Method Article

Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

DOI:

10.3791/54894

⸱

February 19th, 2017

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Concebemos um aparelho de cultura contínua para uso com sistemas de optogenetic para iluminar culturas de micróbios e regularmente células de imagem no efluente com um microscópio invertido. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados para que as respostas dinâmicas a iluminação pode ser medida ao longo de vários dias.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sistemas optogenética utilizar proteínas geneticamente codificados que mudam de conformação em resposta a determinados comprimentos de onda de luz para alterar os processos celulares. Existe uma necessidade para a cultura e os sistemas de medida que incorporam programados iluminação e estimulação dos sistemas optogenetic. Apresenta-se um protocolo para a construção e utilização de um aparelho de cultura contínua para iluminar as células microbianas com doses programadas de luz, e automaticamente aquisição e análise de imagens de células no efluente. A operação deste aparelho como um quimiostato permite que a taxa de crescimento e o ambiente celular a ser rigorosamente controlado. O efluente da cultura de células contínua é regularmente amostrado e as células são fotografadas por microscopia multi-canal. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados de modo que as respostas dinâmicas na intensidade de fluorescência celular e morfologia das células da amostra do efluente de cultura são medidos ao longo de vários diassem entrada do usuário. Nós demonstrar a utilidade do aparelho de cultura de indução dinamicamente a produção de proteína numa estirpe de Saccharomyces cerevisiae com um sistema de engenharia optogenetic que activa a transcrição.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetic sistemas utilizam a luz para controlar uma lista cada vez maior de processos celulares, incluindo a expressão do gene, 1, 2, 3, 4, 5 localização de proteínas, actividade de proteína de 6, 6, 7, 8, proteína de ligação, 8, 9, 10 e a degradação da proteína. 11 Um método para a cultura de células em um ambiente controlado com estimulação óptico programado e para medir a sua resposta em escalas de tempo biologicamente relevantes é necessário explorar o potencial dessas ferramentas para a investigação em biologia celular e biotecnologia. O nosso método aproveita chemostasis para manter uma taxa de crescimento constante de célula em um bem misturado, AEclassificado, e vaso de cultura de vidro com temperatura controlada 12, 13 que está exposta a iluminação programada. Nós imagem células individuais na cultura efluente com um microscópio invertido para medir a resposta da cultura de iluminação programado. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizada de modo que a intensidade da fluorescência e morfologia celular da cultura de células do efluente pode ser medido ao longo de vários dias, sem intervenção do utilizador.

Este protocolo pode ser implementada na maioria dos laboratórios familiarizados com a cultura celular em crescimento e microscopia, e o aparelho utilizado é barato e feito de componentes prontamente disponíveis. Um vaso de cultura transparente é colocada acima de uma matriz de diodos emissores de luz (LEDs), capazes de emitir um mW / cm 2 -10 mW / cm2 de luz. Os micróbios são cultivados em vaso de cultura continuamente; uma bomba peristáltica é utilizada para adicionar mídia aotaxa de diluição, uma outra é utilizada para retirar a cultura a uma velocidade menor ao microscópio, e a diferença escapa através de um orifício de descarga. A almofada de aquecimento mantém a temperatura. O ar é continuamente bombeada para dentro do vaso de cultura para manter uma pressão positiva, bem como para misturar e arejar a cultura. Excepto para a bomba de ar, a potência para esses dispositivos é regulada por um microcontrolador que também recebe a entrada a partir de um termómetro e de um computador de secretária ligado. A cultura de células efluente é bombeado para um dispositivo de microfluidos com a fase de um microscópio invertido. Não fluorescente e imagens fluorescentes são adquiridos automaticamente. As células nas imagens são caracterizados por um algoritmo que localiza cada célula como uma região de interesse (ROI) e mede as propriedades de cada ROI.

Para demonstrar uma aplicação deste protocolo, medimos a resposta a diferentes intensidades de luz de células de Saccharomyces cerevisiae por engenharia com uma responsa de luz azulve optogenetic sistema que controla a transcrição de proteína fluorescente. S. cerevisiae, comumente conhecido como fermento de padeiro, foi selecionado porque vários sistemas optogenética para controlar a expressão de genes neste sistema já existem 14, 15, 16. Além disso, este organismo modelo é comumente usado para estudos em biologia de sistemas 17 e como um chassis para aplicações biotecnológicas 18, 19, 20. Os resultados representativos demonstram que este protocolo pode ser utilizado para controlar a transcrição de uma cultura durante vários dias, variando as intensidades de luz de entrada e medir a produção de um repórter fluorescente.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1

Figura 1: O aparelho de cultura contínua. Este diagrama simplificado mostra como o aparelho deve ser montado quando ele é usado para a cultura, iluminar, e medir as propriedades ópticas dos micróbios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-2
Figura 2: Visão geral do protocolo. Os passos na região sombreada tem de ser repetido cada vez que o protocolo é utilizado. Controle de circuito fechado é possível 34, mas não é implementado neste protocolo.

