Artigo de método

Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

DOI:

10.3791/54858

⸱

19 de janeiro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 2Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve a forma de avaliar a expressão de uma grande variedade de genes ao nível clonal. De uma única célula RT-qPCR produz resultados altamente confiáveis, com uma forte sensibilidade para centenas de amostras e genes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

a expressão do gene heterogeneidade é uma característica interessante para investigar em populações linfóides. A expressão de genes nestas células varia durante a activação celular, stress, ou a estimulação. Unicelular expressão do gene multiplex permite a avaliação simultânea de dezenas de genes 1, 2, 3. Ao nível de uma única célula, a expressão do gene multiplex determina população heterogeneidade 4, 5. Ele permite a distinção de heterogeneidade da população determinando tanto a mistura provável de diversas fases precursoras entre células maduras, e também a diversidade de respostas celulares a estímulos.

Células linfóides inatos (ILC) foram recentemente descritas como uma população de efectores inatos da resposta imunitária 6, 7. Neste protocolo, a heterogeneidade célula do ILC elecompartimento Patic é investigada durante a homeostase.

Atualmente, a técnica mais utilizada para avaliar a expressão do gene é RT-qPCR. Esta expressão do gene método mede apenas um gene de cada vez. Além disso, este método não é possível estimar a heterogeneidade de expressão de gene, uma vez que várias células são necessários para um teste. Isto leva-se à medição da expressão do gene da média da população. Ao avaliar um grande número de genes, RT-qPCR torna-se um, e método de tempo- reagent-, consumindo-amostra. Assim, os trade-offs limitar o número de genes ou populações de células que podem ser avaliados, aumentando o risco de perder a imagem global.

Este manuscrito descreve como multiplex de uma única célula de RT-qPCR pode ser utilizada para ultrapassar estas limitações. Esta técnica tem se beneficiado da recente microfluidics avanços tecnológicos 1, 2. Reações que ocorrem no multiplex chips de RT-qPCR não exceed o nível de nanoliter. Assim, a expressão do gene de uma única célula, bem como a expressão de genes múltiplos em simultâneo, pode ser realizada num reagent-, de amostra, e forma rentável. É possível testar génica em células de assinatura heterogeneidade ao nível clonal entre subconjuntos de células dentro de uma população em diferentes estágios de desenvolvimento ou sob diferentes condições de 4, 5. Trabalhando em populações raras com um grande número de condições do nível de uma única célula não é uma restrição.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao longo dos últimos anos, as células linfóides inatas (CIT) têm sido cada vez mais investigada. Apesar da sua falta de receptores específicos para o antigénio, eles pertencem à linhagem linfóide e representam sentinelas importantes para a homeostase do tecido e inflamação. CIT está dividida em três grupos com base na sua expressão de combinações específicas do factor de transcrição e na sua capacidade para produzir citocinas 6, 7.

ILCs contribuir para inúmeras situações homeostáticos e fisiopatológicos em diversos órgãos através da produção de citocinas específicas 8, 9. Para ser capaz de compreender o papel destas células, é importante para determinar as várias subpopulações ILC por órgãos e identificar as suas relações de desenvolvimento. Além disso, os fenómenos de plasticidade entre os diferentes subconjuntos foram relacionados. Ao estudar a heterogeneidadedas células presentes em um órgão, é possível delimitar o seu estádio de maturação e de distinguir as suas funções específicas.

Para ilustrar a técnica de multiplex de uma única célula RT-qPCR, ILCs hepáticas foram escolhidos, com especial ênfase na sua heterogeneidade dentro do mesmo grupo ILC (tipo 1 ILC) 10. Em primeiro lugar, através do uso de citometria de fluxo, três populações distintas ILC foram caracterizados no fígado. Grupo 1 ILC representa cerca de 80% dos efectores inatos, enquanto as duas outras populações são raras populações ILC hepáticas (menos do que 5% do efectores inatos). Essas populações foram classificados usando marcadores da superfície celular amplamente expressos das populações ILC. Como resultado, as populações classificadas ILC no fígado um olhar muito semelhante a outro.

