Method Article

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

DOI:

10.3791/54854

⸱

January 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para nocautear um gene de interesse envolvido na conjugação de plasmídeos e, posteriormente, analisar o impacto de sua ausência usando ensaios de acasalamento. A função do gene é explorada para uma região específica de sua sequência usando deleção ou mutações pontuais.

Abstract

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A transferência de material genético por conjugação bacteriana é um processo que ocorre por meio de complexos formados por proteínas de transferência específicas. Em Escherichia coli, essas proteínas de transferência compõem uma maquinaria de transferência de DNA conhecida como formação de pares de acasalamento, ou complexo de transferência de DNA, que facilita a transferência conjugativa de plasmídeos. O objetivo deste artigo é fornecer um método que possa ser usado para determinar o papel de uma proteína de transferência específica que está envolvida na conjugação usando uma série de deleções e / ou mutações pontuais em combinação com ensaios de acasalamento. O gene alvo é nocauteado no plasmídeo conjugativo e é então fornecido em trans através do uso de um pequeno plasmídeo de recuperação que abriga o gene alvo. Mutações que afetam o gene alvo no plasmídeo de recuperação podem revelar informações sobre aspectos funcionais da proteína-alvo que resultam na alteração da eficiência de acasalamento das células doadoras que abrigam o gene mutado. Alterações na eficiência de acasalamento fornecem informações sobre o papel e a importância da proteína de transferência específica, ou de uma região dela, na facilitação da transferência conjugativa de DNA. O acoplamento deste ensaio de acasalamento com estudos estruturais tridimensionais detalhados fornecerá uma compreensão abrangente da função da proteína de transferência conjugativa, bem como fornecerá um meio para identificar e caracterizar regiões de interação proteína-proteína.

Introduction

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A transferência de genes e proteínas ao nível micro-organismo ao desempenha um papel central na sobrevivência e evolução bacteriana, bem como processos de infecção. A troca do ADN entre as bactérias ou entre uma bactéria e uma célula pode ser conseguido através de transformação, conjugação ou transdução de vector. Conjugação 1,2 é único em comparação com a transformação e transdução em que durante a conjugação entre as bactérias gram-negativas tais como Escherichia coli, a transferência de ADN ocorre de um modo controlado-doador no qual um sistema macromolecular complexa liga células dadoras e receptoras. A conjugação é também a maneira mais direta em que as células bacterianas interagem com as células hospedeiras para injetar genes, proteínas ou produtos químicos para sistemas host. 3 Muitas vezes, a transferência desses agentes tem efeitos notáveis sobre o anfitrião, que vão desde patogenia e carcinogênese para hospedar evolução e adaptação. Tem sido demonstrado que recombinatio conjugativon aumenta a taxa de adaptação 3 vezes em bactérias com taxas de mutação elevadas sob condições de stress ambiental. 4 Além disso, a conjugação é de longe a via mais comum, através do qual os genes de resistência a antibióticos em estirpes bacterianas são distribuídos. 5,6

Os microrganismos têm evoluído sistemas de secreção especializados para suportar a transferência de macromoléculas através das membranas celulares; existem actualmente 9 tipos de sistemas de secreção (TSSs) em bactérias gram-negativas que foram descritos: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, bem como a SEC (secreção) e Tat (de dois arginina translocação) vias. 7,8 Cada tipo de sistema de secreção é dividido em diferentes subtipos, uma necessidade devido à diversidade de proteínas e o carácter distintivo de caminhos envolvidos, em diferentes estirpes bacterianas. Por exemplo, no sistema de secreção de tipo IV (T4SS), os sistemas de Ti e facilitar o transporte CAG efector ao passo que a F-plasmídeo, R27 umnd pKM101 T4SSs facilitar a transferência de um plasmídeo conjugada. 7,9,10 uma compreensão detalhada dos mecanismos pelos quais os organismos montam os seus respectivos sistemas de secreção de proteínas a partir de seus componentes e partilham conteúdo celular com um receptor ou o seu ambiente circundante é um factor importante no desenvolvimento de estratégias que apontam para combater microrganismos patogénicos e processos de infecção celular.

Após a conjugação bacteriana identificação inicial em E. coli por Lederberg & Tatum, 11 de um grande número de plasmídeos conjugativos móveis e têm sido identificadas e caracterizadas. 12 Tais plasmídeos móveis mostrar considerável gama é de tamanho (de 1 a mais de 200 quilobases (kb)), no entanto, todos os plasmídeos móveis contêm um relaxase, que reconhece a origem de transferência (oriT) permitindo assim a transmissão do plasmídeo. Os plasmídeos conjuntivos mais genes codificam para a montagem de um T4SS funcional, bem como um tipoproteína de ligação IV. 12 Por exemplo, a 100 kb F plasmídeo de E. coli codifica todos os genes conjugadas dentro de uma transferência de 33,3 kB (tra) região. 13 Os genes na região do tra do plasmídeo codifica F todas as proteínas que facilitam a formação de pilus, Acasalamento formação de pares (MPF), a transferência de DNA e as funções de exclusão durante a transferência de plasmídeo conjugada. 10,14,15 Um corpo significativo de conhecimento está disponível para T4SSs conjugada, porém detalhado estudos estruturais das proteínas conjugadas e complexos só são mais recentemente se tornando disponíveis. 16-28