1. Monte o termômetro para a placa de circuito


Figura 3: Conexões para ler os valores termômetro. Este diagrama mostra como o termómetro digital deve ser ligado à placa de circuito impresso de modo a que o microcontrolador pode obter feedback para controlar a temperatura da cultura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
  1. Soldar o chão, Dados e linhas de tensão positiva do termómetro digital para seus respectivos furos de passagem marcada "GD + V".
  2. Cortaria um pino de uma cabeça de 3 pinos fêmea e aparar os restantes 2 pinos com cortadores de fio, de modo que pode encaixar nos dois furos de passagem rotulados como "R2" e não obstruir o microcontrolador. Soldar este no lugar. Ligue os dois pinos soldados, inserindo um kW resistor 4.7 no cabeçalho pin.

2. Ligue o Con PoderComponentes trolo à placa de circuito

figure-protocol-3
Figura 4: Conexões para controlar o poder para a almofada de aquecimento. Este diagrama mostra como as partes de PCB e acessório deve ser montada a fim de controlar a potência para a almofada de aquecimento. As peças para controlar as bombas peristálticas são ligados de uma maneira semelhante. Note-se que os componentes para o termómetro foram removidos para maior clareza. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Aparar 1 cm dos pinos de cinco cabeçalhos de 3 pinos do sexo feminino. Solda-los para as posições na placa de circuito impresso (PCB) marcado como "# 1", "# 2", "# 3", "# 4", e "CB E."
  2. Aparar 1 cm com os pinos de uma fêmea cabeçalho 6 pinos e 8 pinos. Soldar estes lado a lado paraa coluna de furos de passagem marcado K1 a K14.
  3. Ligue a almofada de aquecimento para a placa de circuito.
    1. Inserir as extremidades de uma resistência de 100 kQ no K1 orifícios rotulados e K2 no PCB. Inserir um transistor de metal-óxido-semicondutor de efeito de campo (MOSFET) em posição marcada # 1 no PCB, com o rótulo do MOSFET virada para o K1 a K14 furos de passagem de modo a que o pino de fonte está mais próximo da "# "etiqueta, e o pino de drenagem está mais afastada da" etiqueta # ".
    2. Cortar o fio terra do cabo de 5 V de corrente contínua (DC) fonte de alimentação e conecte-o a J2. Ligue a linha de base da almofada de aquecimento para J1. Ligue K3 ao pino 3 com um kW resistor 1. Atual deve agora só fluir de J1 para J2 quando o pino 3 está definido para + 5V.z
      NOTA: O conjunto de funções resistor / MOSFET como um interruptor que permite que a corrente flua do pino J1 a J2 quando o pino 3 do microcontrolador está definido para +5 V.
  4. Conectara bomba peristáltica lenta.
    1. Inserir as extremidades de uma resistência de 100 kQ no K4 orifícios marcados e K5 no PCB. Inserir um MOSFET na posição marcada # 2 no PCB, com o rótulo do MOSFET virada para o K1 a K14 furos de passagem de modo a que o pino de fonte está mais próximo da etiqueta "#", e o pino de drenagem está mais afastada da "#" rótulo.
    2. Cortar a linha de terra do DC cabo de alimentação de 12 V da bomba peristáltica lento. Ligue a bomba peristáltica frente para a extremidade de J3 e as verrugas parede em frente fim a J4. Ligue K6 ao pino 4 com uma kW resistor 1. Atual deve agora só fluir a partir J3 para J4 quando o pino 4 está definido para +5 V.
  5. Ligue a bomba peristáltica rápido
    1. Inserir as extremidades de uma resistência de 100 kQ na K7 orifícios marcados e K9 no PCB. Inserir um MOSFET na posição marcada # 3 na placa de circuito impresso, com o rótulo do MOSFET virada para o K1 a K14 furos de passagem s O que o pino de fonte está mais próximo da etiqueta "#", e o pino de drenagem está mais afastada da etiqueta "#".
    2. Cortar a linha de terra do DC cabo de alimentação de 12 V da bomba peristáltica rápido. Ligue a bomba peristáltica frente para a extremidade para J5 e as verrugas parede em frente fim a J6. Ligue K9 ao pino 5 com um kW resistor 1. Atual deve agora só fluir a partir J5 para J6 quando o pino 5 está definida para +5 V.