Multiplex de uma única célula RT-qPCR tem emergido como uma das melhores técnicas para investigar imediatamente a heterogeneidade dessas populações 11 . Duas características principais são determinados tomando vantagem do multiplex de uma única célula a técnica de RT-qPCR. Em primeiro lugar, ao olhar para o nível clonal, é possível recuperar a expressão do gene específico da célula para a comparação entre as células que aparentemente mostrar estágios de desenvolvimento semelhantes. Então, ao olhar para uma combinação pré-selecionada da expressão do gene, vamos determinar novas assinaturas genéticas com base em padrões de expressão gênica simultâneas em um ponto do tempo. Estes aspectos permitir a recolha de uma grande variedade de dados de expressão para um grande número de células, mesmo em populações raros, uma vez que a técnica é realizada ao nível clonal. Desse modo, a heterogeneidade ILC no fígado pode ser adequadamente avaliado.

Em seguida, classificando todas as células com um fenótipo ILC global, uma ampla visão geral da expressão de múltiplos genes das populações ILC fígado é obtido, apesar de representarem populações extremamente raros. Um chip à base de microfluídica permite a experimentação com aindauma pequena quantidade de material celular. Como consequência, os perfis de populações de células raras de expressão de genes pode ser obtida. Usando o software on-line assinatura gene análise, aglomerados populacionais celular e relações celulares potenciais podem ser investigadas. Consequentemente, testes de funcionamento podem ser realizados para validar os dados de agrupamento no nível in vivo.

Dezenas de expressão dos genes poderia ser avaliado concomitantemente em centenas ou mais células individuais no mesmo chip 3, 11, 12. Projeto do ensaio é a parte mais longa e mais importante do experimento. A determinação dos genes relevantes para a hipótese de ser testado é fundamental para obter resultados relevantes. Em segundo lugar, são necessários controles internos (como marcadores de superfície conhecidos utilizados para a classificação) e controles específicos. Este aspecto é crucial para testar a especificidade do iniciador de amplificação, a eficiência da amplificação, e tele ausência de concorrência primer. Por conseguinte, o trabalho com multiplex de uma única célula de RT-qPCR é uma técnica que economiza tempo, como a expressão de vários genes de uma célula é avaliado ao mesmo tempo.

Usando o mesmo chip e mistura de reagentes para todas as células limita os possíveis erros de manipulação e permite uma reprodutibilidade entre as amostras. No seu conjunto, os diferentes aspectos do multiplex de uma única célula de RT-qPCR permite a produção de resultados altamente fiáveis ​​ao nível clonal, com um grande nível de sensibilidade para uma ampla variedade de amostras e genes. Os resultados obtidos oferecem dados poderosa e robusta para testes biostatistical.

Isto pode ser conseguido devido ao aspecto do método de microfluidos, que permite que o trabalho em muito pequenas quantidades de material e leva a resultados exaustivos. Finalmente, utilizando software de linha, é possível comparar as populações desejados.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comité de Segurança do Instituto Pasteur, de acordo com o Ministério da Agricultura francês e as orientações da UE.

1. Prepare uma placa de classificação de célula única de 96 poços

  1. Prepare a mistura de pré-amplificação em um tubo de 1,5 ml por adição de 5,0 mL de tampão de retro-transcrição específica, 1,3 ul de baixa ácido etilenodiaminotetracético tampão (EDTA) de TE (10 solução TE mM, pH 8, e EDTA 0,1 mM; 0,2 uM filtrada ), e 0,2 jil de polimerase de ADN de Taq por poço (Figura 1A).
  2. Numa placa de 96 poços, distribuir 6,5 ul de mistura de pré-amplificação em cada poço (até 48 poços). Esta placa é a placa de 96 poços a triagem de uma única célula.
    NOTA: Usando uma pipeta electrónica é recomendado para este protocolo. Ele permite medições precisas e reprodutíveis de volume e economiza tempo.