Para montar uma visão abrangente do processo conjugada, é necessário um acoplamento de estudos estruturais detalhados para mutacional análises de proteínas de transferência conjugadas. Isto pode ser conseguido através de ensaios de encaixe conjugadas. Para o plasmídeo F, cada proteína codificada dentro da região de TRA desempenha um papel na co-F mediadanjugation; por conseguinte, o nocaute / eliminação de um gene de transferência vai abolir a capacidade conjugadas das células (Figura 1). Enquanto plasmídeos celulares mais pequenas são mais conducentes para procedimentos de eliminação padrão, por plasmídeos conjugativos maiores, tais como F, nocaute de genes são mais prontamente conseguidas através de recombinação homóloga em que o gene alvo é substituída com uma transmissão de um gene de resistência a antibiótico distinta. No protocolo atual, que empregam recombinação homóloga para substituir um gene transfer de interesse com cloranfenicol acetiltransferase (CAT) na 55 kb F plasmídeo derivado pOX38-Tc; 29,30 nocaute o plasmídeo resultante, pOX38-Tc :: Δgene Cm, facilita a resistência à presença de cloranfenicol (Cm) no meio de crescimento. células dadoras que albergam pOX38-Tc :: Δgene cm são incapazes de afectar conjugativo transferência de ADN / acasalamento como observado através da utilização de um ensaio de acoplamento; a eficácia de acoplamento de uma célula doadora pOX38-Tc Δgene :: cm e uma recip normaistário vai diminuir ou, mais frequentemente, ser abolido. transferência conjugativa do plasmídeo pOX38-Tc :: Δgene cm pode ser restaurada por meio de uma pequena recuperação de plasmídeo que alberga o gene alvo de transferência. Este plasmídeo de recuperação pode ser uma que proporciona a expressão constitutiva, tal como pK184 plasmídeo (pK184-gene), 31 ou um que fornece expressão indutível enquanto que o plasmídeo alvo correctamente o gene para a localização correcta no interior da célula (citoplasma ou periplasma). Consequentemente, em ensaios de acasalamento entre este novo doador (abrigando pOX38-Tc Δgene plasmídeos :: Cm + pK184 de gene) e uma célula receptora, a eficiência de acoplamento é esperado para restaurar a quase que de um ensaio de acoplamento doador-receptor normal. Este sistema permite uma para sondar a função do gene eliminado por meio da geração de uma série de construções pK184-Gene (deleções ou mutações pontuais) e testando a capacidade de cada construção para restaurar a capacidade de acoplamento do pOX38-Tc Δgene :: Cm abrigando célula doadoras.

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Protocol

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1. Produção de construções de ADN