3. Conecte o Matrix LED à placa de circuito

figure-protocol-4
Figura 5: As ligações para controlar a matriz de LED. Este diagrama mostra a forma como a matriz de LED deve ser ligada ao PCB. Ela também mostra que a PCB pode ser empilhado sobre o microcontrolador. Note-se que os componentes para o termómetro e para controlar a potência DC para outros dispositivos têm sido removidos para maior clareza.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Soldar a 6 pinos, de 10 pinos, e os dois conectores de pino fêmea 8 pinos nos orifícios através-nos lados da placa de circuito impresso de tal modo que podem ser empilhados em cima do microcontrolador.
  2. Soldar o 100 nF e 10 capacitores uF às suas posições marcadas no PCB, observando que o terminal negativo da 10 uF capacitor (lead mais curto) deve ser ligado ao orifício de passagem marcada com um sinal negativo.
  3. Soldar o condutor de LED para a 2 por 12 conjunto de furos de passagem, com o recuo do condutor longe dos orifícios de passagem reservados para a matriz de LED.
  4. Soldar 2 colunas de pin headers do sexo masculino para os furos de passagem marcada para a matriz de LED, e aparar as extremidades destes debaixo da placa de ensaio de tal modo que eles não vão obstruir o microcontrolador. Conectá-los a duas tiras de 8 fios de fios jumper Mulher / Mulher. Conectar-se um segundo conjunto de machopin headers para a outra extremidade dos fios jumper.
  5. Insira a matriz de LED ao longo da mediana da placa de ensaio e, em seguida, insira o segundo conjunto de pin headers para as colunas em ambos os lados da matriz. Certifique-se de que as ligações eléctricas são as mesmas que se a matriz de LED tinha sido ligado directamente à placa de circuito impresso com o lado da etiqueta da matriz correspondente à coluna rotulada de furos de passagem.
  6. Cortaria um pino de uma cabeça de 3 pinos fêmea e aparar os restantes 2 pinos com cortadores de fio, de modo que pode encaixar nos dois furos de passagem rotulados "R1" e não obstruir o microcontrolador. Soldar isso. Ligar os dois pinos soldadas através da inserção de uma resistência de 1 kQ no cabeçalho pino.
    Nota: O vaso de cultura serão empilhadas sobre a matriz de LED. Se as fitas de arame obstruir o vaso, compensá-los a partir da matriz. Em seguida, use fio de núcleo sólido para fazer a ponte entre os pinos de matriz e os pinos de fita de arame, de tal forma que as ligações eléctricas não change.

4. Instale Software e Conectar-se a Hardware

  1. Empilhar o PCB no microcontrolador.
  2. Siga os links na lista de materiais para baixar o Ambiente de Desenvolvimento Integrado (IDE) e código personalizado para o microcontrolador.
  3. Ligue o microcontrolador para o computador microscópio através de um cabo AB universal serial bus (USB). Compilar e carregar o código personalizado para o microcontrolador.
  4. Baixar Micro-Manager 21, 22 e 23 de FIJI. Configurar Micro-Manager como um plugin FIJI, copiando todos os arquivos ".dll", o "mmplugins" diretório eo diretório "mmautofocus" a partir do diretório onde Micro-Manager foi baixado para o diretório "Fiji.app". Além disso, copiar os "plugins / Micro-Manager" do diretório para o diretório "Fiji.app/plugins".
  5. Baixe o "BioreactorController.jar" int arquivoo diretório "Fiji.app/mmplugins".
  6. Abrir Micro-Manager de Fiji> Plugins> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Use o Assistente de Configuração de hardware para configurar o software para controlar o microscópio. Incluir o dispositivo "FreeSerialPort" no Assistente com a etiqueta da porta à qual está ligado o cabo USB AB.

5. Faça e caracterizar o cerco à prova de luz para o vaso de cultura

  1. Stack três tomadas IC 8 pinos como blocos de construção na placa de ensaio em cada um dos cantos da matriz de LED de tal modo que o vaso de cultura pode descansar em cima delas acima da matriz.
  2. Fixar uma porção de papel de difusão sob a camada superior das tomadas, de tal modo que a luz que atinge o vaso de cultura a partir da matriz de LED é difusa.
  3. Cortar três 8 "por 6" porções de espuma preta. Cortar uma porção que é do mesmo tamanho que a placa de ensaio electrónico (2,3 "x 3,5") a partir do interior da primeira TWO e uma porção que é o tamanho do rectângulo feito pelas tomadas de IC (0,9 "x 1,8") a partir do interior do terceiro. Empilhar essas camadas ao longo da matriz de LED de tal modo que a camada final contendo o "x 1,8" 0,9 abertura encontra-se, mesmo com a parte superior das tomadas IC, e rodeia a matriz de LED.
  4. Cortar uma folha adicional de espuma preta ao meio para fazer um rectângulo 6 "por 24". Este rolo em uma coluna oca de espuma preta que o vaso de cultura pode encaixar-se com o espaço para os tubos e fios, de tal modo que ele irá termicamente e opticamente isolar o vaso de cultura.
  5. Centralizar a coluna oca de espuma preta sobre a matriz de LED, e marcar o limite da coluna sobre a camada de espuma preta por baixo. Este limite vai marcar o local onde deve ser centrado no futuro.
  6. Corte um 3 "x 3" porção de espuma preta. Utilizar esta depois como uma tampa que pode ser gravada para o topo da coluna para bloquear a luz externa.
  7. Fixe o sensor de potência fotodiodo para th e cultura tampa do vaso com fita, coloque a tampa e coloque o vaso de cultura no recinto.
  8. Em Micro-Manager, vá para Plugins> biorreator Controller. Definir a matriz para iluminar a um subconjunto da gama de intensidades possíveis em intervalos de 30 s.
  9. Grave as intensidades de luz, como exibido no console do medidor de energia conectado ao sensor de potência. Estas medições irão permitir que a intensidade real da luz a ser conhecidos quando o número de LEDs que são iluminadas e o (PWM) de corrente de largura de pulso modulado aos LEDs é definido.

