Descrevemos aqui um protocolo otimizado de ensaios fluorescentes eletroforética de desvio de mobilidade (Femsa) usando SOX-2 proteínas purificadas em conjunto com sondas de DNA infravermelhos fluorescentes marcadas com corante como um estudo de caso para resolver uma questão biológica importante.
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Artigo de método
Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ensaios de deslocamento da mobilidade electrof orética (EMSA) são uma ferramenta fundamental para caracterizar as interacções entre proteínas e suas sequências de ADN alvo. A radioactividade tem sido o método predominante de marcação de ADN em EMSAs. No entanto, avanços recentes em corantes fluorescentes e métodos de verificação ter solicitado o uso de marcação fluorescente de ADN como uma alternativa para radioactividade para as vantagens de fácil manuseamento, economia de tempo, reduzindo o custo, e melhorando a segurança. Nós temos usado recentemente EMSA fluorescente (Femsa) para tratar com sucesso uma questão biológica importante. Nossa análise FEMSA oferece uma visão mecanicista sobre o efeito de uma mutação missense, G73E, no altamente conservada fator de transcrição HMG SOX-2 no tipo de neurônio diversificação olfativo. Descobrimos que mutantes SOX-2 proteína G73E altera a atividade de ligação específica de DNA, causando transformação neurônio identidade olfativa. Aqui, apresentamos um otimizado e rentável passo-a-passo protocolopara FEMSA usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes e proteínas purificadas SOX-2 (WT e as proteínas mutantes G73E SOX-2) como um exemplo biológico.
Introdução
EMSAs são utilizados para a análise da interacção entre o ADN e as proteínas nativas usando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver uma mistura de uma proteína de interesse e uma sonda de ADN marcado contendo potenciais locais alvo da proteína 1. Uma sonda de ADN ligado com proteína migrarão mais lenta em comparação com uma sonda de ADN livre, e é, por conseguinte, retardado na sua migração através de uma matriz de poliacrilamida. A radiomarcação de ADN por 32 P tem sido o método predominante para a detecção em EMSAs. Embora a aplicação de marcação radioactiva na pesquisa bioquímica tem sido benéfica, os métodos de rotulagem ....
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Protocolo
NOTA: EMSAs usando sondas de DNA marcadas com fluorescência ou outras formas de ADN marcado partilham os mesmos protocolos para a preparação de proteína ou extracto celular, reacção de ligação proteína-ADN, e a preparação de gel de PAGE e execução (Figura 1A). As principais diferenças são procedimentos de ADN de rotulagem, etapas de processamento gel pós-run, e métodos de detecção.
1. Preparação do gel
- Prepare 5% de gel de poliacrilamida nativa contendo TBE 0,5x (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM) e 2,5% de glicerol, usando um sistema de mini-gel de proteína (8,3 cm de largura x 7,3 centímetros de espessura comprimento x 0,75 mm).
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Resultados
Orange G corante de carga (6x: 0,12 g Laranja G em 100 ml de glicerol a 30%) pode ser adicionada à reacção de ligação antes do carregamento para visualizar o progresso da electroforese. Outros corantes de carga, incluindo azul de bromofenol vai ser detectadas durante a análise e, portanto, interferir com a análise de imagem (Figura 1B).
Em alguns casos de EMSAs, especialmente se a preparação de extracto nuclea.......
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Discussão
fEMSAs são um instrumento eficaz para investigar interacções DNA-proteínas, e são uma alternativa à marcação radioactiva de ADN. corantes fluorescentes, tais como corantes de infravermelho estão comercialmente disponíveis, e proporcionar um método mais seguro e respeitador do ambiente em relação a marcação de ADN radioactivo. EMSAs usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante não requerem etapas de processamento gel postrun, e, portanto, economizar tempo e custo em comparação com outras técn.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa Alfred P. Sloan (para C.-F.C.) e uma bolsa NIH R01 (5R01GM098026-05 para C.-F.C.). Agradecemos a David Crowe pelo acesso ao avançado sistema de imagem infravermelha.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de Acrilamida/Bis a 30%, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrilamida é prejudicial e tóxico. |
| 6x-His Epitope Tag Anticorpo (HIS. H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti-Flag M2 anticorpo | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Albumina de soro bovino (BSA) grau de biologia molecular | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA | Custom DNA oligo | Estes são referidos como "5'Dye-labeled ou infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" no manuscrito. A empresa sintetizará de forma personalizada oligonucleotídeos de DNA marcados com IRDye de 5 '. Requer mínimo de 100 μ Síntese em escala M e purificação por HPLC. |
| Fragmento Klenow (3'-->5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Célula de Eletroforese Vertical | Bio-Rad | 1658000FC | Isso é referido como um 'sistema de mini proteína gel' no manuscrito. Qualquer sistema eletroforético pode ser usado, desde que sejam placas de vidro transparente com menos de 25 cm x 25 cm de tamanho. |
| Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLx | LI-COR Biotecnologia | Odyssey CLx Sistema de imagem infravermelha | Isso é referido como um 'sistema avançado de imagem infravermelha' no manuscrito. |
| Sistema de Imagem Odyssey Fc | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Sistema de imagem de modo duplo | Isso é referido como um 'sistema de imagem fluorescente de infravermelho próximo principalmente para Western blots' no manuscrito. |
| Software Image Studio (versão 4.0) | Software LI-COR Biotechnology | Image Studio | Isso é referido como um 'software de imagem específico' no manuscrito. |
| Laranja G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Corante | 0,25% Laranja G; 30% Glicerol | ||
| 0,5x TBE | 45 mM Tris-Borato; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Tampão | de ligação50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM TDT; 250 μ g/mL BSA |
Referências
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A.
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Reimpressões e permissões