  1. Designing Oligómeros para recombinação homóloga do gene alvo
    1. Design um único oligómero de 55-72 pb para a frente como se segue: (a) escolher uma sequência de nucleótidos de comprimento 19-32 pb que é homóloga a uma sequência de ADN na região de 10-100 pb a montante do local de início da extremidade 5 'do gene da cloranfenicol-acetiltransferase no plasmídeo pBAD33 comercial, 32 e (b) seleccionar um nucleótido 36-54 pb de comprimento sequência homóloga a uma região de 10-150 pb a jusante do local de iniciação a 5 'do gene alvo de interesse.
      1. Junte-se "fim da sequência de nucleótidos colhidos em (b) à extremidade 5 'da 3 extremidade da sequência de nucleótidos colhidos em (a), dando assim um único oligómero 55-72 longo para a frente.
    2. Design um único oligómero de 55-72 pb reversa como segue: (a) escolher uma sequência de nucleótidos de comprimento 19-32 pb que é homóloga a uma sequência de ADN na região de 10-100 pb a jusanteda extremidade 3 'do gene da cloranfenicol no plasmídeo pBAD33 comercial, e (b) seleccionar um nucleótido 36-54 pb de comprimento sequência homóloga a uma região dentro de 10-150 pb a montante da extremidade 3' local do gene alvo de interesse .
      1. Junte-se ao "fim da sequência de nucleotídeos colhidas em (b) a 5 'a 3 fim da sequência de nucleótidos colhidas em (a) para torná-lo uma única oligômero.
      2. Copiar este oligómero para qualquer software de bioinformática disponíveis e convertê-sequência para o seu complemento inverso. Isto lhe dará um único 55-72 pb de comprimento oligômero inversa.
    3. O uso de qualquer programa de oligo-analisador disponível, verifique se os oligômeros de recombinação têm conteúdo GC entre 40-60%, temperatura de fusão baixo hairpin (T m), baixa auto e hetero-dimerização T m 's. Encomendar os primers para a síntese e expedição de qualquer empresa de biotecnologia preferido.
  2. Amplificação do Cassette CAT de pBAD33 (Cm R ) Plasmid Usando Olig�eros Projetado para o emparelhamento homóloga
    1. Crescer uma cultura durante a noite (O / N, 16-18 h) de células DH5a portadoras do plasmídeo pBAD33 em caldo estéril Lisogenia (LB) com 20 ug / ml de cloranfenicol (Cm) com agitação a 200 rpm e 37 ° C.
    2. Centrifugar 6-8 mL da cultura O / N à temperatura ambiente, 5,000 xg durante 3 min. Decantar o sobrenadante e extrai-se o plasmídeo pBAD33 a partir do sedimento utilizando um kit de plasmídeo mini-prep (Materiais Tabela) e o protocolo do fabricante.
    3. Fazer uma digestão do ADN do plasmídeo pBAD33 adicionando o seguinte num tubo estéril na ordem dada: volume adequado de água bidestilada (ddH2O) para um volume final de 50 ul, o volume de 1 ug de plasmídeo pBAD33, 5 pL de 10x de tampão de reacção de enzima, e 0,5 ul de enzima de restrição Aval (RE). Misturar suavemente por pipetagem e deixar a reacção prosseguir durante 1 h a 37 ° C. Inactivar pelo calor da reacção durante 20 minutos (min) a 80° C. Armazene as amostras a -20 ° C para não mais de 24 h para minimizar a degradação sticky-end.
    4. Prepara-se uma agarose a 1,2% gel de separação por mistura de 1,2 g de agarose com 100 mL de 1x TAE (Tris 40 mM, pH 8,5, ácido acético 20 mM; EDTA 1 mM) em tampão de um balão de Erlenmeyer de 250 mL. Calor e agitar para dissolver completamente num forno de microondas. Pare o aquecimento imediatamente quando o líquido começa a ferver e agite o frasco.
      1. Arrefece-se a agarose líquido durante 3 min, à temperatura ambiente durante a agitação, adicionar 2 mL de 10 mg / mL de brometo de etídio e agite para misturar. Verter a agarose para um tabuleiro de gel com um pente bem e permitir que ele solidificar durante 1 h a temperatura ambiente. géis armazenar a 4 ° C por até 2 dias em tampão 1 x TAE.
    5. Misturar cada RE digerir a partir de 1.2.3 com 0,2 volume de corante de carga de ADN (10? L de corante por reacção de 50 uL) por pipetagem. Carga de 5 mL de 500 ug / ml de ADN em escada o primeiro poço e toda a mistura RE Digest-corante no outro poço na umgel garose. Use 2-3 poços para carregar todo o volume de reacção para o gel.
      1. Submeter o gel mal submerso em tampão 1x TAE e operando a 45-50 V (4,5-5 V / cm) durante 65 minutos num dispositivo de electroforese em gel.
    6. Usando um armário de UV e uma lâmina de barbear estéril, rapidamente cortar a banda de 2,8 kb que corresponde à sequência de gato para fora do gel para minimizar a exposição à radiação UV de ADN. Extrai-se a DNA a partir da fatia de gel de corte usando um kit de extracção em gel (Tabela Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
      Nota: Tenha cuidado para não expor a pele diretamente sob UV e lidar com a navalha com cuidado.
    7. Amplificar a cassete de CAT a partir de 1.2.6 extraída por Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando os iniciadores concebidos em 1,1 que contêm saliências homólogas à sequência do gene para permitir a recombinação homóloga. As reacções de PCR são configurados em gelo utilizando as orientações do fabricante (Materiais Tabela) na seguinte ordem:
      1. Dentro detubo de PCR estéril, adicionar um volume apropriado de ddH2O para um volume final de 50 mL, seguida por 10 ul de tampão PCR, 1 ul de dNTPs 10 mM, 2,5 uL de 10 mM Iniciador directo, 2,5 mL de 10 mM de primer reverso , 1-25 ng de ADN molde a partir de 1.2.6 e de 0,5 mL de 100 unidades / mL de polimerase de ADN.
