Method Article

Combinando Wet and Dry técnicas de laboratório para orientar a cristalização de grandes espiral enrolada contendo proteínas

DOI:

10.3791/54886

⸱

January 6th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos uma estrutura que incorpora análise bioquímica e computacional direta para orientar a caracterização e cristalização de grandes domínios de bobina enrolada. Essa estrutura pode ser adaptada para proteínas globulares ou estendida para incorporar uma variedade de técnicas de alto rendimento.

Abstract

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A obtenção de cristais para determinação da estrutura pode ser uma proposta difícil e demorada para qualquer proteína. Proteínas e domínios de bobina enrolada são encontrados em toda a natureza, no entanto, devido às suas propriedades físicas e tendência a agregar, são tradicionalmente vistos como especialmente difíceis de cristalizar. Aqui, utilizamos uma variedade de técnicas rápidas e simples projetadas para identificar uma série de possíveis limites de domínio para uma determinada proteína de bobina enrolada e, em seguida, caracterizar rapidamente o comportamento dessas proteínas em solução. Com a adição de uma etiqueta fortemente fluorescente (mRuby2), a caracterização da proteína é simples e direta. A proteína-alvo pode ser facilmente visualizada sob iluminação normal e pode ser quantificada com o uso de um gerador de imagens apropriado. O objetivo é identificar rapidamente os candidatos que podem ser removidos do pipeline de cristalização porque é improvável que tenham sucesso, proporcionando mais tempo para os melhores candidatos e menos fundos gastos em proteínas que não produzem cristais. Esse processo pode ser iterado para incorporar informações obtidas com os esforços iniciais de triagem, pode ser adaptado para procedimentos de expressão e purificação de alto rendimento e é aumentado pela triagem robótica para cristalização.

Introduction

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determinação da estrutura através de cristalografia de raios-X fez contribuições fundamentais para todos os campos da biologia moderna; proporcionando uma visão atômica das macromoléculas que suportam a vida e como eles interagem uns com os outros em uma variedade de contextos; o que nos permite compreender os mecanismos que causam a doença e fornecendo oportunidades para racionalmente projetar medicamentos para tratar a doença. Cristalografia tem sido a técnica experimental dominante para a determinação da estrutura de macromoléculas, e atualmente responde por 89,3% da base de dados estrutural (www.rcsb.org). Esta técnica tem muitas vantagens, incluindo a possibilidade de muito alta resolução, a capacidade de visualizar macromoléculas com uma ampla gama de tamanhos, a recolha de dados relativamente fácil, e a oportunidade de visualizar como a macromolécula interage com solvente, bem como ligantes.

Apesar das inúmeras melhorias tecnológicas na expressão da proteína recombinante 1,2, purificação 3, e biologia molecular utilizados para gerar estes sistemas 4, o maior obstáculo no processo cristalográfica permanece a capacidade de crescer cristais de qualidade de difracção. Isto tem sido especialmente verdadeiro para as proteínas que contêm os domínios grandes em espiral enrolada. Estimou-se que, tanto quanto 5% de todos os aminoácidos são encontrados dentro de bobinas enroladas-5,6, tornando esta uma característica estrutural muito comum 7, mas estas proteínas são muitas vezes mais difícil de purificar e cristalizar do que as proteínas globulares 8-10 . Isto é ainda mais agravado pelo facto de que os domínios em espiral espiralada são encontrados frequentemente no contexto de uma proteína maior, portanto, prever correctamente as fronteiras destes domínios é crítico para evitar a inclusão de sequência não estruturado ou flexível que é muitas vezes prejudicial para a cristalização.