6. Prepare o vaso de cultura

figure-protocol-5
Figura 6: Conexões do navio. Este diagrama mostra a forma como o recipiente e o tubo do aparelho deve ser ligado antes de ser autoclavado.blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Marque a altura correspondente a cada incremento de 2 ml de líquido na gama de 10 a 30 ml no vaso de cultura. Insira 10 mL de água deionizada estéril, marque o nível de água, adicione 2 mL, marque o nível da água, e repetir até que o nível de 30 mL é marcado. Cobrir as marcações com fita adesiva transparente para que eles não são facilmente removidos, e descartar o líquido.
  2. Coloque a ponta mais longa da porta de alumínio através da junta de silicone, para o vaso de cultura. Enrosque a tampa.
  3. Cobrir uma porta de saída curta de alumínio com tubos de silício ID 1/16 ". Ligue a extremidade distai através da inserção de um luer lock fêmea e, em seguida, ligar uma ficha de bloqueio Luer macho. Esta saída é complementar, e não vai ser usado (tubo 6 na Figura 6 ).
  4. Conectar dois segmentos curtos de 1/16 "tubo de silicone ID com fechaduras luer masculino e feminino. Conecte uma extremidade a uma tomada de porta curta alumínio e ligue o distal final com um luer macho e fêmea luer tampão de bloqueio. O navio irá ser inoculado através do tubo (tubo 7 / 7.1 na Figura 6).
  5. Conectar dois 1/16 "tubos de identificação para as extremidades do 1/16" tubulação peristáltica ID e conectores. Ligue uma extremidade a uma porta de alumínio curto e ligue a outra (tubo 4 na Figura 6). Mais tarde, este será ligado ao balão de meios de comunicação.

7. Prepare a garrafa de mídia

  1. Conectar um "tubo de diâmetro interno (ID) de silicone para a porta de alumínio mais longa. O tubo deve ser suficientemente longo para atingir o balão de meios. Conectar um 1/8" 1/16 luer lock macho ID para um segmento curto de 1/16 " tubulação de ID, ligue este ao tubo anterior ,, e, em seguida, inserir este pequeno segmento na tampa de borracha no frasco de mídia (tubo 3 na Figura 6).
  2. Prender o tubo. Esta ligação permite ao ar fluir a partir do balão de meios de comunicação para o vaso de cultura. Quando o frasco de meios é depois bombeada com um ard Este tubo é desapertada, a cultura vai ser misturado, gaseificado, e mantido a uma pressão positiva por as bolhas de entrada.
  3. Insira um "tubo de ID tempo suficiente para chegar ao fundo do frasco na rolha, através do qual a mídia será transferido. Ligue outro 1/16" 1/16 tubo de ID para este, e, em seguida, um tubo de 3/16 "ID para que. Ligue este com um "ID fêmea de bloqueio Luer 16/03 e de um tampão de bloqueio Luer macho (tubo 1 / 1.1 na Figura 6).
  4. O terceiro orifício da rolha deve ser preenchido com um segmento curto de 1/16 "ID tubagem, ligado a dois outros segmentos de tubagem de diâmetro médio e ligado na extremidade distal (tubo 2 / 2.1 na Figura 6). Este pode ser conectado a uma bomba de vácuo e depois de uma bomba de aquário.
    NOTA: Se o tubo não pode facilmente ajustar através dos furos na rolha de borracha, cortar as extremidades da tubagem a uma inclinação. Em seguida, a extremidade inclinada que é empurrado através do orifício pode ser utilizado para puxar o resto através.

  1. Inserir um bloqueio luer macho em um segmento de 1/16 "tubo de silicone ID, e em seguida, insira firmemente 0,022" tubulação ID de politetrafluoretileno (PTFE). Separadamente, anexar um luer lock fêmea para um 1/16 "ID do tubo. Em seguida, um segmento de extremidade ao longo do tubo de PTFE para conectar os bloqueios e o outro a uma porta de alumínio curto (tubo 5 na Figura 6).
  2. Ligue o "tubo de ID de silicone para a 1/50" 1/50 exposta tubo peristáltico ID e conectores. Para isso, conecte três segmentos de 1/50 "tubulação ID e dois segmentos de 0,022" tubulação ID PTFE, alternando-as. Ligar esta ao frasco de efluente através de 1/16 "ID tubo (tubo 5 na Figura 6).
  3. Conectar uma extremidade de um tubo de 1/16 "ID de silicone para o segundo tubo mais longo do porto de alumínio e a outra extremidade ao balão de efluente. Este tubo de alumínio define o volume da cultura, e o excesso de cultura transborda para dentro do recipiente de efluentes (tubo de 8 em
  4. Autoclave a montagem de cultura a 121 ° C e 15 psi (esterilização geral) durante 30 min.
    Nota: Os tubos através do qual o balão mídia está cheio, através da qual o balão de meio é aspirado, e através do qual o vaso de cultura é inoculado ter vários segmentos de tubo de modo que, se o segmento distai é contaminada, pode ser removida para revelar um estéril segmento.

