Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

A transferência de genes e proteínas ao nível micro-organismo ao desempenha um papel central na sobrevivência e evolução bacteriana, bem como processos de infecção. A troca do ADN entre as bactérias ou entre uma bactéria e uma célula pode ser conseguido através de transformação, conjugação ou transdução de vector. Conjugação ^1,2 é único em comparação com a transformação e transdução em que durante a conjugação entre as bactérias gram-negativas tais como Escherichia coli, a transferência de ADN ocorre de um modo controlado-doador no qual um sistema macromolecular complexa liga células dadoras e receptoras. A conjugação é também a maneira mais direta em que as células bacterianas interagem com as células hospedeiras para injetar genes, proteínas ou produtos químicos para sistemas host. ³ Muitas vezes, a transferência desses agentes tem efeitos notáveis sobre o anfitrião, que vão desde patogenia e carcinogênese para hospedar evolução e adaptação. Tem sido demonstrado que recombinatio conjugativon aumenta a taxa de adaptação 3 vezes em bactérias com taxas de mutação elevadas sob condições de stress ambiental. ⁴ Além disso, a conjugação é de longe a via mais comum, através do qual os genes de resistência a antibióticos em estirpes bacterianas são distribuídos. ^5,6

Os microrganismos têm evoluído sistemas de secreção especializados para suportar a transferência de macromoléculas através das membranas celulares; existem actualmente 9 tipos de sistemas de secreção (TSSs) em bactérias gram-negativas que foram descritos: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, bem como a SEC (secreção) e Tat (de dois arginina translocação) vias. ^7,8 Cada tipo de sistema de secreção é dividido em diferentes subtipos, uma necessidade devido à diversidade de proteínas e o carácter distintivo de caminhos envolvidos, em diferentes estirpes bacterianas. Por exemplo, no sistema de secreção de tipo IV (T4SS), os sistemas de Ti e facilitar o transporte CAG efector ao passo que a F-plasmídeo, R27 umnd pKM101 T4SSs facilitar a transferência de um plasmídeo conjugada. ^7,9,10 uma compreensão detalhada dos mecanismos pelos quais os organismos montam os seus respectivos sistemas de secreção de proteínas a partir de seus componentes e partilham conteúdo celular com um receptor ou o seu ambiente circundante é um factor importante no desenvolvimento de estratégias que apontam para combater microrganismos patogénicos e processos de infecção celular.

Após a conjugação bacteriana identificação inicial em E. coli por Lederberg & Tatum, ^{11 de} um grande número de plasmídeos conjugativos móveis e têm sido identificadas e caracterizadas. ¹² Tais plasmídeos móveis mostrar considerável gama é de tamanho (de 1 a mais de 200 quilobases (kb)), no entanto, todos os plasmídeos móveis contêm um relaxase, que reconhece a origem de transferência (oriT) permitindo assim a transmissão do plasmídeo. Os plasmídeos conjuntivos mais genes codificam para a montagem de um T4SS funcional, bem como um tipoproteína de ligação IV. ¹² Por exemplo, a 100 kb F plasmídeo de E. coli codifica todos os genes conjugadas dentro de uma transferência de 33,3 kB (tra) região. ¹³ Os genes na região do tra do plasmídeo codifica F todas as proteínas que facilitam a formação de pilus, Acasalamento formação de pares (MPF), a transferência de DNA e as funções de exclusão durante a transferência de plasmídeo conjugada. ^10,14,15 Um corpo significativo de conhecimento está disponível para T4SSs conjugada, porém detalhado estudos estruturais das proteínas conjugadas e complexos só são mais recentemente se tornando disponíveis. ^16-28