      2. Defina-se um controlo negativo que leva os mesmos componentes que 1.2.7.1 mas com a excepção de ADN molde. Utilizar um volume apropriado de ddH2O, em vez de ADN molde. Configurar um controlo positivo utilizando DNA e primers que têm sido comprovada para trabalhar em uma reação de PCR, tais como os fornecidos como controle positivo pelo fabricante do modelo.
      3. Misture todos os conteúdos da reacção suavemente por pipetagem.
      4. Amplificar por PCR utilizando os seguintes ajustes: desnaturação inicial de 30 segundos a 98 ° C, 30 ciclos de desnaturação durante 10 s a 98 ° C, hibridação do iniciador durante 20 s, extensão durante 20 s por quilobase de amplicão a 72 ° C e um barbatanaai extensão durante 10 minutos a 72 ° C. Armazene as amostras a -20 ºC.
    8. Confirmar o tamanho correcto de amplificação através de electroforese em gel de agarose (ver 1.2.4-1.2.5), utilizando apenas 5 uL de cada reacção. Purifica-se o fragmento amplificado por PCR utilizando um kit de purificação de PCR e o protocolo do fabricante. Loja ADN purificado a -20 ° C.
  3. O plasmídeo pK184 Recuperação do gene
    1. Conceber um iniciador directo começando a partir da sua extremidade 5 'e vai no sentido da extremidade 3', na seguinte ordem: (a) escolher 4 nucleótidos aleatórios (uma combinação de adenina, timina, guanina e citosina) para a eficiência de clivagem, ligado a (b) a enzima de restrição EcoRI (RE) sequência do local de corte (GAATTC), seguido por (c) uma sequência de nucleótidos de comprimento 21-25 pb que é homóloga com a extremidade 5 'do gene de interesse, incluindo o codão de iniciação. Se o gene alvo contém um sítio EcoRI, escolher um outro RE apropriado do pK184 local de clonagem múltipla.
    2. Design um iniciador inverso na seguinte ordem: (a) escolher 4 nucleótidos aleatórios em termos de eficiência de clivagem, seguido por (b) uma sequência HindIII local do corte (AAGCTT) seguido por (c) a 21-25 pb de comprimento complemento reverso da extremidade 3 'terminal do gene de interesse, incluindo o codão de paragem. Se o gene alvo contém um sítio de HindIII, escolher um outro RE no pK184 local de clonagem múltipla.
    3. No caso de os genes que codificam as proteínas periplasmáticas, incluem uma sequência de comando adicional entre o local RE e o codão de iniciação no iniciador de sentido directo.
    4. O uso de qualquer oligo-analisador disponível, verifique se os iniciadores têm conteúdo GC entre 40-60%, hairpin T f baixa, baixa auto e hetero-dimerização T m 's. Encomendar os primers para a síntese.
    5. Crescer uma cultura O / N de células DY330R pOX38-TC em estéril LB contendo 10 ug / ml de tetraciclina (Tc) com agitação a 32 ° C e 200 rpm. Centrifugar 6-8 mL da cultura O / N à temperatura ambiente, 5,000 xg durante 3 min. Decantar osobrenadante e extrai-se o ADN plasmídico a partir do sedimento utilizando um kit de plasmídeo mini-prep (Materiais Tabela) e o protocolo do fabricante.
    6. Amplificar o gene completo de interesse com os iniciadores de 1.3.1-1.3.5 usando pOX38-Tc como o modelo (ver 1.2.7.1-1.2.7.3).
    7. Confirmar o tamanho correcto de amplificação através de electroforese em gel de agarose (ver 1.2.4-1.2.5), utilizando apenas 5 uL de cada reacção. Purifica-se o ADN amplificado utilizando um kit de purificação de PCR e o protocolo do fabricante. Loja ADN purificado a -20 ° C.
    8. Fazer uma digestão dupla de ambos o ADN de plasmídeo pK184 disponíveis comercialmente e o gene amplificado (a partir de 1.3.7.), Por adição do seguinte a um tubo de ensaio estéril na ordem dada: volume apropriado de ddH2O para um volume final de 50 uL , um volume de ug do plasmídeo pK184, 5 uL de tampão de reacção de enzima 10x e 1 ul de cada EcoRI e HindIII.
      1. Misture delicadamente por pipetagem e deixar a reacção prosseguir durante 1 ha 37 ºC. Inactivar pelo calor a reacção durante 20 min a 80 ºC. Armazene as amostras a -20 ° C para não mais de 24 h para minimizar a degradação sticky-end.
        Nota: O tipo de nuclease de restrição usada aqui depende do local de restrição com nuclease que foi manipulado para os iniciadores em etapas 1.3.1 e 1.3.2.
      2. Como um controlo positivo, configurar digestões simples do plasmídeo pK184, preparando a mesma reacção que no 1.3.8, excepto adicionar apenas um dos ERs para um tubo de reacção. Fazer isso separadamente com ambos os REs.
    9. Executar as digestões sobre um gel de agarose a 1,2% utilizando protocolos 1.2.4-1.2.5 Extrai-se a ADN de dupla digerir fragmentos de ambos pK184 e o gene de interesse de acordo com o passo 1.2.6.
    10. Ligadura a inserção do gene no vector pK184 pela adição de componentes para um tubo estéril na seguinte ordem: 2 pL de 10x tampão de ligase de ADN de T4, num total de 100 ng de ADN composto de uma mistura 1: vector de 3: inserir (pK184: gene) razão, ddH2O até umvolume total de 20 ul e 1 ul da ligase do DNA de T4. Como um controlo negativo, definir-se uma reacção similar, usando 100 ng de vector sem o gene de inserção.
      1. Homogeneizar todos os conteúdos da reacção utilizando uma micropipeta e incubar durante 30 min a 25 ° C. Calor-inactivar a reacção de ligação durante 10 minutos a 65 ° C e, em seguida, colocar em gelo.
