Artigo de método

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia + Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

DOI:

10.3791/54881

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23 de dezembro de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Miami

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para enumerar e caracterizar macaco rhesus células T CD8 + contra o vírus da AIDS. Este artigo é útil não só para o campo da imunologia do HIV, mas também a outras áreas de investigação biomédica, onde são conhecidas respostas de células T CD8 + de afectar a evolução da doença.

Resumo

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Péptido-histocompatibilidade principal de classe complexo I (pMHC-I) tetrâmeros têm sido uma ferramenta de valor inestimável para estudar as respostas de células T CD8 +. Porque estes reagentes se ligam directamente aos receptores de células T na superfície das células CD8 + T-linfócitos, tetrâmeros marcado com fluorocromo pMHC-I permitir a detecção exacta do antigénio (Ag) espec�ico CD8 + células-T, sem a necessidade de re in vitro -estimulação. Além disso, quando combinado com multi-color citometria de fluxo, pMHC-I tetrâmero coloração pode revelar aspectos-chave de células T CD8 + Ag específicas, incluindo-estágio de diferenciação, fenótipo de memória e estado de activação. Estes tipos de análises têm sido especialmente úteis no campo da imunologia do HIV, onde células T CD8 + podem afectar a progressão para SIDA. infecção experimental de macacos rhesus com vírus da imunodeficiência símia (SIV) fornece uma ferramenta valiosa para estudar a imunidade celular contra o vírus da AIDS. Como resultado, progre considerávelSS foi feita para definir e caracterizar as respostas de células T neste modelo animal. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para enumerar as células T SIV específicas de CD8 + em macacos rhesus por pMHC-I tetrâmero coloração. Nosso ensaio permite a quantificação e memória fenotipagem simultânea de duas populações de células T pMHC-I tetrâmero + CD8 + por teste, que pode ser útil para rastrear respostas específicas-SIV de células T CD8 + geradas pela vacinação ou infecção pelo SIV. Considerando a relevância dos primatas não humanos na investigação biomédica, esta metodologia é aplicável para estudar as respostas das células T CD8 + em múltiplas configurações de doença.

Introdução

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As células T CD8 + compreendem um componente crucial do sistema imune adaptativo que eles participam no tumor vigilância imune e contribuir para a erradicação dos agentes patogénicos intracelulares 1. Em termos simples, as células T CD8 + expressam receptores de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o péptido-classe principal de histocompatibilidade complexo I (pMHC-I) moléculas presentes na membrana plasmática das células hospedeiras. Uma vez que estes péptidos são derivados a partir da proteólise de proteínas sintetizadas endogenamente, pMHC-I da superfície da célula complexos de fornecer uma janela para o meio intracelular. Após a infecção de vírus, por exemplo, as células infectadas irão exibir moléculas de CPH-I que contêm péptidos derivados de vírus que podem servir como ligandos para TCR expressas pelo que patrulha células T CD8 +. No caso de uma célula T CD8 + específicos do vírus encontra uma célula infectada que apresenta o seu ligando pMHC-I, o envolvimento do TCR irá resultar na activação de células T CD8 + e ultimadamente levar a célula alvo de lise. Dada a natureza crítica dessas interações TCR / pMHC-I, a determinação da magnitude, especificidade e fenótipo de responder as células T CD8 + podem muitas vezes revelar pistas importantes sobre doenças humanas.

Até o início de 1990, a quantificação de células T Ag específicos de CD8 + invocado o ensaio tecnicamente exigente diluição limitante (LDA) 2,3. Não só a LDA requerem vários dias para ser concluído, ele também não conseguiu detectar células que não tinham potencial proliferativo. Como resultado, o LDA vastamente subestimado a frequência real do antigénio (Ag) + células-T CD8 espec�icos participantes em uma resposta imune. Embora o desenvolvimento de ELISPOT e ensaios de coloração de citocinas intracelulares melhorou grandemente a capacidade de medir a imunidade celular, estes métodos ainda necessário na estimulação in vitro para quantificar as células T específicas de Ag-4. Não foi até 1996 que Altman, Davis, e colleagues publicaram seu marco artigo relatando o desenvolvimento da tecnologia de tetrâmero pMHC-I 5. Crítica para o sucesso desta técnica foi a multimerização de moléculas pMHC-I, que se estendia a meia-vida de interacções TCR / pMHC-I, reduzindo deste modo a probabilidade de tetrâmeros pMHC-I que caem fora durante os passos de lavagem de ensaios de citometria de fluxo. A principal vantagem de tetrâmeros pMHC-I durante os ensaios acima mencionados é a capacidade de detectar com precisão as células T Ag-CD8 + específica directamente ex vivo, sem a necessidade de in vitro re-estimulação. Além disso, a combinação de pMHC-I tetrâmero coloração com multi-cor citometria de fluxo permitiu uma análise detalhada do andar de diferenciação, fenótipo de memória, e o estado de activação das células T CD8 + específicas de células Ag-2-4. À luz dos recentes avanços técnicos para a caracterização de repertórios de células T CD8 + por pMHC-I multimero coloração 6, a amplitude de aplicações for esta metodologia é provável que continue em expansão.