9. Prepare o canal microfluídicos

  1. Mistura de polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura numa proporção de 9: 1. Degas e despeje sobre o molde mestre de silício.
  2. Curar o PDMS durante 2 h a 65 ° C e, em seguida, cortá-la a partir da máscara com uma lâmina de barbear. Corte em torno do PDMS até liberar a partir do molde. Evite empurrar para baixo e quebrar o wafer frágil.
  3. Use um 1,2 mm de diâmetro furador biópsia para fazer furos em ambas as extremidades do canal.
  4. Vínculo Plasma PDMS para a tampa de vidro 24.
  5. Tape o tempo extremidades do vidro de cobertura à armação de alumínio de suporte de tal modo que o canal de PDMS é centrada sobre a moldura de alumínio, e depois cozer o PDMS novamente durante 2 h a 65 ° C.

10. Preencha a mídia Flask

figure-protocol-6
Figura 7: Adicionando mídia. Este diagrama mostra como a mídia deve ser filtrada a vácuo para o balão de mídia. Ele garante que a mídia continua a ser estéril. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Faça mídia apropriada. Se o sistema de cultura contínua será operado como um quemostato, usar meios limitados para um nutriente específico.
    NOTA: Exemplos de composição de mídia padrão para estudos com S. cerevisiae foram previamente publicados 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Fixe o filtro de vácuo para um frasco de 100 ml, retire a tampa do bocal, em seguida, retire a ficha branca do mamilo do filtro de vácuo com pinças estéreis.
  3. Ligue o tubo de silicone 3/16 "ID ao mamilo, outro tubo livre do balão de mídia a uma bomba de vácuo (tubos 1 e 2 na Figura 7, respectivamente), e garantir que o tubo que liga o balão mídia para o vaso de cultura é preso fechar (tubo 3 na Figura 7).
  4. Encha o filtro com a mídia, ligar a bomba de vácuo, e depois filtrar o resto da mídia. Prender a tubagem de silicone de 1/16 "ID ligado ao vácuo (tubo 2 na Figura 7) e desligar a bomba de vácuo.
  5. Remover os leurs do segmento intermédio de 1/16 "ID tubo ligado à bomba de vácuo de modo que uma extremidade não contaminada do tubo é acessível. Inserir the extremidade azul de um filtro de ar seringa estéril para este tubo.
  6. Prender o tubo 3/16 "ID de silicone (tubo 1 na Figura 7) e desligue o luer macho da mesma. Desligue a ficha do luer feminino do tubo de entrada de mídia do vaso de cultura. Ligue estas luers masculinos e femininos para habilitar mídia a ser bombeada para o vaso de cultura.
  7. Retire o filtro de vácuo e tampar a garrafa mL de meios de comunicação que foi anexado ao filtro de vácuo 100.
  8. Um dia antes do vaso de cultura serão inoculados, inocular uma única colónia do micróbio optogenetic num tubo de ensaio com 4 mL de os meios recolhidos na etapa anterior, e deixar crescer durante a noite a 30 ° C ou à temperatura óptima de crescimento a temperatura da cultura com agitação.

11. Montar o aparelho de Around the Microscope

  1. Definir o conjunto de cultura contínua perto do microscópio com a mídia garrafa maior que o vaso de cultura ea effluent balão inferior ao vaso de cultura, de modo a que o tubo composto por segmentos de 0,022 "ID tubagem de PTFE (tubo 5 na Figura 6) pode atingir a fase de microscópio. segurança fita para baixo as rolhas de borracha do frasco e meios recipiente efluente.
  2. Desligue as extremidades do "tubo de PTFE ID a partir do 1/50" ID de silicone 0,022 tubo conectando-(tubo 5 na Figura 6), e ligar estas extremidades para a entrada e a saída do dispositivo de microfluidos.
  3. Ligar a extremidade branca do filtro de ar de uma seringa à bomba de aquário. A pressão do ar vai empurrar mídia no vaso de cultura.
  4. Quando o suporte alcança o nível da porta de efluente, enrolar o tubo de "meios de entrada de ID e os conectores em torno da bomba peristáltica lenta (tubo 4 na Figura 6) e o 1/50" 1/16 tubagem de saída de ID da amostra e os conectores em torno do rápido bomba peristáltica (tubo 5 na Figura 6).
  5. Arejar a mídia por desclampeamento o ar tusituar-se entre o balão e meios vaso de cultura.
  6. Tape a almofada de aquecimento e um termómetro para o vaso de cultura de modo a que a sua temperatura pode ser controlada. Enrole a tubagem meios em torno do vaso de cultura de modo que os meios de comunicação que entram estará à mesma temperatura que o navio.
    NOTA: A corrente de PWM para a almofada de aquecimento é regulada pelo microcontrolador que utiliza entradas do termómetro para manter o vaso de cultura a sua temperatura nominal.
  7. Insira o vaso de cultura para dentro do gabinete espuma preta sobre a matriz de LED, e garantir que os tubos não fiquem presos.
  8. Em Micro-Manager, vá para Plugins> biorreator Controller. Defina o "rácio de mídia bomba em" campo para 0,1 e a "razão de bomba da amostra em" campo a 0. A taxa de fluxo será muito baixo, mas maior do que a taxa de evaporação.
  9. Prenda o tubo de ar de entrada entre o frasco de mídia e vaso de cultura. Remova o plugue do tubo de inoculação (tubo 7 na Figura
  10. Cubra o gabinete de modo que nenhuma luz entra, e deixe a cultura crescer durante a noite.