figure-protocol-1
(A) Com uma única célula de 96 poços da placa de triagem, a mistura de pré-amplificação é primeiramente distribuído, seguido pela mistura de ensaio 0,2x. (B) O registro de cada posição de uma única célula deve ser mantido em uma planilha. Um poço sem uma célula é chamado um poço "sem entrada" e pode ser utilizada como um controlo. Duas linhas podem ser poupados para controlar a eficiência do iniciador com diluição ADNc (sequenciais um em cada dez diluições de o equivalente a 10 5 células a uma célula). (C) Na placa de ensaio de 96 poços, o reagente de ensaio de carga é distribuída em primeiro lugar, seguido da adição dos iniciadores. Não se esqueça de manter um layout de cada posição primer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Prepara-se uma mistura de ensaio 0,2x em um tubo de 1,5 ml por adição de 1,4 ul de cada um dos iniciadores (primers 20x; até 48 sondas diferentes; ver Tabela 1). Ajustar o volume final para 140 mL com baixa EDTA TE.
  2. Distribuir 2,5 ul da mistura de ensaio para os 0,2x 48 poços na placa de triagem de uma única célula de 96 poços contendo a mistura de pré-amplificação.
    NOTA: O volume final em cada poço da placa de amostra de 96 poços devem ser de 9 ul.
  3. Selar a placa com uma película de cobertura. Vortex da placa e gire-a para baixo a 280 xg durante 45 seg. Armazenar a placa de triagem de uma única célula de 96 poços à temperatura de -20 ° C ou utilizá-lo imediatamente.

2. A dissociação celular standard

  1. Usando um sistema de fornecimento de CO 2, a eutanásia um rato pela hipóxia. Fixar o mouse em uma placa de dissecação e abrir a cavidade peritoneal longitudinalmente com uma tesoura.
  2. Recuperar CIT do fígado.
    1. Antes do isolamento do fígado, lave o livcélulas ER-circulantes.
      1. Para trazer para fora da veia porta, mova o pequeno e o intestino grosso para o lado esquerdo do mouse; a veia porta aparece como a maior veia na cavidade peritoneal.
      2. Com uma seringa de 10 ml e uma agulha de 0,45 milímetros, lave o fígado com o meio de solução salina tamponada com fosfato (PBS) através da veia porta. Para facilitar a lavagem do fígado, cortar a artéria gástrica com uma tesoura.
      3. Para remover a vesícula biliar, comprimir a base da vesícula biliar com uma pinça e separá-lo do fígado com uma tesoura.
      4. Para isolar o fígado, comprimir a base do fígado com uma pinça, e usando uma tesoura, separar o fígado a partir do restante da cavidade peritoneal.
      5. Transferir o fígado num tubo de Potter com 5 ml de meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de soro fetal de vitelo a 2% (FCS).
  3. Dissociar o fígado, com uma dissociação mecânico usando um pilão. Transferir a forma de um tubo de 15 ml. Levar o volume totalpara 14 ml com meio RPMI 2% de FCS. Deixar a suspensão de células em gelo durante 15-20 minutos para decantar os hepatócitos.
  4. Recuperar o sobrenadante (sem os hepatócitos) em um novo tubo de 15 ml usando uma pipeta de 1 ml (12 ml de sobrenadante pode ser esperado). Girar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Descartar o sobrenadante após centrifugação.
  5. Ressuspender o sedimento obtido na etapa 2.4 em 14 ml de meio de gradiente de densidade (por exemplo, de Percoll 40%). Girar a 600 xg durante 20 min a 20 ° C. Remover o sobrenadante por aspiração.
  6. Ressuspender o sedimento em 1 ml de acetato de potássio (ACK). Deixar a temperatura ambiente durante 1 min. Após 1 min, levar o volume total a 14 ml com solução equilibrada de Hank Salgado (HBSS) 2% de FCS. Girar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Descartar o sobrenadante.
  7. Corar as células.
    1. Ressuspender o sedimento em 300 ul de mistura de anticorpo biotinilado (ver a Tabela Materiais; adicionar todos os anticorpos biotinilados mencionared) e transferir as células em 1,5 ml de tubo. Deixar no escuro durante 20 min a 4 ° C.
    2. Levar o volume total para 1 mL com HBSS 2% de FCS. Girar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Ressuspender o sedimento em 300 ul de mistura de anticorpo acoplado com fluorocromo e estreptavidina conjugada com fluorocromo (ver a Tabela Materiais; adicionar todos os anticorpos fluorocromo-acoplado mencionadas). Deixar no escuro durante 20 min a 4 ° C.
  8. Levar o volume total para 1 mL com HBSS 2% de FCS. Girar a 120 xg durante 7 minutos a 10 ° C. Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de 1 ml. Ressuspender o sedimento em 1 ml de HBSS e de iodeto de propídio (Pi; 1: 4000).
    NOTA: Quando utilizar os marcadores de superfície celular ILC amplamente expressas, 3 populações são definidas: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + e NKp46 - IL-7Rα +. Todas as populações são classificadas linhagem - CD3 - CD4 - CD45.2 +.