Poucas áreas da pesquisa biomédica beneficiaram mais do pMHC-I tetrâmero coloração do que o campo da imunologia HIV 7. Embora as células T CD8 + foi temporariamente associado com o controle inicial de viremia HIV no momento da publicação por Altman, Davis, e seus colegas 8,9, o uso de tetrâmeros pMHC-I nos anos seguintes expandiu significativamente a nossa compreensão da o HIV-resposta específica das células T CD8 +. Por exemplo, pMHC-I tetrâmero coloração ajudou a confirmar o tamanho robusta de respostas de células T CD8 + específicas do vírus, na maioria dos indivíduos infectados com HIV 10-12. Esta metodologia também facilitou a caracterização de HIV e respostas de células T específicas de SIV CD8 + restringidos por moléculas de MHC-I associados com um controle espontâneo de replicação virai na ausência de terapia anti-retroviral, um fenómeno conhecido como "controlo de elite" 13-15. Além disso, pMHC-I tetrâmeros foram instrumental no estabelecimento do eixo morte programada 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) como uma via reversível para o fenótipo disfuncional de HIV-específicas CD8 + células-T na infecção crônica não controlada 16,17. Coletivamente, esses estudos ressaltam a utilidade de tetrâmeros pMHC-I para monitorar as respostas de células T CD8 + contra o vírus da AIDS.

Infecção experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) continua a ser o melhor modelo animal para avaliação das intervenções imunes contra o HIV / AIDS 18,19. Nos últimos 25 anos, um progresso substancial tem sido feito na identificação e caracterização de células T CD8 específicas SIV-+ nesta espécies de macacos, incluindo a descoberta de alelos de MHC-I e a definição de ligação ao péptido motivos 13,20-27 . Como resultado, I-pMHC tetrâmeros ter sido desenvolvido para a análise de SIV-específica de células T CD8 +respostas neste modelo animal 28. A maioria destes reagentes são feitas dos produtos de gene de quatro macaco rhesus alelos do MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. De nota, macacos rhesus não expressam um locus MHC-C 29. A grande maioria dos tetrâmeros pMHC-I utilizados nas presentes experiências foram produzidas no Centro de NIH tetrâmero Núcleo da Universidade de Emory. No entanto, alguns destes reagentes, incluindo Mamu-A1 * 001 tetrâmeros ligados ao imunodominante epitopo Gag CM9, só pode ser obtido a partir de fontes comerciais devido a acordos de licenciamento. Usando tetrâmeros pMHC-I dos quatro alelos rhesus listados acima, temos enumerado com êxito as células T CD8 + contra um total de 21 epitopos SIV (Tabela 1), que foram induzidos por vacinação ou infecção pelo SIV primário 30,31 (Martins et al., observações não publicadas).

O presente manuscrito fornece umaoptimizado pMHC-I protocolo de coloração do tetrero para a determinação do fenótipo de células T específicas SIV-CD8 + frequência e memória em macacos rhesus. O ensaio começa com um electiva 30 min de incubação com um inibidor de proteína cinase (PKI; aqui, dasatinib é utilizado), a fim de diminuir a internalização de TCR e, assim, melhorar a pMHC-I tetrâmero coloração 32. Como descrito abaixo, o tratamento é especialmente útil quando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. Instruções sobre como rotular as células com tetrâmeros pMHC-I fluorocromo conjugado e anticorpos monoclonais (mAbs) também são fornecidos. Este protocolo inclui também um passo para a permeabilização celular para a detecção intracelular da molécula associada à citólise granzima B (GZM B). O anticorpo monoclonal contra CD3 é adicionado neste passo, assim como para melhorar a detecção desta molécula de sinalização de TCR. Como uma referência, todos os fluorocromos utilizados no presente painel de coloração são listados.