Aqui nós apresentamos uma estrutura conceitual combinando web-based computacional analisa com a Experimental Dados do banco, para ajudar a guiar os usuários através dos estágios iniciais do processo de cristalografia, incluindo: como selecionar fragmento (s) de proteína para estudos estruturais e como preparar e caracterizar amostras de proteínas antes de quaisquer tentativas de cristalização. Nós nos concentramos nossa análise em duas proteínas contendo domínios grandes em espiral enrolada, Shroom (SHRM) e Rho-quinase (Rock). Estas proteínas foram escolhidos uma vez que ambos contêm domínios em espiral espiralada e são conhecidas para formar um complexo biologicamente relevante 11-16. Shroom e Rho-cinase (rocha) são previstos para conter ~ 200 e 680 resíduos de espiral enrolada, respectivamente, muitas porções da qual têm sido caracterizados estruturalmente 17-20. O método descrito aqui fornece um fluxo de trabalho simplificado para identificar rapidamente contendo fragmentos de proteína de filamento helicoidal que serão tratáveis ​​através de cristalização, no entanto, as técnicas descritas podem ser facilmente adaptadas para a maioria de proteínas ou complexos de proteína ou modificada para incorporar high-throughput approaChes como disponíveis. Por último, estes métodos geralmente são baratos e podem ser realizadas pelos usuários em quase todos os níveis de experiência.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Um diagrama da estrutura conceitual ou fluxo de trabalho é descrito na figura 1 para referência. O protocolo pode ser dividido em quatro fases: previsões com base computacional ou de sequências, expressão e purificação de proteínas, a caracterização bioquímica, e cristalização. Os exemplos mostrados analisar domínios Shroom SD2 e / ou complexos de Shroom-rocha, mas pode ser utilizada com qualquer proteína.

1. Use Estabelecida ferramentas baseadas na Web para gerar previsões computacionais de limites de domínio coiled-coil

  1. Recolha um conjunto evolutivamente diverso de Homólogos sequência.
    1. Ir para www.uniprot.org e digite Shroom na barra de pesquisa superior.
    2. Seleccione sequências para download, marcando a caixa ao lado de seu número de acesso. Sequências com uma estrela indicam sequências revisados ​​por UniProt e são geralmente mais confiável. Tome cuidado para garantir que todas as sequências são completas e precisas.
    3. Salvar os s selecionadosequences clicando no botão Download.
    4. Alinhe o conjunto de sequências de Shroom utilizando Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Clique no botão "Browse" para selecionar o arquivo com as sequências Shroom e empurre Enviar.
    5. Após o alinhamento estiver completo, clique no botão "Download Alinhamento File".
    6. Abra o alinhamento múltiplo de sequências geradas em 1.1.5 usando Jalview (File | Alinhamento Entrada | Do arquivo). Dentro da nova janela de alinhamento, cor de identidade (Color | percentagem de identidade).
  2. Calcular as previsões de estrutura secundária, previsões da sequência flexível ou desordenado, e previu regiões de espiral enrolada dentro da proteína (s) de interesse.
    1. Ir para http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular as previsões em espiral enrolada. Copie e cole a seqüência na Caixa de Sequência e clique em Enviar.
      NOTA: Esta análise pode levar um par de horas para complete. Uma vez que sequências Shroom são bastante grandes, as sequências podem ter de ser dividida em blocos de menos do que 1,000 aminoácidos para caber dentro da limitação de tamanho do servidor da web. Ao analisar Shrm2, recomenda-se que os aminoácidos C-terminais 1000 são usados ​​como esta secção contém o domínio SHRM SD2 que é conhecido por conter regiões de espiral enrolada. Ao repetir esta análise com outras proteínas, recomenda-se utilizar as sequências de proteínas de comprimento total, quando possível. Se isso não é uma opção, utilizar o maior possível ou fragmento dissecar a sequência com base em dados bioquímicos ou funcionais conhecidos.
    2. Ir para http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular as previsões em espiral enrolada. Copie e cole a seqüência na Caixa de Sequência e clique em Enviar.
  3. Combinar os resultados de passos 1.1 a 1.2.2 em uma única anotação abrangente da sequência de Shroom.
    NOTA: É altamente incentivados a também incluem toda e qualquer i relevantenformação que pode ser adquirida a partir da literatura ou de outras fontes sobre a função da proteína ou purificação nesta fase.
  4. Utilizando esta sequência anotada abrangente, prever limites do domínio (ou uma série de possíveis limites) para a proteína, tentando maximizar a conservação e previu características estruturais, minimizando a quantidade de sequência desordenada ou flexível. Se for conhecida, a proteína resultante deve manter as propriedades funcionais de interesse.

2. expresso e purificar proteínas com os limites de domínio identificada na secção 1

NOTA: O objetivo desta seção é a utilização de uma série de ensaios rápidos e facilmente quantificáveis ​​para a tela de limites de domínio hipotéticas geradas na Seção 1.