3. uma única célula de células activadas por fluorescência (FACS)

  1. Use FACS para classificar células individuais 13.
    NOTA: Diferentes tipos de células podem ser classificados na mesma placa de 96 poços a triagem de uma única célula (Figura 2).
    1. Use FACS para classificar uma célula por poço contendo a mistura de ensaio 0,2x e a mistura de pré-amplificação na placa de triagem de uma única célula de 96 poços. Usar uma placa de triagem de uma única célula de 96 poços preparado de fresco ou descongelar se armazenadas a -20 ° C.
      1. Colocar uma placa de 96 poços vedado de suporte da placa do FACS. Usar uma placa de 96 poços vazios como um teste. Posicionar a placa com o A1-bem no lado esquerdo e para o experimentador.
      2. Ajustar o suporte da placa para se obter uma queda no centro da A1-bem com os grânulos de verificação.
      3. Repita o passo 3.1.1.2 com todos os poços na linha A.
      4. Retire o selo da placa de 96 poços e classificar 100 esferas de verificação por poço. Verifique se dformação ROP no centro das cavidades.
      5. Quando ajustado corretamente, coloque a placa de 96 poços de classificação de uma única célula no suporte da placa. Desenhar o layout da placa e tipo 1 células por poço.
        NOTA: O posicionamento correcto de cada célula na placa de triagem de uma única célula de 96 poços é essencial. A disposição da placa deve ser mantido em um software de planilha. A disposição da placa será utilizado no próximo vários passos (Figura 1B) 14. Deixar um bem mistura de ensaio contendo 0,2x e mistura de pré-amplificação na placa de amostra de 96 poços sem células. Esta cavidade é utilizado como um controlo não-entrada. Deixar duas filas de 6 poços por uma diluição de ADNc. Estes poços são utilizados como controlos para a eficiência do iniciador (Figura 1b).
      6. Armazenar a placa de triagem de uma única célula de 96 poços à temperatura de -20 ° C ou utilizá-lo imediatamente.

4. Pré-amplificação

  1. Use uma única célula-ordenação obt placa fresco ou descongelado de 96 poçosained no passo 3.1.1.6. Vortex da placa e gire-a para baixo (280 g durante 45 seg).
  2. Colocar a placa de 96 poços de triagem de células único no termociclador. Realizar a transcrição reversa e de pré-amplificação de acordo com o programa indicado na Figura 3 e na Tabela 2.

figure-protocol-2
Figura 3: programa de pré-amplificação. A fim de ter material suficiente, é necessário pré-amplificação de genes-alvo específicos nas células individuais ordenadas. A placa de 96 poços a triagem de uma única célula é carregada no termociclador a seguir o programa de pré-amplificação. Os produtos pré-amplificação são então diluídas com tampão TE baixo EDTA e podem ser utilizadas imediatamente ou congeladas a -20 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Dilui-se a pré-amplified amostras pela adição de 36 ul de tampão de baixa EDTA TE em cada poço.
  2. Selar a placa com uma película de cobertura. Vortex da placa e gire-a para baixo (280 g durante 45 seg). Armazenar a placa de 96 poços pré-amplificado, de uma única célula de triagem a -20 ° C ou utilizá-lo imediatamente.