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Protocolo

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As amostras de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) utilizados neste manuscrito foram obtidos a partir de macacos rhesus Indiana alojados no Wisconsin National Primate Research Center. Estes animais foram tratados de acordo com o Relatório de Weatherall sob um protocolo aprovado pela Universidade de Wisconsin Animal Care Graduate School e Use Committee 33. Todos os procedimentos com animais foram realizados sob anestesia e todos os esforços foram feitos para minimizar o potencial sofrimento.

1. Tratamento de PKI

NOTA: Este é opcional, mas recomendado para Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. Ver Resultados e Discussão.

  1. Ressuspender de PBMC em meio de R10 a uma concentração de 1,6 x 10 7 células / ml.
  2. Adicionar 50 ul desta suspensão de células para o fluxo de citometria de tubos correspondente. Adicionar 50 ul de uma solução 100 nM de PKI para cada tubo.
  3. Vortex cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 30 min. No final destapasso, cada tubo deve ter 100 ul de uma suspensão de células contendo 8,0 x 10 5 PBMC e 50 nM de PKI.
  4. Prossiga para a etapa de coloração tetrâmero pMHC-I.

2. A coloração com fluorocromo rotulados pMHC-I tetrâmeros

  1. Antes de preparar a pMHC-I tetrâmero mistura principal, centrifugar os tubos pMHC-I tetrâmero a 20000 xg durante pelo menos 15 min a 4 ° C. O objectivo deste passo é para sedimentar agregados de proteína na solução de tetrâmero pMHC-I, que pode aumentar a coloração de fundo. Uma vez que o passo de centrifugação é feito, evitar pipetagem a partir do fundo do tubo, onde os agregados de proteína terá acumulado.
  2. Prepare o suficiente pMHC-I master mix tetrâmero para manchar todos os tubos experimentais. Preparar um excesso de 15% do volume total da mistura principal para esta conta para a pipetagem de erro.
  3. Diluir tetrâmeros pMHC-I em tampão de coloração (por exemplo, tampão de coloração brilhante), de modo que 25 ul da pMHC-I tetrâmero de mistura principal são added para cada teste.
    1. Etiqueta de PBMC com dois tetrâmeros pMHC-I por teste; um conjugado com aloficocianina (APC) e o outro para violeta brilhante (BV) 421.
  4. Adicionar 8,0 x 10 5 PBMC para o fluxo correspondente citometria de tubos em um volume final de 100 ul. Se as células foram submetidas ao tratamento acima descrito de PKI, eles já devem ser ressuspensas em 100 ul neste passo.
  5. Adicionar 25 ul de I-pMHC tetrâmero mistura principal para o fluxo de citometria de tubos correspondente. No final desta etapa, o volume final em cada tubo deve ser de 125 uL.
  6. Vortex cada tubo, a fim de homogeneizar a suspensão de células.
  7. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 45 min. Prepara-se o cocktail mAb de coloração da superfície durante este 45 minutos de incubação.

