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Artigo de método

Anticancer eficácia da terapia fotodinâmica com Nanopartículas Lung Cancer segmentadas

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DOI:

10.3791/54865

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1 de dezembro de 2016

 ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

Neste artigo

Resumo

A terapia fotodinâmica (PDT) é uma escolha alternativa para o tratamento do câncer de pulmão. Para aumentar o efeito terapêutico da PDT, foram desenvolvidas nanopartículas direcionadas ao câncer de pulmão combinadas com quimioterapia. Foram avaliadas as eficácias anticancerígenas in vitro e in vivo da TFD com nanopartículas preparadas.

Resumo

A terapia fotodinâmica (PDT) é um método não invasivo e não cirúrgico que representa uma escolha alternativa atraente para o tratamento do câncer de pulmão. Os fotossensibilizadores se acumulam seletivamente no tecido tumoral e levam à morte das células tumorais na presença de oxigênio e no comprimento de onda adequado da luz.

Para aumentar o efeito terapêutico da PDT, desenvolvemos nanopartículas direcionadas ao câncer de pulmão carregadas com agentes fotossensibilizadores e anticâncer. Foram aplicados tanto o direcionamento passivo baseado em efeito de permeabilidade e retenção aprimorada (EPR) quanto o direcionamento ativo baseado em interação com ácido hialurônico-CD44. O CD44 é um receptor de ácido hialurônico bem conhecido que é frequentemente introduzido como um biomarcador de câncer de pulmão de células não pequenas.

Além disso, uma combinação de TFD e quimioterapia é adotada no presente estudo. Este conceito de combinação pode aumentar os efeitos terapêuticos anticancerígenos e reduzir as reações adversas.

Escolhemos a hipocrelina B (HB) como um novo fotossensibilizador neste estudo. Foi relatado que o HB causa maior eficácia anticancerígena da PDT em comparação com os derivados da hematoporfirina1. O paclitaxel foi selecionado como medicamento anticâncer, pois provou ser um tratamento potencial para o câncer de pulmão2.

As eficácias antitumorais da solução fotossensibilizadora (HB), nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida encapsuladas com fotossensibilizador (HB-NPs) e nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida encapsuladas com agente fotossensibilizador e anticâncer (paclitaxel) (HB-P-NPs) após PDT foram comparadas in vitro e in vivo. A fototoxicidade in vitro em células A549 (adenocarcinoma de pulmão humano) e a eficácia antitumoral in vivo em camundongos portadores de tumor A549 foram avaliadas.

O grupo de tratamento com HB-P-NP mostrou o efeito anticancerígeno mais eficaz após a PDT. Em conclusão, os HB-P-NPs preparados no presente estudo representam um potencial e novo sistema de liberação de fotossensibilizadores no tratamento do câncer de pulmão com PDT.

Introdução

A terapia fotodinâmica (PDT) é composta por três fatores principais: fotossensibilizadores, luz e oxigênio. A TFD é relatada como um tratamento promissor para vários tipos de câncer3. Quando os fotossensibilizadores são administrados ao paciente com câncer, eles se acumulam seletivamente nos tecidos tumorais. Quando o comprimento de onda adequado da luz é aplicado, o oxigênio singlete altamente reativo e outros radicais livres levam a danos às células tumorais4.

O câncer de pulmão foi introduzido como uma das primeiras aplicações para PDT no início dos anos 19805. A PDT oferece várias vantagens no tratamento do câncer de pulmão. Como a TFD é um tratamento não invasivo e não cirúrgico, é uma escolha alternativa atraente para os pacientes nos quais a ressecção cirúrgica é inadequada.

Tem havido muitos desafios para aumentar a eficácia dos fotossensibilizadores no combate ao câncer. Aumentar o acúmulo de fotossensibilizadores em locais de câncer e diminuir o acúmulo em tecidos normais são os objetivos idênticos para os estudos direcionados ao câncer. Uma variedade de sistemas de liberação de fármacos direcionados, como polímeros, lipossomas e nanopartículas, são adotados como portadores fotossensibilizadores6-8. Em nossos estudos anteriores, as nanopartículas aumentaram efetivamente as habilidades de direcionamento do câncer dos fotossensibilizadores9,10. As nanopartículas são portadoras ideais para o câncer, pois possuem habilidades passivas e ativas de direcionamento. Os vasos tumorais com vazamento oferecem oportunidade para que os transportadores nanométricos se acumulem facilmente nos tumores, o que é conhecido como efeito de permeabilidade e retenção aprimorada (EPR)11,12. A interação entre as nanopartículas e os receptores específicos nas células cancerígenas permite o direcionamento ativo do câncer. Neste estudo, preparamos nanopartículas à base de ácido hialurônico para interagir com CD44, o principal receptor de ácido hialurônico que é superexpresso em células de câncer de pulmão13.