5. Preparar uma placa de amostra de 96 poços

  1. Preparar 191 ul de mistura principal, adicionando 175 ul de qPCR mistura principal e 17,5 ul de reagente de carregamento de amostra.
  2. Numa nova placa de 96 poços, distribuir 3,6 ul de mistura principal em cada poço (até 48 poços). Esta é a placa de 96 poços de amostra.
  3. Transferir 2,9 uL de ADNc pré-amplificado a partir de amostra da placa de 96 cavidades para a nova placa de 96 poços. Manter a mesma posição para cada amostra entre a placa de separação de células de 96 único e a placa de amostra de 96 poços.
  4. Selar a placa com uma película de cobertura. Vortex da placa e gire-a para baixo (280 g durante 45 seg). Coloque a nova placa de 96 poços sobre gelo protegido da luz. Armazenar a 96-s bemamplo placa à temperatura de -20 ° C ou utilizá-lo imediatamente.

6. Prepara-se uma placa de ensaio de 96 poços

  1. Numa nova placa de 96 poços, distribuem 3 ul de reagente de ensaio de carga em cada poço (até 48 poços). Esta placa é chamado de placa de ensaio de 96 poços.
  2. Adicionar 3 mL de iniciadores para cada poço. Manter uma disposição sobre uma folha de cálculo de software (Figura 1c e Tabela 1; utilizar todos os iniciadores listados na Tabela 1). O posicionamento adequado de cada um dos iniciadores na placa de ensaio de 96 poços é essencial para as várias etapas a seguir.
    1. Se o número de amostras é inferior a 48, adicionar água em vez de iniciadores para os poços não utilizados.
  3. Selar a placa com uma película de cobertura. Vortex da placa e gire-a para baixo (280 g durante 45 seg). Armazenar a placa de ensaio com 96 poços à temperatura de -20 ° C ou utilizá-lo imediatamente.
    NOTA: Para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento dos primers, distribuir os primers para a mistura de pré-amplificação e para a 96-well placa de ensaio, ao mesmo tempo.

7. células Single Chip Gene-expressão

  1. Coloque o circuito microfluídico integrado (IFC) no banco e verificar as válvulas utilizando a seringa tampada. Abra a seringa, coloque-o perpendicular à válvula, e pressione com firmeza. O O-ring deve se mover. Encha o chip com o fluido da linha de controle (0,3 ml de tuberculina).
  2. Repita o passo 7.1 com a segunda válvula.
    NOTA: Nenhum líquido deve ser derramado sobre o chip.
  3. Remover a película de azul a partir do fundo do chip. Coloque o chip no controlador IFC. Na tela do controlador do IFC, selecione "PRIME" e depois "Executar". O controle das linhas microfluídicos durar 10 min.
  4. Ejectar o chip e re-selar a película azul na parte inferior do chip.

figure-protocol-3
Figura 4: uma única célula multiplex gene-expressão chip de carregamento. Estes passos requerem great precisão, especialmente durante a transferência da placa de 96 poços para o chip de gene-expressão múltipla de uma única célula. Para evitar erros de carregamento e extravios, é altamente recomendável para trabalhar sequencialmente. O volume necessário para cada transferência deve ser controlada durante o processo de pipetagem. Finalmente, é importante para evitar as bolhas de e para removê-los, no caso de formação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Usando uma pipeta de 8 canais, transferência de 5 ul a partir da placa de ensaio de 96 poços A1 no lado (lado esquerdo) do chip. Encher o lado esquerdo do chip, conforme indicado na Figura 4. Tenha o cuidado de sempre desenhar o mesmo volume nas pontas.
    1. Não crie bolhas. Se aparecerem bolhas, removê-los usando 10 dicas ul. Alterar dicas para cada cavidade do chip.
  2. Repita o passo 7.5 no lado direito of o chip utilizando 5 ul a partir da placa de amostra de 96 poços.
  3. Remover a película de azul a partir do fundo do chip. Coloque o chip no controlador IFC. Na tela do controlador do IFC, selecione "Run Script" e depois "Executar". O carregamento das linhas de microfluidos dura 45 min.
  4. Ejectar o chip e re-selar a película azul na parte inferior do chip.