Para montar uma visão abrangente do processo conjugada, é necessário um acoplamento de estudos estruturais detalhados para mutacional análises de proteínas de transferência conjugadas. Isto pode ser conseguido através de ensaios de encaixe conjugadas. Para o plasmídeo F, cada proteína codificada dentro da região de TRA desempenha um papel na co-F mediadanjugation; por conseguinte, o nocaute / eliminação de um gene de transferência vai abolir a capacidade conjugadas das células (Figura 1). Enquanto plasmídeos celulares mais pequenas são mais conducentes para procedimentos de eliminação padrão, por plasmídeos conjugativos maiores, tais como F, nocaute de genes são mais prontamente conseguidas através de recombinação homóloga em que o gene alvo é substituída com uma transmissão de um gene de resistência a antibiótico distinta. No protocolo atual, que empregam recombinação homóloga para substituir um gene transfer de interesse com cloranfenicol acetiltransferase (CAT) na 55 kb F plasmídeo derivado pOX38-Tc; ^29,30 nocaute o plasmídeo resultante, pOX38-Tc :: Δgene Cm, facilita a resistência à presença de cloranfenicol (Cm) no meio de crescimento. células dadoras que albergam pOX38-Tc :: Δgene cm são incapazes de afectar conjugativo transferência de ADN / acasalamento como observado através da utilização de um ensaio de acoplamento; a eficácia de acoplamento de uma célula doadora pOX38-Tc Δgene :: cm e uma recip normaistário vai diminuir ou, mais frequentemente, ser abolido. transferência conjugativa do plasmídeo pOX38-Tc :: Δgene cm pode ser restaurada por meio de uma pequena recuperação de plasmídeo que alberga o gene alvo de transferência. Este plasmídeo de recuperação pode ser uma que proporciona a expressão constitutiva, tal como pK184 plasmídeo (pK184-gene), ³¹ ou um que fornece expressão indutível enquanto que o plasmídeo alvo correctamente o gene para a localização correcta no interior da célula (citoplasma ou periplasma). Consequentemente, em ensaios de acasalamento entre este novo doador (abrigando pOX38-Tc Δgene plasmídeos :: Cm + pK184 de gene) e uma célula receptora, a eficiência de acoplamento é esperado para restaurar a quase que de um ensaio de acoplamento doador-receptor normal. Este sistema permite uma para sondar a função do gene eliminado por meio da geração de uma série de construções pK184-Gene (deleções ou mutações pontuais) e testando a capacidade de cada construção para restaurar a capacidade de acoplamento do pOX38-Tc Δgene :: Cm abrigando célula doadoras.