Para maximizar a eficácia anticancerígena, uma combinação de TFD e quimioterapia é adotada no presente estudo. Este conceito de combinação pode permitir um efeito terapêutico aumentado. Além disso, doses reduzidas do fotossensibilizador e do medicamento anticâncer podem diminuir os efeitos adversos. Selecionamos a hipocrelina B (HB) como um novo fotossensibilizador no presente estudo. HB é isolado do fungo medicinal chinês Hypocrella bambuase. Shang et al. relataram que a TFD baseada em HB possui uma eficácia anticancerígena maior quando comparada àTFD 1 baseada em derivados de hematoporfirina. O paclitaxel foi selecionado como medicamento anticâncer, pois provou ser um tratamento potencial para vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão2.

Aqui, comparamos as eficácias anticancerígenas da solução fotossensibilizadora (hipocrelina B, HB), nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida encapsuladas em fotossensibilizador (HB-NPs) e nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida encapsuladas em agente fotossensibilizador e anticâncer (paclitaxel) (HB-P-NPs) após PDT. A fototoxicidade in vitro em células A549 (adenocarcinoma de pulmão humano) e a eficácia antitumoral in vivo em camundongos portadores de tumor A549 foram avaliadas.

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Protocolo

NOTA: Todos os protocolos de estudo com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Seul Bundang National University Hospital (BA1308-134 / 072-01).

1. Síntese de ácido hialurônico-ceramida (HACE)

  1. Solubiliza-se 12,21 mmol de ácido hialurónico (HA) de oligómero e 9,77 mmol de tetra-n-butilamónio hidróxido (TBA) em 60 ml de água duplamente destilada (ADD). Agita-se durante 30 min.
  2. Para sintetizar o ligante DS-Y30, dissolve-se 8,59 mmol de ceramida DS-Y30 e 9,45 mmol de trietilamina em 25 ml de tetra-hidrofurano (THF). Misturar com 8,59 mmol de cloreto de 4-clorometilbenzoilo em THF. Agita-se durante 6 h a 60 ° C.
  3. Dissolve-se a 8,10 mmol sintetizado de HA-TBA e 0,41 mmol de ligante DS-Y30 em uma mistura de THF e acetonitrilo (4: 1, v / v). Agita-se durante 5 h a 40 ° C.
  4. Remover as impurezas por filtração com um filtro de agente, e eliminar o solvente orgânico por evaporação sob vácuo. Purifica-se o produto usando uma membrana de diálise (peso molecular de corte: 3,5 kDa) e liofilizar.

2. Preparação das nanopartículas

  1. Dissolve-se 1 mg de HB e 1 mg de paclitaxel em 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) e misturam-se com 0,5 ml de DDW por vortex para mistura durante 5 min. Em seguida, solubilizar HACE nessa mistura por vórtice de mistura durante mais 5 min.
  2. Para eliminar o solvente, aquece-se a 70 ° C durante 4 horas sob uma corrente suave de azoto gasoso.
  3. Ressuspender o filme composto por HACE, HB, e paclitaxel com 1 ml de DDW. Filtrar com um filtro de seringa (0,45 um de tamanho de poro) para remover droga não encapsulados.