  1. Utilizando técnicas padrão de biologia molecular, gerar um plasmídeo de expressão com a sequência de codificação desejada na moldura 10 dentro do seu -mRuby2-XH2 plasmídeo (veja a Figura 3 para o mapa de vector umnd detalhes adicionais).
  2. Os níveis de expressão de teste para cada plasmídeo de expressão utilizando células BL21 (DE3) de E. coli ou outra estirpe de expressão adequado em meios de auto-indução 1 à temperatura ambiente durante 18-24 h.
    1. Transforme os plasmídeos de expressão, bem como um controlo de plasmídeo vazio em BL21 (DE3), seguindo as instruções que vieram com as células ou usando o protocolo de transformação robusta, como o aqui (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformação/).
    2. A partir da placa recentemente transformados, escolher uma única colónia e crescer uma cultura de arranque de 5 ml a 37 ° C durante a noite em Lisogenia Broth (LB) com meios 34 ug / ml de canamicina.
    3. No dia seguinte, sedimentar a cultura e lavar o pellet com LB. fresco
    4. Adicionar a cultura de arranque, para 50 ml de meio de auto-indução com 34 ug / ml de canamicina. Permitir que a cultura a crescer até à saturação quer à temperatura ambiente ou a 37 ° C. Tipicamente, crescem durante ~ 18-24 h.
    5. celular pellets e congelar os sedimentos de células resultantes a -80 ° C antes da purificação indefinidamente.
    6. Comparar extractos de células completas de cada estirpe de expressão e o vector de controlo vazio por SDS-PAGE para determinar a estirpe que mais eficientemente produz a proteína de fusão desejada. Para His 10 proteínas de fusão -mRuby2 Cogumelo-SD2, correr 10% de gel SDS-PAGE a 180 V durante ~ 50 min ou até que a frente de corante atingir o fundo do gel de 22.
    7. Gel mancha com Coomassie Blue para visualizar as proteínas celulares totais dentro de cada estirpe 23.
  3. Executar uma etapa inicial de cromatografia de afinidade em cada cepa que expressa com sucesso proteína mRuby2-fusion. Tipicamente, executar os passos de purificação 2.3.2-2.3.7 à temperatura ambiente, a menos que a proteína irá beneficiar de condições alteradas, tais como a purificação, a 4 ° C.
    1. pellets de células descongelamento do passo 2.2.5.
    2. Ressuspender cada pelete de células em 1,5 ml de tampão de lise (10% de glicerol, 500 mM de NaCl, 40mM de imidazole, 20 mM de Tris pH 8,0, 1 mM de beta-mercaptoetanol). Complementar o tampão de lise com inibidores da protease, conforme apropriado.
    3. Adicionar 30 ul de 10 mg / ml de lisozima e incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Sonicate seguindo as instruções para o instrumento a ser utilizado.
    4. Transferir para um tubo de 1,5 ml e centrifugar numa centrífuga de bancada durante 30 min a 14000 xg para sedimentar o material insolúvel ou células não lisadas. Salvar tanto sobrenadante e pellet para posterior análise através de SDS-PAGE.
    5. Realizar a purificação de afinidade de níquel, incubação da fracção solúvel com 100 ul de contas de Ni-NTA. Incubam-se as contas com lisado solúvel, durante 5-10 min, invertendo diversas vezes para misturar os grânulos.
    6. Centrifugar a 800 xg durante 30 seg numa centrífuga de mesa para sedimentar as pérolas. Em seguida lavar o sedimento 3-5 vezes com tampão de lise para limpar os contaminantes não-específicos.
    7. proteína de fusão Eluir Ruby a partir das pérolas com tampão de lise, suplementado com 1H imidazole.
    8. Use SDS-PAGE para comparar o comportamento dos Seus-mRuby2-Shroom proteínas na purificação "rápida e suja" acima.