1. Produção de construções de ADN

1. Designing Oligómeros para recombinação homóloga do gene alvo
   1. Design um único oligómero de 55-72 pb para a frente como se segue: (a) escolher uma sequência de nucleótidos de comprimento 19-32 pb que é homóloga a uma sequência de ADN na região de 10-100 pb a montante do local de início da extremidade 5 'do gene da cloranfenicol-acetiltransferase no plasmídeo pBAD33 comercial, ³² e (b) seleccionar um nucleótido 36-54 pb de comprimento sequência homóloga a uma região de 10-150 pb a jusante do local de iniciação a 5 'do gene alvo de interesse.
      1. Junte-se "fim da sequência de nucleótidos colhidos em (b) à extremidade 5 'da 3 extremidade da sequência de nucleótidos colhidos em (a), dando assim um único oligómero 55-72 longo para a frente.
   2. Design um único oligómero de 55-72 pb reversa como segue: (a) escolher uma sequência de nucleótidos de comprimento 19-32 pb que é homóloga a uma sequência de ADN na região de 10-100 pb a jusanteda extremidade 3 'do gene da cloranfenicol no plasmídeo pBAD33 comercial, e (b) seleccionar um nucleótido 36-54 pb de comprimento sequência homóloga a uma região dentro de 10-150 pb a montante da extremidade 3' local do gene alvo de interesse .
      1. Junte-se ao "fim da sequência de nucleotídeos colhidas em (b) a 5 'a 3 fim da sequência de nucleótidos colhidas em (a) para torná-lo uma única oligômero.
      2. Copiar este oligómero para qualquer software de bioinformática disponíveis e convertê-sequência para o seu complemento inverso. Isto lhe dará um único 55-72 pb de comprimento oligômero inversa.
   3. O uso de qualquer programa de oligo-analisador disponível, verifique se os oligômeros de recombinação têm conteúdo GC entre 40-60%, temperatura de fusão baixo hairpin (T _m), baixa auto e hetero-dimerização T _m 's. Encomendar os primers para a síntese e expedição de qualquer empresa de biotecnologia preferido.
2. Amplificação do Cassette CAT de pBAD33 (Cm ^R
3. Crescer uma cultura durante a noite (O / N, 16-18 h) de células DH5a portadoras do plasmídeo pBAD33 em caldo estéril Lisogenia (LB) com 20 ug / ml de cloranfenicol (Cm) com agitação a 200 rpm e 37 ° C.
4. Centrifugar 6-8 mL da cultura O / N à temperatura ambiente, 5,000 xg durante 3 min. Decantar o sobrenadante e extrai-se o plasmídeo pBAD33 a partir do sedimento utilizando um kit de plasmídeo mini-prep (Materiais Tabela) e o protocolo do fabricante.
5. Fazer uma digestão do ADN do plasmídeo pBAD33 adicionando o seguinte num tubo estéril na ordem dada: volume adequado de água bidestilada _(ddH2O) para um volume final de 50 ul, o volume de 1 ug de plasmídeo pBAD33, 5 pL de 10x de tampão de reacção de enzima, e 0,5 ul de enzima de restrição Aval (RE). Misturar suavemente por pipetagem e deixar a reacção prosseguir durante 1 h a 37 ° C. Inactivar pelo calor da reacção durante 20 minutos (min) a 80° C. Armazene as amostras a -20 ° C para não mais de 24 h para minimizar a degradação sticky-end.
6. Prepara-se uma agarose a 1,2% gel de separação por mistura de 1,2 g de agarose com 100 mL de 1x TAE (Tris 40 mM, pH 8,5, ácido acético 20 mM; EDTA 1 mM) em tampão de um balão de Erlenmeyer de 250 mL. Calor e agitar para dissolver completamente num forno de microondas. Pare o aquecimento imediatamente quando o líquido começa a ferver e agite o frasco.