12. Calibrar o bombeamento Rates

  1. Em Micro-Manager, vá para Plugins> biorreator Controller. Defina o "rácio de mídia bomba em" campo para 0,5 e a "razão de bomba da amostra em" campo para 0.
  2. Desligue o tubo de descarga a partir do balão de efluente (tubo 8 na Figura 6) e o tubo de amostragem a partir do balão de efluente (tubo 8 na Figura 6) e recolher o efluente em vasos separados. Recolha de efluentes, durante 1 hora, começando depois das bombas de ter sido por 15 min.
  3. Calcula-se a taxa de fluxo dos meios de comunicação para o vaso de cultura a partir do volume recolhido no recipiente como:
    figure-protocol-7
  4. Ajuste o valor da "relação de compressão de mídia em" campo por esta estimativa linear:
    figure-protocol-8
    Onde
    figure-protocol-9
  5. Iterar através deste procedimento de calibração até que a diferença entre a taxa de fluxo desejada e o caudal medido for <0,2 ml / h, em que a taxa de fluxo é feita a média durante um período de 1 h.
  6. O aumento do valor do "relação de amostra no" campo e calibrar de um modo semelhante, até cerca de 4/5 do volume th deixar o vaso de cultura é bombeado para fora pela bomba de amostragem e cerca de 1/5 do volume está saindo através a porta de transbordamento.
  7. Deixe que a densidade da cultura no aparelho de cultura contínua equilibrar durante a noite sob estas condições.
    NOTA: Se as taxas de fluxo de destino não pode ser alcançado, a mudançaa tubulação da bomba peristáltica. O líquido é bombeado a uma taxa mais elevada quando tubos de maior diâmetro é usado. Siga o passo 14 e, em seguida, retornar para a etapa 8.4.

13. Recolher Microscópio Imagens de micróbios cultivados

  1. Encha a Lista Posição Stage em Micro-Manager com um conjunto de posições não sobrepostos em que as imagens de células bombeado para dentro do canal microfluídicos estarão no plano focal.
  2. Abra o plugin "biorreator Controller". Selecione o curso desejado tempo de matriz de LED, canais de imagem e outras configurações experimentais dos prompts. Coletar e analisar imagens.
  3. Enquanto o experimento é executado, garantem que a mídia no frasco media permanece clara. Se estiver nublado, então, tem sido contaminada.

