Este protocolo usa tanto co-expressão de subunidades e subunidade postlysis mistura para um exame mais aprofundado do conjunto proteassoma recombinante.
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Artigo de método
Examinando Assembleia proteosoma com recombinante Archaea proteasomas e não desnaturante PAGE: The Case for uma abordagem combinada
Neste artigo
Resumo
Resumo
Proteossomas são encontrados em todos os domínios da vida. Eles fornecem a principal via de degradação da proteína intracelular em eucariotas, embora a sua montagem não está completamente esclarecido. Todos os proteasomas conter uma partícula estruturalmente conservada núcleo (CP), ou proteassoma 20S, contendo dois anéis de subunidade beta heptamérico imprensado entre dois anéis de subunidades α heptamérico. Archaea proteosomas 20S são de composição simples em comparação com os seus homólogos eucarióticos, ainda que ambos partilham um mecanismo de montagem comum. Consequentemente, Archaea proteosomas 20S continuam a ser modelos importantes para a montagem do proteassoma eucariótica. Especificamente, a expressão recombinante de 20s archaeal proteasomas juntamente com não desnaturante eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) rendeu muitos insights importantes sobre a biogênese proteassoma. Aqui, discutimos um meio para melhorar a estratégia habitual de co-expressão de α proteassoma e archaea subunidades p antes nondenaturing PAGE. Nós demonstramos que, embora rápida e eficiente, uma abordagem co-expressão por si só pode perder intermediários chave de montagem. No caso de o proteassoma, a co-expressão pode não permitir a detecção da meia-proteassoma, um contendo uma completa α-anel intermédio e uma completa β-anel. No entanto, este intermediário é facilmente detectado por meio de mistura lisado. Sugerimos que a combinação de co-expressão com mistura lisado produz uma abordagem que seja mais aprofundada na análise de montagem, ainda permanece nonintensive trabalho. Esta abordagem pode ser útil para o estudo de outros complexos multiproteicos recombinantes.
Introdução
Complexos multiprotein realizar inúmeras actividades celulares críticas 1. Para muitos desses complexos, muito mais se sabe sobre sua estrutura e função do que cerca sua montagem 2,3. O proteassoma é um tal complexo e é encontrado em todos os domínios da vida. Em eucariotas, esta máquina molecular está no cerne do Sistema Proteasoma / ubiquitina (UPS) e fornece a principal via de degradação da proteína intracelular 4. O proteassoma eucariótica (referido como o proteassoma 26S) é composto de duas principais subconjuntos: um proteassoma 20S, ou partícula central (CP) 5, que pode ser tapado com uma ou ambas as extremidades por....
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Protocolo
1. Expressão Bacteriana.
Nota: Os plasmídeos de expressão usados neste estudo estão descritos na Tabela 1. Soluções, meios, e tampões utilizados neste estudo estão descritos na Tabela 2. A clonagem de genes de subunidade de proteassoma e archaea a geração de plasmídeos de expressão são descritos noutro local 18,20. Em resumo, os plasmídeos para a co-expressão recombinante de subunidades empregar uma estratégia operão bicistrónico que ajuda na obtenção de níveis de expressão comparáveis de subunidades individuais 18,20. Os parâmetros de expressão enumerados abaixo foram....
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Resultados
Montagem de proteassoma (Figura 1) começa quando sub-unidades a combinam-se para 9 formam anéis. Isto pode ser ilustrado quando subunidades alfa do archaeon Methanococcus maripaludis S2 são expressas em E. coli como C-terminal de hexa-histidina com etiquetas (His-tag) derivados (Tabela 1). Quando o α-His recombinante foi purificada por ICAR e analisadas por PAGE não desnaturante, duas bandas foram observadas (Figura 2A, pista 1). Temos demon.......
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Discussão
Nós demonstramos o benefício de uma abordagem combinada à análise de montagem do proteosoma pelo não desnaturante PAGE utilizando proteasomas archaeal recombinantes. O método usual de 9,11 a co-expressão bacteriana de subunidades de proteassoma permite a análise rápida mas pode não revelar intermediários chave de montagem. Sugerimos combinando co-expressão com ligado misturando a desenvolver um quadro mais amplo de eventos de montagem.
A vantagem desta abordagem combinada é que ap.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte por uma fundos de apoio Grant Research (RSFG) da Universidade de Indiana University-Purdue, Indianapolis, e em parte por um prêmio da American Heart Association 14GRNT20390154, a ARK
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de acrilamida (40%) | Biorad | 1610104 | A acrilamida não polimerizada é uma neurotoxina. Use equipamento de proteção adequado |
| Amicon ultra 0.5 mL filtros centrífugos | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Persulfato de amônio | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Kit de ensaio BCA | Pierce | 23225 | |
| Solução de bisacrilamida (2%) | Biorad | 1610142 | |
| Azul | de bromofenolSigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 células competentes | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Reagente de coloração coomassie coloidal para géis |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Sistema de documentação de gel |
| Liberadores de gel | Biorad | 1653320 | Plástico em forma de cunha usado para separar placas de gel; útil para espalhar líquido. |
| Haste de vidro | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glicerol | Sigma | 49767 | |
| Glicina | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Seringa Hamilton | Thermo Fisher | 14-813-38 | Seringa de vidro para carregar géis |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Kit de calibração nativo | GE Healthcare | 170445-01 | Padrões de proteína de alto peso molecular |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Fabricante |
| gradiente Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | Para indução de expressão de proteína |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| sulfato de canamicina | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analítica | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Aparelho de eletroforese em gel |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Inibidor de protease |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Plasmídeo de expressão |
| Precision mais todos os padrões azuis | Biorad | 1610373 | Padrão de proteína molecular para SDS-PAGE |
| Kit de mutagênese Quickchange | Agilent technologies | 200521 | |
| Dodecyl Sulfate de sódio (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Substrato fluorogênico |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Resina de afinidade de cobalto imobilizado |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Triptona | Bacto BD | ||
| bandeja de amostras UV | Biorad | 1708271 | Para imagens UV de géis |
| Extrato de levedura | Bacto BD | 212720 |
Referências
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson,....
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Reimpressões e permissões