   1. Arrefece-se a agarose líquido durante 3 min, à temperatura ambiente durante a agitação, adicionar 2 mL de 10 mg / mL de brometo de etídio e agite para misturar. Verter a agarose para um tabuleiro de gel com um pente bem e permitir que ele solidificar durante 1 h a temperatura ambiente. géis armazenar a 4 ° C por até 2 dias em tampão 1 x TAE.
7. Misturar cada RE digerir a partir de 1.2.3 com 0,2 volume de corante de carga de ADN (10? L de corante por reacção de 50 uL) por pipetagem. Carga de 5 mL de 500 ug / ml de ADN em escada o primeiro poço e toda a mistura RE Digest-corante no outro poço na umgel garose. Use 2-3 poços para carregar todo o volume de reacção para o gel.
   1. Submeter o gel mal submerso em tampão 1x TAE e operando a 45-50 V (4,5-5 V / cm) durante 65 minutos num dispositivo de electroforese em gel.
8. Usando um armário de UV e uma lâmina de barbear estéril, rapidamente cortar a banda de 2,8 kb que corresponde à sequência de gato para fora do gel para minimizar a exposição à radiação UV de ADN. Extrai-se a DNA a partir da fatia de gel de corte usando um kit de extracção em gel (Tabela Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
   Nota: Tenha cuidado para não expor a pele diretamente sob UV e lidar com a navalha com cuidado.
9. Amplificar a cassete de CAT a partir de 1.2.6 extraída por Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando os iniciadores concebidos em 1,1 que contêm saliências homólogas à sequência do gene para permitir a recombinação homóloga. As reacções de PCR são configurados em gelo utilizando as orientações do fabricante (Materiais Tabela) na seguinte ordem:
   1. Dentro detubo de PCR estéril, adicionar um volume apropriado de _ddH2O para um volume final de 50 mL, seguida por 10 ul de tampão PCR, 1 ul de dNTPs 10 mM, 2,5 uL de 10 mM Iniciador directo, 2,5 mL de 10 mM de primer reverso , 1-25 ng de ADN molde a partir de 1.2.6 e de 0,5 mL de 100 unidades / mL de polimerase de ADN.
   2. Defina-se um controlo negativo que leva os mesmos componentes que 1.2.7.1 mas com a excepção de ADN molde. Utilizar um volume apropriado de _ddH2O, em vez de ADN molde. Configurar um controlo positivo utilizando DNA e primers que têm sido comprovada para trabalhar em uma reação de PCR, tais como os fornecidos como controle positivo pelo fabricante do modelo.
   3. Misture todos os conteúdos da reacção suavemente por pipetagem.
   4. Amplificar por PCR utilizando os seguintes ajustes: desnaturação inicial de 30 segundos a 98 ° C, 30 ciclos de desnaturação durante 10 s a 98 ° C, hibridação do iniciador durante 20 s, extensão durante 20 s por quilobase de amplicão a 72 ° C e um barbatanaai extensão durante 10 minutos a 72 ° C. Armazene as amostras a -20 ºC.
10. Confirmar o tamanho correcto de amplificação através de electroforese em gel de agarose (ver 1.2.4-1.2.5), utilizando apenas 5 uL de cada reacção. Purifica-se o fragmento amplificado por PCR utilizando um kit de purificação de PCR e o protocolo do fabricante. Loja ADN purificado a -20 ° C.