14. Pós-experimento

  1. Dispor de meios de comunicação, cultura de células em excesso e efluentes.
  2. Encher o balão com meios 200 mL de EtOH a 20% misturada com água desionizada. Execute o quemostato como tinha anteriormentesido executado durante o experimento para lavar restos de células e meios de comunicação.
  3. Quando a solução de álcool drenou do frasco mídia, desmontar o quemostato plenamente.
  4. Lavar copos e tubos com água morna e detergente neutro, e enxaguar abundantemente com água deionizada. Deixar secar.
  5. Abra o arquivo "microcontrollerRecords.csv" para rever a temperatura eo estado matriz de LED ao longo do experimento, o arquivo "Summary.csv" para revisar os dados de resumo de cada conjunto de imagens e os "Resultados .csv" arquivos para revisar os dados que resumem cada ROI de cada período de tempo, onde n é o n º conjunto de dados.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este aparelho foi utilizado para estimular uma cultura de S. cerevisiae que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP), em resposta à luz azul por meio de um sistema de transcrição indutível optogenetic com base no par de proteínas Cry2 / CIB1 30. As células foram cultivadas chemostatically em meios com limitação de fosfato com uma taxa média de diluição de 0,2 ± 0,008. Fosfato limitação é comumente utilizado em S. cerevisiae quimiostato exp...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós projetamos este aparelho com flexibilidade em mente. Todo o código usado é gratuito e de código aberto. O processo de análise de imagem padrão para as células do segmento é simples e funciona rapidamente. análise personalizada pode ser implementado através da gravação de entrada do usuário ao analisar uma imagem representativa com a interface gráfica de usuário FIJI, convertendo a entrada para um script beanshell, e então configurar o plugin para chamar o script. Quando é chamado, esse script será enviado um array d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Gostaríamos de reconhecer Molly Lazar e Verónica Delgado de assistência em testar o protocolo, Kieran Sweeney para discussões úteis e edição e Taylor Scott, My An-adirekkun, e Stephanie Geller para a leitura crítica do manuscrito. Megan Nicole McClean, Ph.D. detém um Prémio Carreira na Interface Científica do Fundo Burroughs Wellcome.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Extenso manual de laboratórioGitHubNAUm extenso manual de laboratório atualizado regularmente está disponível no " Arquivos de Quimiostato Optogenético" Repositório GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Isso também inclui uma descrição do molde microfluídico usado para gerar os resultados representativos.
Fritzing Design ViewerFritzingNAO software gratuito e de código aberto para visualizar e editar os designs de placas de circuito do tipo .fzz está disponível em "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - montado)Microcontrolador Adafruit50. 1 necessário.
Kit de Cabeçalho Empilhável ArduinoSparkFun Electronics10007Cabeçalhos de pinos fêmeas para conectar PCB ao microcontrolador. 1 necessário.
Ferro de solda ajustável 30W 110V - XY-258 110VAdafruit180Para fazer conexões elétricas ao PCB. 1 necessário.
Suporte de ferro de soldaAdafruit150Para fazer conexões elétricas ao PCB. 1 necessário.
Mini Carretel de solda - 60/40 de solda de núcleo de resina de chumbo 0,031" de diâmetro - 100gAdafruit145Para fazer conexões elétricas ao PCB. 1 necessário.
0,1 μ Capacitor FSparkFun ElectronicsCOM-08375Estabiliza a tensão na placa de circuito impresso. 1 necessário.
10 μ Capacitor FSparkFun ElectronicsCOM-00523Estabiliza a tensão na placa de circuito impresso. 1 necessário.
MAX7219CNG Driver de Matriz de LED/Exibição de Dígitos - MAX7219driver de LED MaximMAX7219CNG. 1 necessário.
Soquete IC de 8 pinosMouser Electronics575-14430816 necessário. Eles serão empilhados uns sobre os outros para apoiar o vaso de cultura acima da matriz de LED.
Soquete IC de 24 pinosMouser Electronics535-24-3518-10Opcional. Use isso para conectar reversivelmente o driver MAXIM 7219CNG ao PCB.
Multímetro digitalAdafruit2034Para solução de problemas eletrônicos. 1 necessário.
Cabeçotes de Separação - 40-pin Macho (Long Centered, PTH, 0.1")SparkFun ElectronicsPRT-12693Cabeçalhos de pinos macho para matriz LED conectada à placa de circuito impresso. As extremidades podem ser aparadas com alicates. 1 conjunto necessário. 
Cortadores de fio diagonais niveladosAdafruit152Para aparar cabeçotes de pinos longos e cortar cabos de alimentação. 1 necessário.
Fios de Jumper Fêmea/Fêmea Premium - 40 x 12" (300mm)Adafruit793Fita de fio para conectar a placa de ensaio à matriz de LED. Pode ser conectado de ponta a ponta com cabeçalhos macho para ser mais longo. 1 obrigatório.
Placa de ensaio de meio tamanhoAdafruit64A matriz de LED se conectará a ela e o recipiente de cultura ficará acima dela.
Miniatura 8x8 Azul LED MatrixAdafruit956Fonte de luz. O comprimento de onda dominante é de 470 nm (azul). 1 obrigatório. Matrizes de LED em miniatura alternativas do mesmo fornecedor estão disponíveis com comprimentos de onda dominantes: 624 nm (vermelho), 588 nm (amarelo), 525 nm (verde), 572 nm (amarelo-verde) e branco.
Cabeçalho empilhável-3 pinosSparkFun Electronics138758 necessário.
Kit de Resistor - 1/4W (500 total)SparkFun Electronics10969Para eletrônicos. 1 necessário.
  IRL520NRetificador InternacionalIRL520NInterruptor regulador de tensão para controlar a corrente CC. 4 necessário.
Fio de Conexão - Sortimento (Núcleo Sólido, 22 AWG)SparkFun ElectronicsPRT 11367Fio para eletrônicos. 1 necessário.