Coloração 3. Superfície

  1. Prepare o suficiente master mix mAb para corar todos os tubos experimentais. Preparar um excesso de 15% do volume total da mistura principal para esta contapara a pipetagem de erro.
  2. Ajustar o volume da mistura principal com tampão de coloração de modo que 50 ul são adicionados por teste.
  3. Para exclusão adequado de células T CD8 + não-e delineação de subconjuntos de memória, usar quantidades de mAbs dirigidos contra as seguintes moléculas na mistura principal a coloração da superfície titulado.
    NOTA: Os conjugados com fluorocromos cada mAbs são fornecidas como referência: CD14 BV 510, 510 BV CD16, CD20 BV 510, 785 CD8a BV, CD28 PE Cy7, e CCR7 com FITC. Note-se que os mAbs contra CD14, CD16, CD20 e são conjugados com o mesmo fluorocromo (isto é, BV 510), uma vez que irá ser incluído na porta "dump".
  4. Incluir um corante solucionáveis para discriminar células mortas na mistura principal manchas na superfície [ie, amina corante reativo (ARD)]. Certifique-se de que o reagente de ARD é conjugado com um fluorocromo com um espectro de emissão semelhante como os usados ​​na porta "dump". Neste caso, use ARD Aqua.
  5. Adicionar 50 ul dea mistura principal de coloração descrito no 3,1-3,4 para o fluxo de citometria de tubos correspondente. No final desta etapa, o volume final em cada tubo deve ser de 175 uL.
  6. Vortex cada tubo. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 25 min.
  7. Lavar as células com tampão de lavagem (solução de PBS contendo 0,1% de albumina de soro de bovino e 0,45 g / L de NaN 3).
    CUIDADO: Sodium azide é uma substância tóxica. A exposição a quantidades até mesmo hora podem causar sintomas. Lidar com esta substância de acordo com as diretrizes especificadas pela Saúde Ambiental e Gabinete de Segurança (EHS) na instituição em que essas experiências estão sendo realizadas.
  8. tubos de centrífuga a 510 xg durante 5 min. Decantar cuidadosamente o sobrenadante para um recipiente de resíduos separado. Certifique-se para não perturbar o sedimento.
    CUIDADO: Não decantar lavagem sobrenadante em tampão de reservatórios que contêm lixívia, uma vez que pode reagir com a azida de sódio presente no tampão de lavagem e resultar na formação de um gás tóxico 34. CONTACTO o Escritório EHS na instituição em que essas experiências estão sendo realizadas para obter orientações sobre como eliminar os azida de sódio.
  9. Após decantação, vortex as células no líquido restante retido em cada tubo.

Fixação 4. celular

  1. Adicionar 250 ul de uma solução a 2% de paraformaldeído (PFA) a todos os tubos para fixar as células.
    CUIDADO: PFA é uma substância tóxica. A exposição a quantidades até mesmo hora podem causar sintomas. Lidar com esta substância de acordo com as orientações especificadas pelo Escritório EHS na instituição em que essas experiências estão sendo realizadas.
    1. Uma vez que a solução de 2% de PFA deve ser isotónica com as células, utilizar PBS para preparar esta solução. Cem mililitros de uma solução 2% de PFA é suficiente para várias experiências. Agitar bem em vórtice todos os tubos imediatamente após a adição de 2% de PFA, a fim de evitar a formação de agregados de células.
  2. Incubar no escuro a 4 ° C durante 20 min.
  3. Wcélulas de cinzas por repetindo os passos 3,7-3,9. Uma vez que este passo está terminado, as células podem ser armazenadas no escuro a 4 ° C durante 24-48 hr. Antes de prosseguir para a fase de permeabilização, vortex cuidadosamente os tubos.

5. permeabilização de células

  1. Adicionar 500 ul de tampão de permeabilização. Vortex todos os tubos.
  2. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 min.
  3. Lave as células, repetindo os passos 3,7-3,9.

6. intracelular Coloração

  1. Prepare o suficiente master mix mAb para corar todos os tubos experimentais.
  2. Ajuste o volume com PBS ou tampão de coloração de modo que 50 ul da mistura principal intracelular mAb são adicionados por teste.
  3. Preparar a mistura de mestre mAb descrito em 6.1 e 6.2 usando quantidades de mAbs dirigidos contra CD3 e GZM B. titulada
    NOTA: envolvimento do TCR pelo tetrâmeros pMHC-I pode resultar em CD3 internalização, o que pode interferir com a detecção do tetrâmero de CD8 + CD3 + +As células T, se o anti-CD3 mAb é adicionada à mistura principal de manchas na superfície. Para evitar isto, adicionar o anti-CD3 mAb, nesta fase, que é, depois as células são permeabilizadas. Os conjugados com fluorocromos cada mAb são listados como referência: CD3 PerCP Cy5.5 e GZM B PE.
  4. Adicionar 50? L de mAb Cocktail aos tubos correspondentes. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Lave as células, repetindo os passos 3,7-3,9. Os tubos estão prontos para ser adquirida em um citômetro de fluxo.

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Resultados

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O protocolo aqui descrito foi usado para determinar a magnitude e a memória de fenótipo, as respostas de células T induzidas por vacina Gag CM9-específicas de CD8 + em uma Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Para esta análise, um tetrâmero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 APC-conjugado foi usado em um painel de coloração de citometria de fluxo de 8 cores. Figura 1A - F mostra a estratégia gating usado para analisar os dados, que devem ser aplicadas...