2. Geração de pOX38-Tc Δgene :: Cm Cepas

1. DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm nocautes
   1. Prepara-se uma cultura de S / N de células DY330R pOX38-TC em 10 ml de LB estéril contendo 10 ug / ml Tc. Crescer a cultura O / N a 32 ° C e 200 rpm.
   2. Fazer uma diluição da cultura D / N 1:70 em 20 ml de LB estéril fresco Crescer as células a 32 ° C até (0,4-0,6 OD _600nm) de crescimento de fase mid-log.
   3. Transferem-se 10 ml de cultura para um frasco estéril e incubar a 42 ° C durante 15 minutos a 150 rpm numa ba água que agitamº. Isto irá induzir a expressão de proteínas específicas de recombinação em DY330R.
   4. Arrefeça a cultura num banho de gelo-água durante 10 min. Preparar células electrocompetentes como se segue.
      1. Transferência das células refrigerados em tubos cônicos de pré-refrigerados e centrifugar a 4.000 g durante 7 minutos a 4 ºC. Todos os tubos e pipetas que ser utilizados nos próximos passos devem ser colocadas a 4 ° C ou sobre gelo para arrefecer.
      2. Remover o sobrenadante e suavemente ressuspensas as células em 1 mL de DDH gelada ₂ O. Adicionar outros 30 mL de gelo frio ddH ₂ O.
      3. Centrifugar as células (4000 xg, 7 min, 4 ° C), Descartar o sobrenadante e suavemente ressuspensas as células em 1 mL de DDH gelada ₂ O.
      4. Transferir as células ressuspensas em pré-refrigerada tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 15000 xg durante 1 min a 4 ºC.
      5. Suavemente ressuspensas o sedimento em 200 ul de DDH gelada ₂ O e alíquota em volumes de 50 ul. Electrocompetecélulas NT pode ser armazenado a -80 ° C
   5. Adicionar 300 ng da cassete CAT amplificado de 1,2 em 50 mL de células DY330R pOX38-TC electrocompetentes, enquanto a mistura em gelo, delicadamente por pipetagem cima e para baixo. Repita este passo usando plasmídeo pBAD33 não modificada como um controlo positivo.
   6. Transferir as células para uma cuvete de electroporação de pré-arrefecida (-20 ° C) de 1 mm. Electroporate as células em 1,8 kV com uma constante de tempo de 5,5 ms, utilizando um electroporador. Imediatamente após a aplicação do impulso, diluir as células com 1 ml de meios SOC e transferir para um tubo de microcentrífuga novo. Incubar as células a 32 ° C durante 2 h.
   7. Alíquota de 100 uL de cada amostra em placas de agar contendo 10 ug / ml Tc e 20 ug / ml de CM e espalhadas usando um espalhador estéril. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Incubar a placa de cabeça para baixo a 32 ° C durante a noite para seleccionar os recombinantes bem sucedidos. A cassete CAT introduzido na célula vai sofrer re homólogacombinação com o gene de interesse e criar o DY330R pOX38-Tc :: Δgene cm (Rif ^{R, R Tc,} Cm ^R) do clone.
      Nota: É importante a crescer células DY330R a 32 ° C, com a excepção dos 15 minutos de indução a 42 ° C do Passo 2.1.3 antes da geração de células electrocompetentes, como crescimento prolongado a temperaturas elevadas, corre o risco de morte celular devido à produção de produtos tóxicos do p _L operon responsável por funções de recombinação em DY330R. ^33,34
   8. Prepara-se uma O / N de DY330R pOX38-Tc :: Δgene células cm por colheita de uma única colónia distinta de células com uma pipeta ou ansa estéril, e inoculando um meio de 20 ml estéril LB com 10 ug / ml Tc, e 20 ug / mL Cm. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Crescer as células O / N a 32 ° C com agitação a 200 rpm.
   9. Adicione 3-5 estoques de glicerol a partir de O / N por mistura de 500 ul da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de GL 100%ycerol (final de 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.
   10. Centrifugar 6-8 mL da cultura O / N à temperatura ambiente, 5,000 xg durante 3 min. Decantar o sobrenadante e extrair o pOX38-Tc Δgene :: Cm construir a partir do sedimento utilizando um kit plasmídeo mini-prep (Materials Table) e protocolo do fabricante; armazenar ADN purificado a -20 ° C.
   11. Realizar um ensaio de acasalamento por conjugação utilizando XK1200 células como o destinatário para confirmar a interrupção da conjugação por nocaute de genes, conforme o protocolo 3.1.
2. DY330R pOX38-Tc :: Δgene Cm + pK184-gene
   1. Transformar células DY330R pOX38-Tc :: Δgene Cm electrocompetentes com 300 ng do constructo pK184-gene através de electroporação como por passos 2.1.4-2.1.7. Todos os meios selectivos deve conter 20 ug / mL de Cm e 50 ug / mL de Km. Incubar a 32 ° C. O plasmídeo de recuperação nas células electroporadas irá agora restaurar a função do gene eliminado na DY330R pOX38-Tc Δgene :: células cm.
   2. Prepara-se uma O / N de DY330R pOX38-Tc :: Δgene células recombinantes Cm + pK184-gene por colheita de uma única colónia distinta das células com uma pipeta ou ansa estéril, e inoculando um meio de 20 ml estéril LB com 20 ug / ml Cm e 50 ug / mL de Km. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Crescer as células O / N a 32 ° C com agitação a 200 rpm.
   3. Adicione 3-5 estoques de glicerol a partir de O / N por mistura de 500 ul da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de glicerol 100% (final de 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.
   4. Também executam o protocolo 3.1 para gerar XK1200 pOX38-Tc :: Δgene Cm células recombinantes.
3. XK1200 pOX38-Tc :: Δgene Cm + pK184-gene e mutantes
   1. Prepare células electrocompetentes XK1200 pOX38-Tc Δgene :: cm (a partir da etapa 2.2.4).
   2. Separadamente electroporate 300 ng do pK184-gene ou genes-pK184 plasmídeos mutantes em 50 mL de ELEctrocompetent XK1200 pOX38-Tc Δgene :: células Cm como por passos 2.1.4-2.1.7. Todos os meios selectivos deve conter 10 ug / ml de ácido nalidíxico (Nal), 20 ug / ml de CM, e 50 ug / mL de Km e colocado numa estufa a 37 ° C.
   3. Prepara-se uma O / N de XK1200 pOX38-Tc Δgene :: células recombinantes Cm + pK184-gene por colheita de uma única colónia distinta das células com uma pipeta ou ansa estéril, e inoculando um meio de 20 ml estéril LB com Nal, 20 ug / mL cm e 50 ug / mL de Km. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Crescer as células O / N a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
   4. Adicione 3-5 estoques de glicerol a partir de O / N por mistura de 500 ul da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de glicerol 100% (final de 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.