3. A fototoxicidade in vitro

  1. A absorção de nanopartículas em linhas de células de câncer de pulmão
    1. Prepare (v / v) de soro de meio RPMI-1640 a 10% contendo meio de bovino fetal e 1% (w / v) de penicilina-estreptomicina.
    2. Semente células A549 em placas de cultura celular de 24 poços a uma densidade de 1 x 10 5 células / poço (triplicados para cadagrupo). Incubar durante 24 horas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 e 95% de ar.
    3. Após a fixação das células, remover o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    4. Dissolve-se as nanopartículas em PBS para uma concentração final de 2 jiM / ml HB. Em seguida, incubar as células com 1 ml de PBS, o NPS vazios, HB-NPs, ou HB-P-NPs em cada poço durante 4 horas no escuro.
    5. Remove toda a solução e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Adicionar meio de cultura fresco.
  2. ensaio de viabilidade celular
    1. Colocar a placa de cultura celular sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra TFD ao poço). Usar óculos de segurança do laser e iluminar as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm2), no escuro durante vários períodos de tempo: 0, 5, 10, 20, 30, e 40 seg (0, 2, 4 , 8, 12, e 16 J / cm 2). Em seguida, as células incubar durante 24 horas no escuro.
    2. Aspirar o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez.
    3. Adicionar 10 ul de solução de medição da citotoxicidade de cada poço. Incubar no escuro durante 2 horas.
    4. Medir a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.
  3. A análise microscópica
    1. Colocar a placa de cultura celular sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra TFD ao poço). Use óculos de segurança a laser e iluminar as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) no escuro, durante 0, 20 ou 40 segundos (0, 8, ou 16 J / cm 2). Em seguida, as células incubar durante 24 horas no escuro.
    2. Aspirar o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez.
    3. Adicionar 50? L de anexina V-FITC e 50 ul de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1,5 ug / ml). Agitar suavemente a placa e incubar-lo por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
      NOTA: Use anexina V-FITC a partir do kit de microscópio de fluorescência.
    4. Lavam-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Manter as células em PBS fresco. Identificar as células em apoptose utilizando um microscópio óptico com ampliação de 100X.
  4. separação de células activadas por fluorescência (FACS)
    1. Colocar a placa de cultura celular sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra TFD ao poço). Use óculos de segurança a laser e iluminar as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) para 0, 20 ou 40 segundos (0, 8, ou 16 J / cm 2). Em seguida, as células incubar durante 24 horas no escuro.
    2. Aspirar o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez.
    3. Ressuspender as células em 1 ml de 1 × tampão de ligação (diluído 1 parte de tampão de ligação 10x; 0,1 M de Hepes / NaOH (pH 7,4), NaCl 1,4 M, e 25 mM de CaCl 2 a 9 partes de água destilada) e transferência de 100 uL da solução de amostra para a 5 mltubo de cultura.
    4. Adicionar 5 uL de anexina V-FITC e 5 ul de iodeto de propídio (PI). Suavemente vortex do tubo e incubar durante 15 min à temperatura ambiente (TA) no escuro. Adicionar 400 mL de 1 × tampão de ligação.
      NOTA: Use anexina V-FITC e PI a partir do kit microscópio de fluorescência.
    5. Identificar as células apoptóticas por SCAF usando 14. As linhas de laser de excitação PI e anexina V-FITC são 488 nm e 635 nm, respectivamente. Medir a emissão de fluorescência de PI e anexina V-FITC a 610 ± 20 nm e 660 ± 20 nm, respectivamente. Recolher as células adquiridas no citômetro de fluxo por 10.000 eventos.