8. Execute o Chip

  1. No computador qPCR microfluídico, selecione o software "coleta de dados". Uma vez que começa, selecione "New Executar".
  2. Seleccionar "Ejectar", remover a película azul a partir da parte inferior do chip, e carregar o chip. Colocar o chip para obter o A1 bem no lado esquerdo e para o experimentador.
  3. Em "definição de projecto", selecione "Nenhum" e depois "Next".
  4. Selecione "run novo chip", "diretório novo chip" (criar uma pasta para o experimento) e "Next".
  5. Em "A expressão genética" select ",; Referência passiva = ROX "(carboxi-x-rodamina) e" sonda único; "selecione o filtro correto de acordo com os primers Escolha." Next ".
  6. Selecione "Procurar" e selecione o programa correto de acordo com os primers utilizados.
    NOTA: "Default-10min-Hotstart.pcl" é o programa mais comumente usado para multiplex de uma única célula RT-qPCR.
  7. Selecione "Start Run". A reacção demora aproximadamente 90 min.
  8. Uma vez terminado, selecione "Eject-Feito".

9. Análise de Dados

  1. Abra o software "Real-Time PCR Análise", selecione "Arquivo" e "Open", localize a pasta de experiência, e selecione "arquivo ChipRun.bml."
  2. Clique em "Ver Análise", "Tabela de resultados" e "Heat Map View;" caixas marcadas com um "X" estão abaixo do nível de detecção de limiar e / ou tinha curvas de amplificação ruins.
  3. Nome das amostras. Vá em "Configuração de Amostra" e select "New SBS 96." Clique em "Mapping" e selecione "..." Copie e cole o projeto de layout amostra do software de planilha. Definir o layout colado como "nome da amostra."
  4. Nomear os ensaios. Repita o passo 9.3, com os nomes de primers em "Setup Detector". Definir o layout colado como "Nome Detector".
  5. Clique em "exibição de Análise" e "Analisar"; os exemplos de nomes de iniciadores e será atribuído automaticamente para as amostras e os iniciadores (Figura 7).
  6. Calcule Ct, Delta Ct e dobre Mudança para cada amostra. Uso de um gene housekeeping como um controlo interno (aqui, GAPDH):
    ΔCt = amostra Ct - controle interno Ct
    Dobre Alterar = 2 - (controle ΔCtsample-ΔCtnegative)
    1. Clique em "Setup Detector" e selecione o bem com nenhum controle de entrada (usar o gene de manutenção como um controlo interno para normalizar a expressão do gene). Selecione "Editor "," definir de referência "e" Update ".
    2. Selecione todos os poços para que serão aplicados no controle interno acima definido. Selecione "Editor" e "definir como teste." Selecione um gene de referência apropriado e clique em "Update".
    3. Selecione "Configuração de exemplo" para selecionar o controle negativo. Selecione "Editor" e definir "Referência". Clique em "Update".
    4. Selecione "View Análise" e "Analisar"; o Delta Ct e Mudança Fold será automaticamente calculado.
  7. Exportar os dados. Selecione "Arquivo" e "Exportar, salvar como" Resultados da Mesa ", selecione a pasta de destino, e clique em" Save "e" Exit ".
  8. Repita o passo 9.7, mas em vez de "Resultados da Mesa," salvar como "Resultados HeatMap."

