Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus

Summary

Um protocolo para investigar o comportamento de acasalamento do nematoide da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é apresentado. As características comportamentais de B. xylophilus são descritas no processo de acasalamento.

Abstract

Um método para observar e quantificar o comportamento de acasalamento do nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, foi criada sob microscópio estereoscópico. Para melhorar a eficiência de acoplamento de B. Xylophilus e aumentar as chances de observação de acasalamento, os adultos virgens foram cultivadas e utilizadas para a investigação. Os ovos foram obtidas, mantendo os nemátodos em água e permitindo que as fêmeas a pôr ovos durante 10 min. Os juvenis de segundo estádio (J2) foram sincronizadas por incubação dos ovos durante 24 h a 25 ° C no escuro, e o início J4 foram obtidos por cultura do J2 com bolor cinzento, Botrytis cinerea, por outro 52 h. Neste ponto do tempo, a maioria dos nematóides J4 podia ser claramente distinguida como sendo do sexo masculino ou feminino com sua morfologia genital. O macho e fêmea J4 foram recolhidas e cultivadas separadamente em dois pratos de Petri diferentes durante 24 h para obter nemátodos adultos virgens. Um macho e uma fêmea virgem virgem foram emparelhados em uma gota de watER no poço de uma lâmina côncava. O comportamento de acasalamento foi filmado com um gravador de vídeo sob microscópio estereoscópico. todo o período do processo de acasalamento foi de 82,8 ± 3,91 min (média ± SE) e pode ser dividido em 4 fases distintas: pesquisa, contactando, copulando, e remanescentes. Os médios minutos de duração foram 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, respectivamente. Onze sub-comportamentos foram descritos: cruzeiro, aproximando-se, encontrando, tocando, hooping, localizar, prender, ejacular, separar, quietude, e roaming. Curiosamente, óbvia a concorrência intra-sexual foi observada quando uma fêmea foi agrupada com 3 machos ou um macho com 3 fêmeas. Este protocolo é útil e valioso, não só na investigação do comportamento de acasalamento de B. xylophilus, mas também em atuar como referência para estudos etológicas dos outros nematóides.

Introduction

O nematóide da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner e Buhrer) Nickle, é uma das espécies invasoras mais destrutivas, causando o murchamento e eventual morte dos pinheiros. Acredita-se que esse nematóide patogênico seja nativo dos EUA, mas foi transportado para vários países, incluindo China, Japão, Coréia do Sul e Portugal. Recentemente, também foi relatado na Espanha, matando milhões de pinheiros com enormes perdas econômicas e ameaçando a produção florestal e a estabilidade ecológica^1-5.

Uma vez que um pinheiro hospedeiro é infectado por nematóides da madeira de pinheiro, milhares de milhões de desc....

Protocol

1. Aquisição de Virgin Adulto Nematóides

1. Pinewood isolado nematóide e condições de cultura
   NOTA: O B. xylophilus isolar Nxy61 foi originalmente extraído de uma massoniana Pinus doente na área de Ningbo, província de Zhejiang, na China.
   1. Prepare Potato Dextrose Agar (PDA, consulte a Tabela de Materiais) placas para o cultivo de Botrytis cinerea.
   2. Para inoculação, perfurar um pedaço de tapete de fungos com diâmetro de 10 mm a partir de um tapete de B. cinerea e colocá-lo no meio de uma nova placa de PDA. Cultura de B. cinerea por 5 d, a 25 ° C no e....

Results

A taxa de sucesso de acasalamento (R) de adultos virgem foi de 86,67%, em média, o que foi significativamente mais elevado do que o dos adultos seleccionadas aleatoriamente: 13,33 ± 4,65% (M = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Figura 2). Esta descoberta sugere que é mais fácil de observar o comportamento de acasalamento de B. xylophilus com adultos virgens do que com adultos selecionados aleatoriamente.

Discussion

Os testes comportamentais são um aspecto fundamental da ecologia química, neurobiologia, biologia molecular e genética. Nematóides e, em particular C. elegans, são usados extensivamente para estudos nessas áreas. O comportamento de acasalamento de C. elegans foi investigada anteriormente ^10-11. No entanto, B. xylophilus é gonochoristic e diferente dos hermafroditas C. elegans, e seu processo de acoplamento tem diferentes características comportamentais ^9. Recente.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus isolado Nxy61			Extraído de Pinus massoniana na área de Ningbo da China
		mofo cinza	Obtido da Academia Florestal da China
Baermann funil	Sengong
	Sengong
pipeta	Sengong
estéril dd H2O			Esterilizado por alta pressão de vapor a 121 & C por 30 min.
Placas de Petri	Sengong
PDA meio	Huankai Bio.	021050
incubadora	Sengong
Fluxo laminar Sengong
capilar de vidro	Sengong
Estereoscópio	Leica	LED5000 RL
microscópio estéreo invertido	Zeiss	A1
lâminas côncavas	Sengong