    11. Enquanto em gelo, adicionar 15 ul do pK184-gene reacção de ligação a partir do passo 1.3.10 a 100 ul de células competentes DH5a quimicamente em um tubo de 1,5 ml estéril. Misturar suavemente por pipetagem e incubar em gelo durante 10 min. Faça o mesmo para a amostra de controlo negativo. Para um controlo positivo, usar 20-100 ng de um plasmídeo, tal como pBAD33 e transformá-la em 50 ul de células DHα.
    12. Transferir directamente as amostras de gelo para um banho de água a 42 ° C e incubar durante 90 segundos. Isto proporciona as células de um choque de calor e permite-lhes a absorção do ADN plasmídeo.
    13. células lugar de volta no gelo para outra5 min e, em seguida, adicionar 900 mL de LB estéril Incubar a 37 ° C durante 1 hora, agitando a 125 rpm.
    14. Alíquota um volume de 100 uL de amostra a partir de cada reacção de ligação em 1.3.13 sobre uma placa de agar contendo 50 ug / ml de canamicina (km) e espalhar as células usando um espalhador estéril. A placa de controlo positivo deve ter antibióticos adequados. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Incubar a placa de cabeça para baixo, a 37 ° C durante a noite.
    15. Usando uma pipeta ou ansa estéril, colher uma única colónia distinta de células e inocular um mL estéril LB 20 com 50 ng / mL Km. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Crescer as células O / N a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
    16. Adicione 3-5 estoques de glicerol de DH5a as células transformadas através da mistura de 500 mL da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de glicerol 100% (final de 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.
    17. Também centrífuga 6-8 mL de O / N a cultura à temperatura ambiente, 5,000 xg durante 3 min. Decantar o sobrenadante e extrai-se o plasmídeo pK184 recuperação do gene a partir do sedimento utilizando um kit de plasmídeo mini-prep (Materiais Tabela) e o protocolo do fabricante.
  4. pK184 - mutantes do gene
    Nota: Os iniciadores concebidos para a deleções, inserções e / ou mutações pontuais pode ser facilmente gerada utilizando ferramentas de linha disponíveis do fabricante.
    1. Conceber cada iniciador de sentido directo, escolhendo uma sequência longa de nucleótidos 18-32 pb que é homóloga com a extremidade 5 'do gene de interesse, incluindo o codão de iniciação. iniciadores de desenho de tal modo que cada iniciador directo liga-se 30-180 pb a jusante do anterior, resultando em mutantes de deleção que faltam fragmentos peptídicos N-terminais de comprimentos adequados.
    2. Conceber um iniciador inverso, escolhendo uma sequência de nucleótidos de comprimento 18-32 pb que é homóloga com a extremidade 3 'do gene de interesse, incluindo o codão de paragem. Copie esta cartilha em umny programa de bioinformática disponíveis e converter a seqüência em seu complemento inverso. Este é o iniciador inverso.
      1. No caso de os genes que codificam as proteínas periplasmáticas, conceber o iniciador de sentido inverso que é o complemento reverso de "fim de uma sequência líder que flanqueia o 5 'a 3 fim do gene e é necessário para a localização correcta do produto de proteína no periplasma.
    3. O uso de qualquer programa de oligo-analisador disponível, verifique se os iniciadores de exclusão ter conteúdo GC entre 40-60%, temperatura de fusão baixo hairpin (T m), baixa auto e hetero-dimerização T m 's. Encomendar os primers para a síntese e expedição de qualquer empresa de biotecnologia disponível.
    4. Usando a construção pK184-gene obtido no Protocolo 1.3 como o modelo e as diretrizes em 1.2.7-1.2.8, PCR amplificar as construções de deleção com os primers desenhados em passos 1.4.1-1.4.3 para gerar produtos de amplificação Ax pK184 de gene . Loja ADN amplificado umt -20 ° C.
    5. Ligar o construto amplificado utilizando qualquer kit de mutagénese disponíveis (Tabela Materiais).
    6. Transformar cada um dos ligates Ax pK184-gene separadamente em células DH5a quimicamente competentes, utilizando um protocolo de choque térmico padrão (veja 1.3.11-1.3.13).
    7. Alíquota um volume de 100 uL de amostra a partir de cada reacção de ligação em 1.4.12 sobre uma placa de agar contendo 50 ug / mL de Km e espalhar as células usando um espalhador estéril. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Incubar a placa de cabeça para baixo, a 37 ° C durante a noite.
    8. Usando uma pipeta ou ansa estéril, colher uma única colónia distinta de células e inocular a 20 mL de mídia estéril LB com 50 mg / mL Km. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Crescer as células O / N a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
    9. Adicione 3-5 estoques de glicerol de DH5a as células transformadas através da mistura de 500 mL da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de glicerol a 100% (final 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.
    10. Centrifugar 6-8 mL da cultura O / N à temperatura ambiente, 5,000 xg durante 3 min. Decantar o sobrenadante e extrai-se o plasmídeo do gene AX pK184 construir a partir do sedimento utilizando um kit de plasmídeo mini-prep (Materiais Tabela) e o protocolo do fabricante. ADN Armazenar a -20 ° C.

