectivamente.
   1. Para ensaios de triagem em alta vazão, calcule os escores z padrão (ou outras medidas estatísticas quantitativas alternativas) para avaliar os efeitos dos compostos-teste de interesse. Alternativamente, calcule uma redução em relação ao controle ou uma redução logarítmica em relação ao controle como uma medida potencialmente mais fisiologicamente relevante da magnitude do efeito em bactérias que se replicam geometricamente.

3. Testes de resposta à dose unidimensionais e multidimensionais (ou seja, sinergia) e interpretação dos dados

1. Prepare macrófagos e bactérias conforme descrito na seção 1 do protocolo.
2. Imediatamente antes da infecção ou incubação axênica, adicione antimicrobianos de interesse experimental em série de diluições sucessivas e dobradas, com o objetivo de abranger, na extremidade superior, uma concentração que elimine completamente o crescimento (ou seja, a concentração inibitória mínima ou MIC) e, na extremidade inferior, uma concentração que não apresenta atividade aparente.
3. Utilize um sistema automatizado de manipulação líquida para facilitar a configuração de testes de resposta a dose única e de sinergia combinatória mediante a adição direta e automatizada de diluições de antimicrobianos de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Considere o uso de diluições submúltiplas, por exemplo, série de diluições em fator fixo e réplicas de ensaio para aumentar a precisão e reprodutibilidade dos dados.
5. Para infecção de macrófagos, dilua as bactérias luminiscentes até a concentração-alvo de 2,5 x 10⁶ UF (unidade formadora de colônia)/ml em meio de cultura de tecidos. Adicione 20 µl da mistura para cada poço de cultura de J774A.1, volume final do ensaio 50 µl, concentração bacteriana final 1 x 10⁶ UFC/ml; e incubar a 37 °C em 5% CO₂ a 100% de umidade relativa.
   1. Para o teste de crescimento axênico, dilua as bactérias luminescentes até uma concentração final de 1 x 10⁶ UFC/ml em meio AYE, adicione 50 µl a cada poço de uma placa de 384 poços e incubar a 37 °C em 5% CO₂ a 100% de umidade relativa.
6. Calcule o índice de concentração inibitória fracionada para combinações antimicrobianas que inibem o crescimento bacteriano. Para cada fármaco na combinação (a, b, . . n) que resulta em inibição completa ou >99% de inibição do crescimento bacteriano, calcule a concentração inibitória fracionada individual (FIC)_{a, b, . . n.}) da seguinte forma: FIC_a = a concentração do composto "a" dividida pela concentração inibitória mínima de "a" por si só._. Usando a mesma fórmula, calcule o FIC_b, etc. Em seguida, calcule o índice FIC combinatório ou  FIC = FIC_a + CFI_b + . . .FIC_n para cada combinação inibitória.
   1. Utilize o índice combinatório que mais se desvia de 1,0 para avaliar a sinergia. Considere um valor de corte de ≤0,5 como uma indicação conservadora de um efeito sinérgico e de ≥4, de um efeito antagônico.¹²
   2. Trace isobologramas, isobologramas de contorno isolinhas e/ou isobologramas de superfície isossuperfície⁶ como representações gráficas alternativas de efeitos combinatórios.

Resultados

Ensaio de crescimento intracelular em microplaca

Figura 1 esquematiza as etapas do ensaio. As etapas automatizadas mostradas podem ser realizadas manualmente. No entanto, o rendimento é grandemente facilitado com o uso de sistemas de manipulação de líquidos.

Figura 2 mostra resultados representativos de um ensaio em microplaca de 384 p...

