Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

Summary

Descrevemos aqui um protocolo otimizado de ensaios fluorescentes eletroforética de desvio de mobilidade (Femsa) usando SOX-2 proteínas purificadas em conjunto com sondas de DNA infravermelhos fluorescentes marcadas com corante como um estudo de caso para resolver uma questão biológica importante.

Abstract

Ensaios de deslocamento da mobilidade electrof orética (EMSA) são uma ferramenta fundamental para caracterizar as interacções entre proteínas e suas sequências de ADN alvo. A radioactividade tem sido o método predominante de marcação de ADN em EMSAs. No entanto, avanços recentes em corantes fluorescentes e métodos de verificação ter solicitado o uso de marcação fluorescente de ADN como uma alternativa para radioactividade para as vantagens de fácil manuseamento, economia de tempo, reduzindo o custo, e melhorando a segurança. Nós temos usado recentemente EMSA fluorescente (Femsa) para tratar com sucesso uma questão biológica importante. Nossa análise FEMSA oferece uma visão mecanicista sobre o efeito de uma mutação missense, G73E, no altamente conservada fator de transcrição HMG SOX-2 no tipo de neurônio diversificação olfativo. Descobrimos que mutantes SOX-2 proteína ^G73E altera a atividade de ligação específica de DNA, causando transformação neurônio identidade olfativa. Aqui, apresentamos um otimizado e rentável passo-a-passo protocolopara FEMSA usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes e proteínas purificadas SOX-2 (WT e as proteínas mutantes ^G73E SOX-2) como um exemplo biológico.

Introduction

EMSAs são utilizados para a análise da interacção entre o ADN e as proteínas nativas usando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver uma mistura de uma proteína de interesse e uma sonda de ADN marcado contendo potenciais locais alvo da proteína ^1. Uma sonda de ADN ligado com proteína migrarão mais lenta em comparação com uma sonda de ADN livre, e é, por conseguinte, retardado na sua migração através de uma matriz de poliacrilamida. A radiomarcação de ADN por ³² P tem sido o método predominante para a detecção em EMSAs. Embora a aplicação de marcação radioactiva na pesquisa bioquímica tem sido benéfica, os métodos de rotulagem ....

Protocol

NOTA: EMSAs usando sondas de DNA marcadas com fluorescência ou outras formas de ADN marcado partilham os mesmos protocolos para a preparação de proteína ou extracto celular, reacção de ligação proteína-ADN, e a preparação de gel de PAGE e execução (Figura 1A). As principais diferenças são procedimentos de ADN de rotulagem, etapas de processamento gel pós-run, e métodos de detecção.

1. Preparação do gel

1. Prepare 5% de gel de poliacrilamida nativa contendo TBE 0,5x (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM) e 2,5% de glicerol, usando um sistema de mini-gel de proteína (8,3 cm de largura x 7,3 centímetros de espessura comprimento x 0,75 mm).
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Results

Orange G corante de carga (6x: 0,12 g Laranja G em 100 ml de glicerol a 30%) pode ser adicionada à reacção de ligação antes do carregamento para visualizar o progresso da electroforese. Outros corantes de carga, incluindo azul de bromofenol vai ser detectadas durante a análise e, portanto, interferir com a análise de imagem (Figura 1B).

Em alguns casos de EMSAs, especialmente se a preparação de extracto nuclea.......

Discussion

fEMSAs são um instrumento eficaz para investigar interacções DNA-proteínas, e são uma alternativa à marcação radioactiva de ADN. corantes fluorescentes, tais como corantes de infravermelho estão comercialmente disponíveis, e proporcionar um método mais seguro e respeitador do ambiente em relação a marcação de ADN radioactivo. EMSAs usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante não requerem etapas de processamento gel postrun, e, portanto, economizar tempo e custo em comparação com outras técn.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solução de Acrilamida/Bis a 30%, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrilamida é prejudicial e tóxico.
6x-His Epitope Tag Anticorpo (HIS. H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 anticorpo	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Albumina de soro bovino (BSA) grau de biologia molecular	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA	Custom DNA oligo	Estes são referidos como "5'Dye-labeled ou infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" no manuscrito. A empresa sintetizará de forma personalizada oligonucleotídeos de DNA marcados com IRDye de 5 '. Requer mínimo de 100  μ Síntese em escala M e purificação por HPLC.
Fragmento Klenow (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  Célula de Eletroforese Vertical	Bio-Rad	1658000FC	Isso é referido como um 'sistema de mini proteína gel' no manuscrito. Qualquer sistema eletroforético pode ser usado, desde que sejam placas de vidro transparente com menos de 25 cm x 25 cm de tamanho.
Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLx	LI-COR Biotecnologia	Odyssey CLx Sistema de imagem infravermelha	Isso é referido como um 'sistema avançado de imagem infravermelha' no manuscrito.
Sistema de Imagem Odyssey Fc	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Sistema de imagem de modo duplo	Isso é referido como um 'sistema de imagem fluorescente de infravermelho próximo principalmente para Western blots' no manuscrito.
Software Image Studio (versão 4.0)	Software LI-COR Biotechnology	Image Studio	Isso é referido como um 'software de imagem específico' no manuscrito.
Laranja G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Corante			0,25% Laranja G; 30% Glicerol
0,5x TBE			45 mM Tris-Borato; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
5x Tampão			de ligação50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM TDT; 250 μ g/mL BSA