3. Caracterizar proteína da amostra para identificar aqueles com propriedades vantajosas

  1. Usar um conjunto espectrofotómetro a 280 nm para medir a concentração da proteína de fusão Ruby, e depois avaliar a homogeneidade da amostra através do carregamento de 1-5 ug de proteína de fusão num gel PAGE nativo 24. Submeter o gel PAGE nativo a 10% a 4 ° C durante 140 min a 175 V.
    1. Imagem a PAGE nativa utilizando um gerador de imagens equipado para visualizar fluorescência, observando-se que a fusão mRuby-tagged migra neste ensaio.
      NOTA: Tenha cuidado para observar proteína de fusão que está preso na bem como esta proteína é provável agregados. Se um gerador de imagens de fluorescência não está disponível, pode-se muitas vezes visualizar e imagem concentrada amostras de rubi com etiquetas proteína sob uma luz negra ou com uma caixa de luz UV.
  2. Realizar a proteólise limitada para identificar domínios dobrados de forma estável. Incubar 95 ul de Rubi-SHRM SD2 fusão em ~ 1 mg / ml com 5 ul de 0,025% Subtilisina A.
    1. Amostra a reacção em pontos de tempo de 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, e 120 minutos, removendo 10 ul da reacção para cada ponto de tempo e a visualização do progresso da reacção por meio de SDS-PAGE utilizando um gel de acrilamida a 15% .
    2. Coram com azul de Coomassie tal como no passo 2.2.7 e avaliar se uma espécie resistente protease podem ser identificadas.
  3. Integrar dados da eficiência da purificação, o comportamento em PAGE nativa e proteólise limitada sobre as proteínas parcialmente purificadas de fusão mRuby2-Shroom em uma avaliação abrangente do comportamento global destas proteínas em solução.
    1. (Opcional) Se um ensaio funcional adequado estiver disponível, verifique se há atividade neste momento.

4. Produção de cristais de alta qualidade de o Coiled-coil SD2Domínio de Shroom

NOTA: Todos os passos na secção 4.1 são realizadas à temperatura ambiente a menos que a proteína se beneficiaria de purificação a uma temperatura diferente, geralmente de 4 ° C.

  1. Usando as 50 ml crescimentos como uma estimativa aproximada de expressão e potencialidades de purificação, execute expressões de grande escala de mRuby2-Shroom SD2 com o objetivo de alcançar a 5-20 mg de amostra completamente purificados. Tipicamente de 2 L de cultura fornece material de partida adequado. Após o crescimento as células por centrifugação a 8000 xg durante 10 min.
    1. Ressuspender o sedimento do crescimento de 2 L de tampão de lise, como antes, utilizando-se ~ 2 ml de lise por grama de sedimento celular congelado se utilizando lisozima para a lise. Alternativamente, ressuspender em ~ 8 ml / g de sedimento se estiver usando um homogeneizador ou imprensa francesa. Sedimentar os restos celulares através de centrifugação a 30000 xg durante 30 min.
    2. Lote ligar a fracção solúvel a partir de 4.1.1 utilizando 10 ml de resina Ni-NTA. Despeje em coluna de gravidade apropriadoe permitir que as proteínas não ligadas para drenar.
    3. Lavar 3-5 vezes da resina com 40 ml de tampão de lise, seguindo-se uma lavagem com tampão de lise suplementado com NaCl 1 M.
    4. Lavar a resina com 40 ml de tampão de lise suplementado com imidazole 80 mM.
    5. Elui-se a proteína de fusão-rubi Shroom com 40 ml de tampão de lise suplementado com 1 M de imidazol. fracionar manualmente a proteína eluída em 4-10 ml frações.
    6. Confirmar fracções contendo proteína de fusão Rubi-Shroom utilizando 10% de SDS-PAGE.
    7. Dialisar fracções apropriadas (tipicamente frações 2-4) em 8% de glicerol, NaCl 250 mM, imidazole 15 mM, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-Me, utilizando tubagem de diálise de 6-8 kDa MWCO. Adicionar 1 mg de protease de TEV por cada 25-50 mg de proteína de fusão. Dialisar durante a noite à temperatura ambiente com agitação lenta.
    8. purificação de níquel afinidade Repita os passos 4.1.2. a 4.1.6. O domínio Shroom SD2 agora deve permanecer na fracção livre enquanto o seu 10 -mRuby2 continuam vinculados aose a resina vai ser encontrada nas fracções de eluição. Confirmar esta usando 12% da coloração SDS-PAGE com azul de Coomassie.
    9. Dialisar fracções contendo domínio Shroom SD2 em 8% de glicerol, 100 mM de NaCl, Tris 20 mM, pH 8,0, tampão mM de beta-mercaptoetanol a 5 durante a noite.
    10. Realizar cromatografia de permuta aniónica utilizando um 25 FPLC, e eluindo com um gradiente de NaCl 0,1-1,0 M de NaCl. Analise fracções, utilizando 12% de SDS-PAGE.
    11. Usando um concentrador de rotação (MWCO de 10 kDa ou superior, dependendo da proteína a ser estudada), concentrar as fracções do pico a ~ 0 mg / ml, e, em seguida, realizar cromatografia de exclusão de tamanho 26, a análise através de fracções de pico de 12% de SDS-PAGE.
    12. Piscina fracções de pico e diálise em Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, 2% de glicerol, 1 mM β-Me, e concentra-se para 10 mg / ml antes da cristalização.
      Opcional: Durante esta etapa, remover amostras de 5 uL em concentrações de 1, 2, 5, e 10 mg / ml durante o curso de se concentrar a amostra.Execute um nativo de carregamento da página 2-5 mL de cada amostra de olhar para o comportamento da amostra durante esta etapa.
  2. Tela de um pequeno conjunto de 12 condições para identificar uma concentração de proteína ideal para ensaios de cristalização. A composição destas condições é descrita na Figura 7.
    1. Usando 24 poços sentam-se tabuleiros de cristalização gota, realizar ensaios de cristalização utilizando o método de difusão de vapor, de pipetagem de 500 ul de cada uma das 12 condições em poços separados seguidos por gotas que inicialmente contêm 1 ml de solução bem e 1 ul de amostra de proteína em as lamelas . Consulte 27 para obter informações adicionais sobre esta técnica.
    2. Rapidamente selar a bandeja com fita adesiva transparente e mover a bandeja para um ambiente controlado temperatura adequada que é vibração livre. A temperatura utilizada pode variar, mas 4 ° C, 16 ° C, e 20 ° C são bastante comuns.
    3. Examine as gotas nas bandejas durante a próxima 3 days usando um microscópio de até 100X. No final do período de 3 dias, marcar cada gota como contendo nenhuma precipitação (clara), precipitação de luz, precipitação pesada (castanho), ou cristais. Uma concentração adequada de proteínas deve conter não mais do que 6 precipitações pesados.
    4. Usando a concentração de proteína identificada em 4.2, o despiste de uma larga gama de telas de cristalização disponíveis comercialmente. O uso de um tratamento de cristalização ou robô líquido aumenta grandemente o presente processo e ao mesmo tempo a redução do erro nas gotas. Isto requer muito menos proteína, bem como, permitir que o utilizador para rastrear mais condições com uma única amostra.
    5. Melhorar as condições iniciais identificados a partir de telas de amplos variando sistematicamente cada uma das variáveis ​​dentro da gota de cristalização, usando 24-de rastreio bem como as bandejas antes.