4. eficácia anticancerígena in vivo In em ratos portadores de tumores

  1. modelo do rato induzida por câncer de pulmão
    1. Prepare 1 × 10 6 células A549 em 0,1 ml de meio RPMI-1640; mantê-lo em gelo.
    2. Anestesiar os ratos com uma injecção IP de xilazina e uma uma mistura de tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Confirmar anesthetization adequada por beliscar suavemente uma pequena dobra de pele mouse. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
      NOTA: Se não se observa qualquer movimento, o animal é anestesiado suficientemente para iniciar as experiências.
    3. Injectar as células subcutaneamente nos flancos de ratinhos BALB restantes ratinhos nu / C macho (6 - 7 semanas de idade, 20-22 g).
    4. Mantenha observando os ratos até que eles começam a se mover ao redor da gaiola.
      NOTA: Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente. Mantenha os ratos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos (SPF).
    5. Medir o tamanho do tumor com compassos de calibre de cada dia. Calcular o volume do tumor (mm 3) como (comprimento x largura 2) / 2. Quando o tamanho do tumor atingir cerca de 200 mm 3 em volume, a iniciar a experiência.
  2. estudo de eficácia Anticancer
    1. Aleatoriamente dividir os ratos em 4 grupos (n = 10 para cada grupo).
    2. Anestesiar os ratos com uma injecção IP de xilazina e uma uma mistura de tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar anesthetization adequada por beliscar suavemente uma pequena dobra de pele mouse. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
      NOTA: Se não se observa qualquer movimento, o animal é anestesiado suficientemente para iniciar as experiências.
    3. Dissolve-se as nanopartículas em PBS para uma concentração final de 2 mg / ml HB. Injectar PBS, livre HB, HB-NPs, ou HB-P-PN através da veia caudal (2 mg / kg como HB) duas vezes nos dias 0 e 7.
    4. Mantenha observando os ratos até que eles começam a se mover ao redor da gaiola.
      NOTA: Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmenterecuperado. Mantenha as gaiolas escuro e em condições SPF específicos.
    5. 24 h após cada injecção, anestesiar os ratos com uma injecção IP de xilazina e uma uma mistura de tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar anesthetization adequada por beliscar suavemente uma pequena dobra de pele mouse. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
      NOTA: Se não se observa qualquer movimento, o animal é anestesiado suficientemente para iniciar as experiências.
    6. Colocar o sítio do tumor sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra de PDT para o tumor). Use óculos de segurança laser, desligar o interruptor, e iluminar o tumor com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) para 500 segundos (200 J / cm 2) duas vezes nos dias 1 e 8.
    7. Mantenha observando os ratos até que eles começam a se mover ao redor da gaiola. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que tem undergone cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
    8. Mantenha as gaiolas em condições SPF. Manter as gaiolas no escuro durante 24 horas após o tratamento a laser.
    9. Monitorizar visualmente o volume do tumor e as alterações no local do tumor a cada dia. Medir o tamanho do tumor com compassos de calibre, e calcular o volume como (comprimento x largura 2) / 2 (mm 3). Tirar fotos dos locais de tumor todos os dias para verificar se há alterações de superfície do tumor após PDT.
    10. No dia 16, sacrifica cinco ratinhos por grupo por anestesia terminal usando isoflurano.
    11. Com uma pinça e tesouras, corte a pele exterior e expor os tumores 15. Cuidadosamente colhê-las. Corrigi-los em formol 10%, incorporá-los em parafina e manchá-las com hematoxilina e eosina (H & E) para a análise histológica 16.
    12. Após 45 dias de monitoramento, sacrificar os ratinhos restantes pela anestesia terminal usando isoflurano.

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Resultados

Nós preparamos tanto HB-NPs e HB-P-NPs com as técnicas acima mencionadas. Os diâmetros médios de HB-NPs e HB-P-NPs foram 220,9 ± 3,2 nm e 211,9 ± 1,6 nm, respectivamente.

A viabilidade celular das células A549 após 4 h de incubação com PBS, o NPS vazios, HB-PN, e HB-P-NPs seguido por irradiação de luz (0-16 J / cm 2) é mostrada na Figura 1. Sem luz, o grupo de tratamento HB-NP mostrou nenhuma citoto...

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Discussão

O passo mais crítico neste estudo é selecionar as condições de laser adequados: comprimento de onda, poder e tempo de irradiação. O comprimento de onda de luz apropriado adequado para o fotossensibilizador específico é necessário para o PDT. Nós usamos um laser de 630 nm, que era apropriado para hipocrelina B. A potência de saída foi outro fator importante, que foi fixado em 400 mW / cm 2 com base em vários estudos-piloto. Potências de saída superior a 400 mW / cm 2 danificado as células ou a super...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por nenhuma subvenção. 14-2014-017 do Fundo de Investigação SNUBH.

Os autores agradecem a J. Patrick Barron, professor emérito da Universidade de Tóquio Médico e Professor Adjunto, Seoul National Bundang Hospital Universitário para a sua edição pro bono deste manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ácido hialurônico oligoBioland Co., Ltd._
DS-Y30 (ceramida 3B; principalmente N-oleoil-fitoesfingosina)Doosan Biotech Co., Ltd._
ácido adípico di-hidrazidaSigma AldrichA0638
N-(3-dimetilaminopropil)-N′ < / em>-etilcarbodiimidaSigma Aldrich39391
cloreto de 4-(clorometil) benzoílaSigma Aldrich270784
Tween 80Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0546
Sartorius Stedim Biotech GmbH1776215 mm, RC, PP, 0,45 µ m
trietilaminaSigma AldrichT0886
Mini-GeBAflex tubosGene Bio-Application Ltd.D070-12-100
PaclitaxelTaihua Corporations_
RPMI-1640Gibco Life Technologies, Inc.11875
Penicilina– estreptomicinaGibco Life Technologies, Inc.15070
Soro fetal bovinoGibco Life Technologies, Inc.
Celite (agente filtrante)Sigma Aldrich6858Veja a etapa 1.4
Filtro de seringa 16140071

Referências

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