3. conjuntivos acasalamento Ensaios

1. Conjugada Acasalamento para gerar XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm Cells
   1. Prepare a 20 mL estéril LB O / N cultura de DY330R pOX38-Tc Δgene :: células Cm + pK184 de gene usando uma pipeta ou ansa estéril para inocular um mL estéril LB 20 contendo 20 mg / mL cm e 50 mcg / mL Km com um estoque de glicerol ou colónia única em um placa de agar. Crescer a 32 ° C com agitação a 200 rpm. Prepara-se o mesmo para XK1200 células em 20 ml de LB estéril com 10 ug / mL de Nal, crescendo a 37 ° C.
   2. Fazer diluições 1:70 de cada cultura separadamente em 2 ml de LB estéril com as mesmas concentrações de antibióticos; adicionar glucose para uma concentração final de 100 mM a todas as células do dador. Crescer as células até à fase mid-log _(DO600 0,5-0,7) a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
   3. Centrífuga (4000 xg durante 5 min a 4 ° C) para sedimentar as células, descartar o sobrenadante, lavar uma vez com LB frio estéril para remover os antibióticos, e ressuspender as células em 2 ml de LB estéril frio
   4. Alíquota de 100 uL de cada cultura em 800 mL de meio LB estéril e permitir-lhes para acasalar a 32 ° C durante 1 h sem agitação.
   <li> Vortex as células durante 30 s para perturbar os pares de acasalamento e colocá-los em gelo durante 10 min, para evitar mais acasalamento.
   5. Alíquota de 100 uL da mistura de células para uma placa de agar contendo 10 ug / mL de Nal e 20 ug / mL de Cm para seleccionar células XK1200 pOX38-Tc Δgene :: cm. Espalhe as células usando um espalhador estéril. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Incubou-se a placa de O / N a 37 ° C, de cabeça para baixo.
   6. Colher uma única colónia do gene novo XK1200 pOX38-Tc Δ :: Cm estirpe knockout utilizando uma pipeta estéril ou loop e crescer em LB estéril com 20 ng / mL Cm, O / N em 37 ° C com agitação a 200 rpm. Adicione 3-5 estoques de glicerol a partir de O / N por mistura de 500 ul da cultura D / N com 500 mL de solução estéril de glicerol 100% (final de 50% v / v) em crio-tubos estéreis. Armazenar a -80 ° C.
      Nota: As células resultantes são agora capazes de ser competentes para a transformação com as construções pK184-gene (protocolos 1.3 e 1.4) para assessing do gene e dos seus mutantes na capacidade de recuperar transferência conjugativa no protocolo 3.2.
2. Conjugada Acasalamento Ensaio de XK1200 dadores aos receptores MC4100
   1. Prepara-se uma O / N de cultura XK1200 pOX38-Tc :: Δgene Cm + pK184-gene células em 20 mL de LB estéril com 20 ug / ml de CM, 50 ug / mL de Km e MC4100 células em 5 mL de LB com 50 ug / mL de estreptomicina (Sm) utilizando as células de um stock de glicerol ou de colónias únicas sobre uma placa de agar e estéril pipeta ou loop. Crescer culturas em 37 ° C com agitação 200 rpm.
   2. Fazer diluições 1:70 de cada cultura D / N separadamente em 2 ml de LB estéril com os mesmos antibióticos. Adicionar glicose até uma concentração final de 100 mM a todas as células do dador. Crescer as células até à fase mid-log _(DO600 0,5-0,7) a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
   3. Centrífuga (4000 xg durante 5 min a 4 ° C) para sedimentar as células, descartar o sobrenadante, lavar uma vez com LB frio estéril para remover antibiotiques, e Ressuspender as células em 2 mL LB. estéril frio
   4. Em duplicado, alíquota de 100 uL de cada cultura em 800 mL de meio LB estéril e permitir-lhes para acasalar a 37 ° C durante 1 h sem agitação.
   5. Agitar as células durante 30 s para perturbar os pares de acasalamento e colocá-los em gelo durante 10 min para evitar o agravamento do acasalamento.
   6. Usando as culturas mid-log a partir do passo 3.2.2 e fresco LB estéril, preparar a 6 diluições em série de células dadoras e receptoras a partir de 10 ^-2 a 10 ^-7.
   7. Em cada uma das duas metades de uma placa de agar contendo 10 ug / mL de Nal, 20 ug / mL de Cm e 50 ug / ml de km, mancha alíquotas de 10 ul de cada diluição de XK1200 células do dador, conforme mostrado na Figura 2. Repetir para as diluições das células receptoras MC4100 em placas de agar contendo 50 ug / mL de Sm. Incubar as placas de O / N a 37 ° C.
   8. Usando a mistura de vórtice do passo 3.2.5 e fresco LB estéril, prepare-se 6 diluições (10 ^-2 a 10 ^-7 Figura 2. Repita o procedimento para ambas as misturas duplicados. Mantenha a área estéril e trabalhar perto de uma chama. Incubar as placas de O / N a 37 ° C.
   9. Determinar a eficiência de acoplamento de cada construção, como descrito no protocolo 3.3.
   10. Repetir este protocolo para todos os plasmídeos de recuperação para avaliar o efeito de uma mutação particular, sobre a eficiência da conjugação.
3. O cálculo da eficiência de acoplamento
   1. Contar o número de colónias a partir da mesma mancha de diluição para cada dador, receptor e as células transconjugante em suas respectivas placas.
   2. Contagem das colónias receptores para testar qualquer tendência que possa resultar de ter um maior número de transconjugantes que os receptores em que dada diluição.
   3. Calculate a eficiência de acoplamento como o número de colónias transconjugante dividido pelo número de colónias de doadores. Multiplique por 100 para obter valor de eficiência por 100 células doadoras.