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

populações linfóides exibir grande diversidade de expressão do gene. Neste protocolo, a heterogeneidade do fígado compartimento ILC foi investigado utilizando multiplex de uma única célula RT-qPCR expressão do gene. Ao contrário de outras técnicas de expressão de genes, de uma única célula em multiplex RT-qPCR permite a expressão do gene de trabalho em várias populações, mesmo o mais raro, ao mesmo tempo. Esta especificidade, juntamente com uma elevada sensibilidade ao nível clonal, perm...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve como obter a expressão do gene de informação exaustiva ao nível clonal. Aqui, nós investigamos fígado ILC heterogeneidade compartimento. Após a triagem de uma única célula de diferentes populações ILC (com base em marcadores de superfície ILC amplamente expressas), as amostras foram pré-amplificada para genes pré-selecionados específicos. Em seguida, o ADNc e os iniciadores obtidos foram carregados num chip de microfluidos de RT-qPCR multiplex. Finalmente, obteve-se a expressão de 48 genes difere...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot e pelo Ministère de la Recherche (para S.C.); a Association pour la Recherche sur le Cancer (para S.C. e R.G.); o REVIVE Future Investment Program e a Agence Nationale de Recherche (ANR; subvenção ''Twothyme'' para A.C.); ANR concede ''Myeloten'' (para R.G.); e o Institut National du Cancer (Papel do microambiente imunológico durante a carcinogênese hepática, para R.G.). Agradecemos ao Centro de Imunologia Humana e Citometria do Institut Pasteur por seu apoio.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit qRT-PCR Cells Direct One Step daApplied Biosystems 11753100Kit de detecção de sonda de primer. Contém 2x mistura de reação, enzima SSIII Platinium.
96 poçosThermofisher ScientificAB 11000Placas de 96 poços adaptadas para classificação de células e termociclagem
Filme de coberturaDominique Dutscher106570filme de cobertura de alumínio; evitar contaminação e evaporação
ActbThermofisher ScientificMm00607939_s120x primer
Thermofisher ScientificMm01148854_s120x primer
AhrThermofisher ScientificMm00478932_s120x primer
Bcl2Thermofisher ScientificMm00477631_s120x primer
c-mycThermofisher ScientificMm00487804_s120x primer
CbfbThermofisher ScientificMm01251026_s120x primer
Cd27Thermofisher ScientificMm01185212_s120x primer
Cd49aThermofisher ScientificMm01306375_s120x primer
CD49bThermofisher ScientificMm00434371_s120x primer
Cxcr5Thermofisher ScientificMm00432086_s120x primer
Cxcr6Thermofisher ScientificMm02620517_s120x primer
EomesThermofisher ScientificMm01351985_s120x primer
Ets1Thermofisher ScientificMm01175819_s120x primer
Foxo1Thermofisher ScientificMm00490672_s120x primer
GapdhThermofisher ScientificMm03302249_s120x primer
Gata3Thermofisher ScientificMm00484683_s120x primer
Gm-csfThermofisher ScientificMm01136644_s120x primer
Hes1Thermofisher ScientificMm01342805_s120x primer
HprtThermofisher ScientificMm00446968_s120x primer
Id2Thermofisher ScientificMm01293217_s120x primer
Il-12rb2Thermofisher ScientificMm00711781_s120x primer
Il-18r1Thermofisher ScientificMm00515178_s120x primer
Il-1rl1Thermofisher ScientificMm00434237_s120x primer
Il-22Thermofisher ScientificMm001226722_s120x primer
Il-23rThermofisher ScientificMm00519943_s120x primer
Il-2raThermofisher ScientificMm01340213_s120x primer
Il-2rbThermofisher ScientificMm01195267_s120x primer
IL-7rThermofisher ScientificMm00434295_s120x primer
Klr5Thermofisher ScientificMm04207528_s120x primer
Lef1Thermofisher ScientificMm00550265_s120x primer
Ncr1Thermofisher ScientificMm01337324_s120x primer
Nfil3Thermofisher ScientificMm01339838_s120x primer
Notch1Thermofisher ScientificMm00435249_s120x primer
Notch2Thermofisher ScientificMm00803069_s120x primer
RoraThermofisher ScientificMm01173766_s120x primer
RorcThermofisher ScientificMm01261022_s120x primer
Runx3Thermofisher ScientificMm00490666_s120x primer
Tbx21Thermofisher ScientificMm01299453_s120x primer
Tcf3Thermofisher ScientificMm01175588_s120x primer