2. Geração de pOX38-Tc Δgene :: Cm Cepas

  1. DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm nocautes
    1. Prepara-se uma cultura de S / N de células DY330R pOX38-TC em 10 ml de LB estéril contendo 10 ug / ml Tc. Crescer a cultura O / N a 32 ° C e 200 rpm.
    2. Fazer uma diluição da cultura D / N 1:70 em 20 ml de LB estéril fresco Crescer as células a 32 ° C até (0,4-0,6 OD 600nm) de crescimento de fase mid-log.
    3. Transferem-se 10 ml de cultura para um frasco estéril e incubar a 42 ° C durante 15 minutos a 150 rpm numa ba água que agitamº. Isto irá induzir a expressão de proteínas específicas de recombinação em DY330R.
    4. Arrefeça a cultura num banho de gelo-água durante 10 min. Preparar células electrocompetentes como se segue.
      1. Transferência das células refrigerados em tubos cônicos de pré-refrigerados e centrifugar a 4.000 g durante 7 minutos a 4 ºC. Todos os tubos e pipetas que ser utilizados nos próximos passos devem ser colocadas a 4 ° C ou sobre gelo para arrefecer.
      2. Remover o sobrenadante e suavemente ressuspensas as células em 1 mL de DDH gelada 2 O. Adicionar outros 30 mL de gelo frio ddH 2 O.
      3. Centrifugar as células (4000 xg, 7 min, 4 ° C), Descartar o sobrenadante e suavemente ressuspensas as células em 1 mL de DDH gelada 2 O.
      4. Transferir as células ressuspensas em pré-refrigerada tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 15000 xg durante 1 min a 4 ºC.
      5. Suavemente ressuspensas o sedimento em 200 ul de DDH gelada 2 O e alíquota em volumes de 50 ul. Electrocompetecélulas NT pode ser armazenado a -80 ° C
    5. Adicionar 300 ng da cassete CAT amplificado de 1,2 em 50 mL de células DY330R pOX38-TC electrocompetentes, enquanto a mistura em gelo, delicadamente por pipetagem cima e para baixo. Repita este passo usando plasmídeo pBAD33 não modificada como um controlo positivo.
    6. Transferir as células para uma cuvete de electroporação de pré-arrefecida (-20 ° C) de 1 mm. Electroporate as células em 1,8 kV com uma constante de tempo de 5,5 ms, utilizando um electroporador. Imediatamente após a aplicação do impulso, diluir as células com 1 ml de meios SOC e transferir para um tubo de microcentrífuga novo. Incubar as células a 32 ° C durante 2 h.
    7. Alíquota de 100 uL de cada amostra em placas de agar contendo 10 ug / ml Tc e 20 ug / ml de CM e espalhadas usando um espalhador estéril. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Incubar a placa de cabeça para baixo a 32 ° C durante a noite para seleccionar os recombinantes bem sucedidos. A cassete CAT introduzido na célula vai sofrer re homólogacombinação com o gene de interesse e criar o DY330R pOX38-Tc :: Δgene cm (Rif R, R Tc, Cm R) do clone.
      Nota: É importante a crescer células DY330R a 32 ° C, com a excepção dos 15 minutos de indução a 42 ° C do Passo 2.1.3 antes da geração de células electrocompetentes, como crescimento prolongado a temperaturas elevadas, corre o risco de morte celular devido à produção de produtos tóxicos do p L operon responsável por funções de recombinação em DY330R. 33,34
    8. Prepara-se uma O / N de DY330R pOX38-Tc :: Δgene células cm por colheita de uma única colónia distinta de células com uma pipeta ou ansa estéril, e inoculando um meio de 20 ml estéril LB com 10 ug / ml Tc, e 20 ug / mL Cm. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Crescer as células O / N a 32 ° C com agitação a 200 rpm.
    9. Adicione 3-5 estoques de glicerol a partir de O / N por mistura de 500 ul da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de GL 100%ycerol (final de 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.
    10. Centrifugar 6-8 mL da cultura O / N à temperatura ambiente, 5,000 xg durante 3 min. Decantar o sobrenadante e extrair o pOX38-Tc Δgene :: Cm construir a partir do sedimento utilizando um kit plasmídeo mini-prep (Materials Table) e protocolo do fabricante; armazenar ADN purificado a -20 ° C.
    11. Realizar um ensaio de acasalamento por conjugação utilizando XK1200 células como o destinatário para confirmar a interrupção da conjugação por nocaute de genes, conforme o protocolo 3.1.
  2. DY330R pOX38-Tc :: Δgene Cm + pK184-gene
    1. Transformar células DY330R pOX38-Tc :: Δgene Cm electrocompetentes com 300 ng do constructo pK184-gene através de electroporação como por passos 2.1.4-2.1.7. Todos os meios selectivos deve conter 20 ug / mL de Cm e 50 ug / mL de Km. Incubar a 32 ° C. O plasmídeo de recuperação nas células electroporadas irá agora restaurar a função do gene eliminado na DY330R pOX38-Tc Δgene :: células cm.
    2. Prepara-se uma O / N de DY330R pOX38-Tc :: Δgene células recombinantes Cm + pK184-gene por colheita de uma única colónia distinta das células com uma pipeta ou ansa estéril, e inoculando um meio de 20 ml estéril LB com 20 ug / ml Cm e 50 ug / mL de Km. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Crescer as células O / N a 32 ° C com agitação a 200 rpm.
    3. Adicione 3-5 estoques de glicerol a partir de O / N por mistura de 500 ul da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de glicerol 100% (final de 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.
    4. Também executam o protocolo 3.1 para gerar XK1200 pOX38-Tc :: Δgene Cm células recombinantes.
  3. XK1200 pOX38-Tc :: Δgene Cm + pK184-gene e mutantes
    1. Prepare células electrocompetentes XK1200 pOX38-Tc Δgene :: cm (a partir da etapa 2.2.4).
    2. Separadamente electroporate 300 ng do pK184-gene ou genes-pK184 plasmídeos mutantes em 50 mL de ELEctrocompetent XK1200 pOX38-Tc Δgene :: células Cm como por passos 2.1.4-2.1.7. Todos os meios selectivos deve conter 10 ug / ml de ácido nalidíxico (Nal), 20 ug / ml de CM, e 50 ug / mL de Km e colocado numa estufa a 37 ° C.
    3. Prepara-se uma O / N de XK1200 pOX38-Tc Δgene :: células recombinantes Cm + pK184-gene por colheita de uma única colónia distinta das células com uma pipeta ou ansa estéril, e inoculando um meio de 20 ml estéril LB com Nal, 20 ug / mL cm e 50 ug / mL de Km. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Crescer as células O / N a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
    4. Adicione 3-5 estoques de glicerol a partir de O / N por mistura de 500 ul da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de glicerol 100% (final de 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.