O processo de conjugação bacteriana F-driven plasmídeo é um processo coordenado que envolve proteínas de transferência dentro da região do tra de o F-plasmídeo que monta um T4SS para facilitar a síntese de pilus e transferência de ADN conjugativo. A proteína TRAF (Registo de GenBank # BAA97961; UniProt ID P14497) é necessária para a formação de F-pilus conjugativo. 10,14,35 - 37 A proteína contém um domínio tioredoxina-como C-terminal, apesar de não ter o motivo CXXC catalítica. 35,38 Embora tenha sido previsto para interagir com a proteína Trah através do seu domínio N-terminal, uma região 39 mostrou-se mais dinâmico do que o seu domínio do terminal C, 37 não se sabe muito mais sobre as características estruturais da proteína. Para avaliar os aspectos funcionais da proteína de TRAF em conjunto com estudos estruturais, que primeiro eliminado o gene TRAF sobre a pOX38-Tc através homólogarecombinação, gerando o plasmídeo pOX38-Tc :: ΔtraF cm (Tabela 1) em células de E. coli DY330R. 33,34 Também gerado foi o plasmídeo pK184-TRAF de TRAF iniciadores espec�icos (Tabela 2) para fornecer recuperação de conjugação e permitir sondagem sequência da proteína. A transferência do plasmídeo pOX38-Tc :: ΔtraF Cm XK1200 em células a partir de células 40 quando DY330R pK184-TRAF foram fornecidas in trans (transconjugantes cresceram em 10 ug / mL de Nal, 10 ug / ml Tc e 20 ug / ml cm) indica que (a) o nocaute TRAF em pOx38-Tc :: ΔtraF Cm fornece uma cassete de CAT em grelha, e (b) que pK184-TRAF pode restaurar a função conjugativo.

Uma série de mutantes de TRAF foram gerados por análise utilizando o ensaio de acasalamento por conjugação utilizando 37 XK1200 pOX38-Tc :: ΔtraF Cm + pK184-TRAF AXe células MC4100 41 como doadores e receptores, respectivamente. Um mutante é representativa TRAF 55-247 (Tabela 1), um mutante de deleção N-terminal que remove a região da proteína prevista para interagir com Trah. Quando a proteína de comprimento completo TRAF é fornecido para as células do dador, transferência conjugativa é restaurado (Figura 2), enquanto fornece as pK184 plasmídeo vazia não (Tabela 3). Da mesma forma, a função conjugada nas células dadoras XK1200 não é restaurado quando fornecido com pK184-TRAF plasmídeo 55-247 (Tabela 3). Isto indica que a região truncada da proteína é importante para a função do TRAF dentro do aparelho conjugativo, provavelmente através da interacção com Trah, e proporciona uma região da proteína alvo para posterior análise mutacional.

em trans por meio de um plasmídeo de recuperação (pK184-gene). O resultante pOX38-Tc :: Δgene Cm plasmídeo é transferido para uma estirpe XK1200 (Passo 2) para posterior avaliação do gene utilizando ensaios de acasalamento com um destinatário MC4100 (Passo 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Mating ensaio para avaliar a função do gene alvo, em conjugação. Células do doador e do receptor foram E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF :: Cm transformada com pK184-TRAF e MC4100, respectivamente. Os transconjugantes resultantes (MC4100 pOX38-Tc ΔtraF :: cm) crescer em placas contendo Sm e Cm, indicando recuperação bem sucedida da função conjugada. A experiência é feita em duplicado numa única placa de agar, e as diluições em série são utilizados de forma a calcular a eficiência de acoplamento de mutantes de genes restauradores (Tabela 2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: estirpes de E. coli e os plasmídeos usados neste estudo.

Tabela 2: Lista de iniciadores utilizados neste estudo.

Tabela 3: eficiência de acasalamento abolido por construções de deleção TRAF.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.