Tcf7Thermofisher ScientificMm00493445_s120x primer
Tle1Thermofisher ScientificMm00495643_s120x primer
Tle3Thermofisher ScientificMm00437097_s120x primer
Tsc22d3Thermofisher ScientificMm01306210_s120x primer
Tnfrsf11aThermofisher ScientificMm00437132_s120x primer
ToxThermofisher ScientificMm00455231_s120x primer
Zbtb16Thermofisher ScientificMm01176868_s120x primer
Zbtb7bThermofisher ScientificMm00784709_s120x primer
qPCR Master mix Applied BioSystemsP/N 4304437
2x Reagente de CarregamentoEnsaio FluidigmP/N 85000736Densidade específica média para carregar ensaios em chip microfluídico multiplex RT-qPCR. 
2x Reagente de CarregamentoAmostras FluidigmP/N 85000735Meio de densidade específica para carregar amostras em chip microfluídico multiplex RT-qPCR. 
48,48 chip microfluídico mutliplex RT qPCRFluidigmBMK-M-48,4848,48 Matriz Dinâmica IFC para Expressão Gênica; chip para reação RT-qPCR multiplex de célula única
48.48 mutliplex RT qPCR controlador de chip microfluídicoFluidigm8900002048.48 Controlador IFC; controlar o sistema fluídico interno do chip, carregar amostras e ensaios em câmaras de reação
multiplex RT qPCR termociclador microfluídicoFluidigmGE48.4848.48 Termociclador IFC de matriz dinâmica
Placas de 96 poçosThermofisher ScientificAB 1100Placas de 96 poços adaptadas para classificação de células e termociclagem
camundongos C57Bl/6JanvierC57Bl/6 miceJ@RJ
seringa de 10 mlBD Biosciences309639
PBSLife Technologies14040174
HBSSLife Technologies24020133
RPMILife Technologies61870044
FCSCVFSVF000UEurobio AbcysSoro fetal padrão para bezerros
Tubo de PotterN/A
Tubo de 15 mlCorning352097
tubo de 1,5 mlMáquina FACS SIGMA-ALDRICHT9661-1000EA
/A
centrífuga Thermofisher Scientific75004538
1.000 µ l dicasFisher Scientific10313272
P1000 GilsonF123602
PercollDominique Dutscher17-0891-01
Tubo de facsFalcon352235
anti-CD8 Anticorpo de camundongo de biotinaSony1103520anticorpo
camundongo anti-CD19 Anticorpo de camundongo de biotinaSony1177520anticorpo
camundongo anti-TCRab Biotina anticorpo de camundongoBioLegend109204anticorpo de linhagem
anti-TCRgd Anticorpo de camundongo de biotinaBD Biosciences553176anticorpo
camundongo de linhagem anti-Ter119 Anticorpo de camundongo de biotinaBD Biosciences553672anticorpo
camundongo anti-Gr1 Anticorpo de camundongo de biotinaBD Biosciences553125
anticorpo de camundongo anti-CD45.2 PerCPCy5.5BioLegend109828
anticorpo de camundongo anti-IL7ra PeCy7ebioSciences25-1271-82
anticorpo de camundongo anti-CD3 BV510BD Biosciences563024
anticorpo de camundongo anti-CD4 BV786BD Biosciences563727
anticorpo de camundongo PE anti-NKp46ebioSciences12-3351-82
StreptavidinSony2626025
PipetaEppendorf
4986000017
Combitips 0,1 ml
L8-10XLS+
AccudropBD Biosciences BD Bio345249FACS
Placas de de 96 poços Affymetrix 75793 100 Aes de de de N de de de de eletrônica Pipeta multicanal 30089405Rainin sciences para

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
  2. Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  3. Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
  4. Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
  5. Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
  6. Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
  7. Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
  8. Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
  9. Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
  10. Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
  11. Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
  12. Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
  13. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
  14. Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
  15. Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
  16. Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Single cell Gene ExpressionMultiplex RT qPCRRare Lymphoid PopulationsInnate Lymphoid CellsHepatic ILC CompartmentFluorescence activated Cell SortingMicrofluidic qPCR ChipPre amplification MixGene Expression HeterogeneityReal time PCR Analysis

Artigos relacionados