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Discussão

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A poucos passos nesta discussão mérito procedimento como eles são cruciais para produzir resultados ideais. Em primeiro lugar, uma vez que a qualidade das amostras biológicas é um forte indicador de sucesso de qualquer ensaio de citometria de fluxo 38, devem ser tomados todos os cuidados para garantir que as células são viáveis e em suspensão durante o processo de coloração. Isto é particularmente relevante quando se trabalha com amostras criopreservadas, uma vez que são mais propensas a aglomeração e normalm...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Nós gostaríamos de agradecer a David Watkins para apoiar os experimentos que permitiram a otimização da presente metodologia. Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiado em parte por uma concessão piloto fornecido pelo Centro de Miami para Pesquisa da AIDS dos Institutos Nacionais de Saúde com o número prêmio P30AI073961. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DasatinibAxon medchemAxon  1392Deve ser ressuspenso em DMSO e imediatamente armazenado a -20 &graus; C
RPMI com Glutamaxgibco/ Life Technologies61870-036Deve ser armazenado a 4 &graus; C 
Calor Inativado FBSgibco/ Life Technologies10082-147Deve ser armazenado a 4 &graus; C 
Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina BLonza17-745EDeve ser armazenada a 4 &graus; C 
DMSO, AnhydrousLife TechnologiesD12345Armazene em temperatura ambiente.
Tubos de polipropileno de fundo redondo de 5 mlVWR60819-728
Tetrâmeros pMHC-I conjugados com fluorocromoNIH Tetramer Core ou MBL, Inc.Deve ser armazenado e mantido a 4 graus C. Centrifugue a 20.000 x g por 15 min antes de usar. Não congele.
mAbs conjugados com fluorocromoVárias empresasDevem ser armazenados e mantidos a 4 graus C. Não congele.
VIVO/MORTO  Aqua Consertável  Morto  Kit de Mancha de CélulaLife Technologiesl34957Deve ser armazenado a -20 °C. Ressuspenda cada alíquota em 50 μ l de DMSO antes do uso.
Tampão de Mancha BrilhanteBD Biosciences563794Deve ser armazenado em  4   C 
Phosphate Buffered SalineVWR97064-158Armazenar à temperatura ambiente
Albumina BovinaVWR700011-230Deve ser armazenado a 4   C 
Azida de sódioVWR97064-646Armazenar à temperatura ambiente. Substância tóxica. Não misture com água sanitária.
AlvejanteVWR89501-620Produto químico corrosivo, não pode ser misturado com azida de sódio. Manuseie com cuidado
Ciências de Microscopia Eletrônicade Paraformaldeído15714-SReagente inflamável, corrosivo e tóxico. Manuseie com cuidado
Polissorbato 20 (Tween-20)Alfa AesarL15029Armazene à temperatura ambiente
Solução de Permeabilização 2 BD Biosciences340973Reagente tóxico e corrosivo. Manuseie com cuidado
Tubos Sarsdet 1.5 ml com tampa de roscaVWR72.692.005
2.0 ml DNA/RNA Tubos de baixa ligaçãoEppendorf22431048O uso de microtubos estéreis é preferido 
Misturador de vórticeA critério do cientista
Gabinete de Biossegurança A critério do cientista
Milli Q Intergral Sistema de purificação de águaEMD MilliporeZRXQ010WWde grau de biologia molecular de qualquer fornecedor pode ser usada
MicrocentrífugaA critério do cientista
CentrífugaA critério do cientista
4 ° C  refrigeradorA critério do cientista
BD LSR IIBD BiosciencesO citômetro de fluxo deve conter lasers e filtros compatíveis com o painel de coloração usado.
água
VWR SCIENTIFIC INC.89068-738
IncubadoraDeve ser capaz de manter 37 ° C  temperatura interna
Software FACS DivaBiosciences
Software Flowjo versão 9.6FlowjoUtilizado para analisar arquivos FCS gerados pelo software FACS Diva
de micropippette
água Folha de alumínio de deionizada BD Pontas

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
  2. Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
  3. Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
  4. Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
  5. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  7. Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  8. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
  9. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
  10. Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
  11. Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
  12. Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
  13. Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
  14. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
  15. Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
  16. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
  17. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
  18. Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
  19. Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
  20. Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
  21. Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
  22. Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
  23. Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
  24. Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
  25. Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
  26. Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
  27. Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
  28. Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
  29. Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
  30. Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
  31. Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
  32. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  33. Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152(2006).
  34. Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
  35. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  36. Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
  37. Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
  38. Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
  39. Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316(2011).
  40. Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145(2015).

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