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Results

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Um diagrama que descreve o fluxo de trabalho utilizado neste sistema é mostrado na Figura 1 e inclui três etapas principais. A análise computacional da sequência é utilizada para desenvolver hipóteses acerca dos limites do domínio da proteína de filamento helicoidal de interesse. Um exemplo de uma análise anotada do domínio Shrm2 SD2 é mostrado na Figura 2. Neste diagrama, o objetivo foi identificar os possíveis limites de domínio para um domínio conserv...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo aqui descrito é projetado para ajudar o usuário a identificar limites de domínio dentro de proteínas em espiral enrolada grandes para facilitar a sua cristalização. O protocolo baseia-se em uma incorporação integral de uma variedade de dados de previsões computacionais e outras fontes para gerar uma série de potenciais limites do domínio. Estes são seguidos por um conjunto de experiências bioquímicas que são rápidos e baratos, e são utilizados para refinar ainda mais estas hipóteses iniciais. Usando essa abo...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela bolsa NIH R01 GM097204 (APV e JDH). O financiamento para o JHM foi fornecido por uma bolsa de verão de pesquisa de graduação do HHMI.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BL21 (DE3) RosettaEmd Millipore70954-3
BL21 (DE3) StarThermoFisher ScientificC601003
BL21 (DE3) Codon PlusAgilent Technologies230245
LysozymeSpectrum Chemical Mfg CorpL3008-5GM
Ni-NTA resinaLife Technologies25216
SubtilisinASpectrum Chemical Mfg CorpS1211-10ML
Hampton researchHR3-160
INTELLI-PLATE   96:Art Robbins Instruments102-0001-03
PEG 3350Hampton researchHR2-591
PEG 8000Hampton researchHR2-515
PEG 400Hampton researchHR2-603
PEG 4000Hampton researchHR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2Addgene49089
Sistema de Autoindução Overnight Express 1Emd Millipore71300
Caldo de Lisogenia em póThermoFisher Scientific12795027 
Placa Cryschem de 24 poços

References

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