3. conjuntivos acasalamento Ensaios

  1. Conjugada Acasalamento para gerar XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm Cells
    1. Prepare a 20 mL estéril LB O / N cultura de DY330R pOX38-Tc Δgene :: células Cm + pK184 de gene usando uma pipeta ou ansa estéril para inocular um mL estéril LB 20 contendo 20 mg / mL cm e 50 mcg / mL Km com um estoque de glicerol ou colónia única em um placa de agar. Crescer a 32 ° C com agitação a 200 rpm. Prepara-se o mesmo para XK1200 células em 20 ml de LB estéril com 10 ug / mL de Nal, crescendo a 37 ° C.
    2. Fazer diluições 1:70 de cada cultura separadamente em 2 ml de LB estéril com as mesmas concentrações de antibióticos; adicionar glucose para uma concentração final de 100 mM a todas as células do dador. Crescer as células até à fase mid-log (DO600 0,5-0,7) a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
    3. Centrífuga (4000 xg durante 5 min a 4 ° C) para sedimentar as células, descartar o sobrenadante, lavar uma vez com LB frio estéril para remover os antibióticos, e ressuspender as células em 2 ml de LB estéril frio
    4. Alíquota de 100 uL de cada cultura em 800 mL de meio LB estéril e permitir-lhes para acasalar a 32 ° C durante 1 h sem agitação.
    5. Vortex as células durante 30 s para perturbar os pares de acasalamento e colocá-los em gelo durante 10 min, para evitar mais acasalamento.
    6. Alíquota de 100 uL da mistura de células para uma placa de agar contendo 10 ug / mL de Nal e 20 ug / mL de Cm para seleccionar células XK1200 pOX38-Tc Δgene :: cm. Espalhe as células usando um espalhador estéril. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Incubou-se a placa de O / N a 37 ° C, de cabeça para baixo.
    7. Colher uma única colónia do gene novo XK1200 pOX38-Tc Δ :: Cm estirpe knockout utilizando uma pipeta estéril ou loop e crescer em LB estéril com 20 ng / mL Cm, O / N em 37 ° C com agitação a 200 rpm. Adicione 3-5 estoques de glicerol a partir de O / N por mistura de 500 ul da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de glicerol 100% (final de 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.
      Nota: As células resultantes são agora capazes de ser competentes para a transformação com as construções pK184-gene (protocolos 1.3 e 1.4) para assessing do gene e dos seus mutantes na capacidade de recuperar transferência conjugativa no protocolo 3.2.
  2. Conjugada Acasalamento Ensaio de XK1200 dadores aos receptores MC4100
    1. Prepara-se uma O / N de cultura XK1200 pOX38-Tc :: Δgene Cm + pK184-gene células em 20 mL de LB estéril com 20 ug / ml de CM, 50 ug / mL de Km e MC4100 células em 5 mL de LB com 50 ug / mL de estreptomicina (Sm) utilizando as células de um stock de glicerol ou de colónias únicas sobre uma placa de agar e estéril pipeta ou loop. Crescer culturas em 37 ° C com agitação 200 rpm.
    2. Fazer diluições 1:70 de cada cultura D / N separadamente em 2 ml de LB estéril com os mesmos antibióticos. Adicionar glicose até uma concentração final de 100 mM a todas as células do dador. Crescer as células até à fase mid-log (DO600 0,5-0,7) a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
    3. Centrífuga (4000 xg durante 5 min a 4 ° C) para sedimentar as células, descartar o sobrenadante, lavar uma vez com LB frio estéril para remover antibiotiques, e Ressuspender as células em 2 mL LB. estéril frio
    4. Em duplicado, alíquota de 100 uL de cada cultura em 800 mL de meio LB estéril e permitir-lhes para acasalar a 37 ° C durante 1 h sem agitação.
    5. Agitar as células durante 30 s para perturbar os pares de acasalamento e colocá-los em gelo durante 10 min para evitar o agravamento do acasalamento.
    6. Usando as culturas mid-log a partir do passo 3.2.2 e fresco LB estéril, preparar a 6 diluições em série de células dadoras e receptoras a partir de 10 -2 a 10 -7.
    7. Em cada uma das duas metades de uma placa de agar contendo 10 ug / mL de Nal, 20 ug / mL de Cm e 50 ug / ml de km, mancha alíquotas de 10 ul de cada diluição de XK1200 células do dador, conforme mostrado na Figura 2. Repetir para as diluições das células receptoras MC4100 em placas de agar contendo 50 ug / mL de Sm. Incubar as placas de O / N a 37 ° C.
    8. Usando a mistura de vórtice do passo 3.2.5 e fresco LB estéril, prepare-se 6 diluições (10 -2 a 10 -7 ) Dos transconjugantes. Escolher para o transconjugante células MC4100 pOX38-Tc :: Δgene cm por mancha alíquotas de 10 ul de cada diluição de cada metade em placas de agar contendo 50 ug / ml de Sm e 20 ug / ml de CM, como na Figura 2. Repita o procedimento para ambas as misturas duplicados. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Incubar as placas de O / N a 37 ° C.
    9. Determinar a eficiência de acoplamento de cada construção, como descrito no protocolo 3.3.
    10. Repetir este protocolo para todos os plasmídeos de recuperação para avaliar o efeito de uma mutação particular, sobre a eficiência da conjugação.
  3. O cálculo da eficiência de acoplamento
    1. Contar o número de colónias a partir da mesma mancha de diluição para cada dador, receptor e as células transconjugante em suas respectivas placas.
    2. Contagem das colónias receptores para testar qualquer tendência que possa resultar de ter um maior número de transconjugantes que os receptores em que dada diluição.
    3. Calculate a eficiência de acoplamento como o número de colónias transconjugante dividido pelo número de colónias de doadores. Multiplique por 100 para obter valor de eficiência por 100 células doadoras.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O processo de conjugação bacteriana F-driven plasmídeo é um processo coordenado que envolve proteínas de transferência dentro da região do tra de o F-plasmídeo que monta um T4SS para facilitar a síntese de pilus e transferência de ADN conjugativo. A proteína TRAF (Registo de GenBank # BAA97961; UniProt ID P14497) é necessária para a formação de F-pilus conjugativo. 10,14,35 - 37 A proteína contém um domínio tioredoxina-como C-terminal, apesar de ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