Discussão

Descrevemos ensaios em tempo real para detecção simultânea de crescimento bacteriano intracelular e citotoxicidade da célula hospedeira. Existem várias etapas críticas no protocolo. Primeiro, para um desempenho robusto do ensaio, deve haver separação espectral suficiente entre as leituras bacterianas e de citotoxicidade. Essa separação é intrínseca para combinações de repórteres de operon de luciferase e corantes fluorescentes de ligação ao DNA. No entanto, com base em nossa experiência (Tabela 1-3,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células J774A.1	American Type Culture Collection	TIB-67	Célula hospedeira
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Extrato de levedura, ultrafiltrado	Becton-Dickinson / Difco	210929	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado; graus mais baixos podem causar crescimento prejudicado e / ou alterar a sensibilidade de Legionella a inibidores de crescimento
Ácido alfa-cetoglutárico, sal monopotássico	Sigma-Aldrich	K2000	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P5280	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Fosfato de potássio, dibásico	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
L-cisteína	Sigma-Aldrich	C-7755	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio
de extrato de levedura tamponadoCitrato de ferro amônio (III)	Sigma-Aldrich	F5879	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado; pirofosfato férrico pode ser usado, mas é mais difícil pesar com precisão
Solução de hidróxido de potássio, concentrada	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
deonizada	N / A	N / A	Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado
Timidina (grau de cultura de tecidos)	Sigma-Aldrich	T1895	Para suplementar tanto o RPMI 1640 quanto o extrato de levedura tamponado ágar / meio - a timidina de grau inferior pode ser usada para o último, mas pode causar crescimento celular prejudicado e/ou morte celular em RPMI 1640
RPMI 1640, formulação padrão	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Para o crescimento de células J774A.1 antes do plaqueamento; inclui 2 mM L-glutamina
RPMI 1640 sem vermelho de fenol	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Para o revestimento de células J774A.1 em placas de 384 poços (não adequado para crescimento antes do revestimento); também falta L-glutamina - suplemento para 2 mM antes
do uso de L-glutamina, 200 mM em 0,85% de NaCl (grau de cultura de tecidos)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Para suplementar RPMI 1640 sem L-glutamina, a 2 mM de concentração final Soro
de bezerro suplementado com ferro	Gemini Bioproducts	100-510	Para suplementar RPMI 1640, a 9,1% de concentração final
Solução de Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154	Para coloração para determinação da morte celular J774A.1 durante a contagem da densidade celular
SYTOX Green, solução de 5 mM em DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Para coloração para determinação da morte celular J774A.1 por leitura de fluorescência ou microscopia de epifluorescência (em conjunto com bactérias fluorescentes vermelho-alaranjadas ou vermelhas distantes). Use na concentração final de 125 nM.
Incubadora de cultura de células	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Para incubação de células J774A.1 (antes e depois da infecção); também pode ser usado para incubação de bactérias, ou uma incubadora de atmosfera padrão pode ser usada em seu lugar)
Agitador orbital	BellCo Glass	7744-01010	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção; cabe dentro da incubadora de cultura de células; inclui base agitadora 7744-01000 e bandeja 7740-01010 (estes também estão disponíveis separadamente)
Frascos agitadores (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Grampos agitadores para frascos (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Frascos agitados (1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Grampos agitadores para frascos (1.000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção
Tampas de espuma de esponja para frascos (250 ml-1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção; reduz o risco de contaminação em relação às tampas metálicas padrão
Bomba peristáltica multicanal programável MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Para dispensar células J774A.1, meio e suspensão bacteriana contendo fluoróforos para um grande número de pratos de 384 poços
Coletor de furo padrão Combi	Thermo Fisher Scientific	24072670	Volume de pré-distribuição padrão de 20 μ l é insuficiente para compensar o assentamento — aumentar para 80 μ l
Branco 384 pratos de poço tratados para cultura de tecidos	Corning	3570	Para leitura de luminescência e fluorescência; Catálogo Greiner # 781080 também testado com sucesso
DMSO (grau de cultura de tecidos, em ampolas seladas)	Sigma-Aldrich	D2650	Para dissolver o controle positivo e testar compostos
Azitromicina	Sigma-Aldrich	PHR1088	positivo
de antibióticos Saponina (da casca de Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Pipetador
	multicanal de controle positivo de citoxicidadeThermo Fisher Scientific	Finnpipette	Para transferência de quantidades fixas de compostos de controle positivo; pipetador deve ter dispensação digital com detentores para permitir a distribuição repetitiva de volume fixo
Robô de transferência de pinos Epson	Epson/ICCB-L	(equipamento personalizado)	Para transferência de quantidades fixas de compostos de teste de matrizes de bibliotecas
Sistema de dosagem digital D300	Hewlett-Packard via Tecan	D300	Para transferência de quantidades variáveis de compostos de teste variando de 11 picolitros a 10 µ l
Cartuchos T8+ para sistema de dosagem digital D300	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	Para distribuição de compostos de teste
Microscópio de epifluorescência com câmera digital conectada ao computador	Nikon	Ti	Para imagens de células vivas; qualquer microscópio fluorescente padrão pode substituir, com contraste de fase ou óptica DIC, capaz de imagens de fluorescência verde (fluoresceína), vermelho-alaranjado a vermelho (Texas Red) e vermelho distante (Cy5), com óleo 100X objetiva para
placas de cultura de tecidos com fundo de vidro	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Para imagens de células vivas. Pratos como o MatTek permitem a visualização microscópica com ampliação de 600X ou 1.000X através do uso de um microscópio epifluorescente ou confocal invertido. Esses pratos específicos têm 3,5 cm de diâmetro nominal, 3,3 cm de diâmetro interno, com lamínulas de 20 mm de diâmetro #1,5 de espessura inseridas no fundo.
Photoshop CS6	Adobe		, Adobe Photoshop ou programas semelhantes podem ser usados para pseudocolorir e mesclar imagens microscópicas e fluorescentes de luz.
Mathematica 10	Wolfam		Para geração de isobologramas de isocontorno bidimensionais e isobologramas tridimensionais de superfície.

Água Controle da mais alta resolução ,