processo de conjugação bacteriana fornece um meio pelo qual as bactérias podem espalhar genes proporcionando uma vantagem evolutiva para o crescimento em ambientes difíceis, tais como a propagação de marcadores de resistência a antibióticos. Porque muitos dos plasmídeos conjugativos são tão grandes, 12 estudos funcionais sobre as proteínas envolvidas na montagem do aparelho de transferência através de mutação de genes alvo no próprio plasmídeo conjugativo são pesadas. Os protocolos aqui descritos proporcionam...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada por uma Grant Descoberta da Ciência e Engenharia Conselho Natural do Canadá (NSERC).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kit de Mini-Preparação de Plasmídeo GeneJetFisher ScientificK0503
Kit de Extração de Gel GeneJetFisher ScientificK0692
Kit de Purificação de PCR GeneJetFisher ScientificK0702
Q5 Kit de Mutagênese Dirigida ao LocalNew England BiolabsE0554S
Escada de DNA de Amplo AlcanceNew England BiolabsN0303A
Placas de PetriFisher ScientificFB0875713
EletroporadorEppendorf4309000027
Cubetas de EletroporaçãoFisher ScientificFB101têm uma folga de 1 mm.
Enzimas
AvaINew England BiolabsR0152S
EcoRINew England BiolabsR0101S
HindIIINew England BiolabsR0104L
NdeINew England BiolabsR0111S
Phusion DNA PolimeraseNew England BiolabsM0530L
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
DpnINew England BiolabsR0176S
AntibióticosConcentrações Finais
Cloranfenicol (Cm)Fisher ScientificBP904-10020 µ g/mL
de canamicina (Km)BioBasic Inc.DB028650 µ g/mL
de ácido nalidíxico (Nal)Sigma-AldrichN8878-25G10 µ g/mL
Rifampicina (Rif)Calbiochem55730320 µ g/mL
Tetraciclina (Tc)Fisher ScientificBP912-10010 µ g/mL
Estreptomicina (Sm)Fisher ScientificBP910-5050 µ g/mL
As cubetas

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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