Fonte de alimentação comutada 5V 2A (2000mA) - Listado pela ULAdafruit276Fonte de alimentação para a almofada de aquecimento e Arduino. 2 necessário.
Adaptador de energia de comutação regulada de 12 VDC 1000mA - listado pela ULAdafruit798Para bombas peristálticas. 2 necessário.
Almofada de aquecimento elétrica - 10cm x 5cmAdafruit1481Para aquecer o biorreator. 1 necessário.
Bomba peristáltica de fluxo variável de baixo fluxoFisher Scientific13-876-1Para meios de bombeamento. 1 necessária
Bomba peristáltica de fluxo variável de fluxo médioFisher Scientific13-876-2Para cultura de bombeamento. 1 necessária.
Adaptador de energia de comutação regulada de 9 VDC 1000mA - listado pela ULAdafruit63Para fonte de alimentação do microcontrolador. Ordem 1.
Sensor de temperatura digital DS18B20 à prova d'água de alta temperatura + extrasTermômetro Adafruit642para o biorreator. 1 necessário.
MicromanagerMicromanagerNAO software de controle de microscópio gratuito e de código aberto está disponível em "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJIImageJNAO software de análise de imagem gratuito e de código aberto está disponível em "http://fiji.sc/"
Ambiente de Desenvolvimento Integrado do Arduino ArduinoNAO IDE gratuito e de código aberto está disponível em "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Código personalizadoGitHubNAO código do microcontrolador personalizado e o plug-in "Bioreactor Controller" estão disponíveis no " Arquivos de Quimiostato Optogenético" Repositório GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Cabo USB A para B - 6 PésSparkFun ElectronicsCAB-00512Usado para baixar dados para o microcontrolador. 1 necessário.
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNAA vantagem de carregar valores de matriz de LED de um arquivo CSV é que um programa pode ser chamado pelo plug-in para atualizar esses valores com base nos resultados da análise de imagem, e esses valores podem ser recarregados no microcontrolador, permitindo o controle de feed-back. Está disponível no " Arquivos de Quimiostato Optogenético" Repositório GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Géis Tota-frost (papel de difusão)B& HB & H # LOFSFTL
MFR # T1-72		Para matriz de LED. 1 necessário.
Folha de Kitting Crosslink 1/4x12x24inGrainger, inc20JL37Espuma preta para invólucro de vaso de cultura. 4 necessários.
Sensor de Potência de Fotodiodo Padrão, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW ThorlabsS120VCPara medir a intensidade da luz. 1 necessário.
Fita de rotulagemFisher Scientific159015NPara etiquetar e fixar componentes soltos. 1 necessário.
Console compacto do medidor do poder e da energia, 4" LCD digitalThorlabsPM100DPara medir a intensidade clara. 1 exigido.
Garrafa de vidro de hibridização GL45 de 100mLBellco Glass, Inc.(7910-40150)Vaso do biorreator. 1 necessário.
Conjunto de seis portasBellco Glass, Inc.Personalizado Para o vaso do biorreator. Especificações da tubulação: .125" OD x .055"ID. Porta A: 1.0" de comprimento acima da lesma da tampa e na parte inferior do tubo. Portas B, C, E, F: 1,0 "de comprimento acima da lesma da tampa, 33 mm de comprimento abaixo. Porta D: 1,0" de comprimento acima do slug da tampa, 65 mm  muito abaixo. 1 obrigatório. Inclui tampa de rosca de polipropileno de 45 mm de diâmetro e uma junta de silicone branca para garantir uma vedação apertada entre a tampa e o recipiente.
Fita Adesiva Adesiva 3105, 3/4 x 300 Polegadas, Pacote de 3Fita Adesiva Transparente AmazonB0009F3P3U. Isso está disponível em muitos outros fornecedores. É usado para cobrir marcações no vaso de cultura e para prender a lamínula com o canal PDMS à estrutura de suporte de alumínio.
Tubulação de Silicone Sanitária Tygon de 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" ParedeUnited States Plastic Corp.57288Tubulação. ~25' exigido.
Tampa de borracha branca Cole-Parmer Twistit, tamanho 10Cole-ParmerEW-62992-32Tampa de garrafa de mídia e tampa de garrafa de efluente. 2 necessários.
Balão de Laboratório 2LPyrex4980Balão de mídia e balão de efluentes. 2 necessário.
Pinchcock diurnoFisher Scientific5867Para apertar tubos fechados. 3 necessário.
Conjunto de tubulação de substituição 1/16" IDRastreaable Products3372As bombas peristálticas vêm com um conjunto de tubos, mas se desgastam após semanas de uso.
Conjunto de tubulação de substituição 1/50" IDTraceable Products3371As bombas peristálticas vêm com um conjunto de tubos, mas se desgastam após semanas de uso.
Luer macho com anel de trava x 1/16" mangueira barb, Nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-00Conectores. ~10 luers são necessários.
Luer macho com anel de trava x 1/8" mangueira barb, Nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-04Conectores. 5 necessários, um para cada furo de borracha para preencher com tubos.
Adaptador de mangueira luer x 1/16" fêmea, Nylon, 25/pkConectores Cole-ParmerEW-45502-00. ~10 luers necessários.
Adaptador de mangueira luer x 3/16" fêmeaCole-ParmerEW-45502-08Conectores. ~10 luers necessários.
Acessório Luer Cole-Parmer, Tampa Luer Feminina, Nylon, 25/PkCole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Plugue Luer Lock Macho, Nylon, 25/PkCole-ParmerEW-45505-56
0.022"ID x 0.042"OD, 100 pés/roloTubo Cole-ParmerEW-06417-21. 1 rolo necessário.
Tubo de silicone curado com platina Masterflex, L/S 13, 25 pésTubo Cole-ParmerEW-96410-13. ~25' necessário.
Tubulação de Silicone Sanitária Tygon de 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" ParedeUnited States Plastic Corp.57293Tubulação. ~1' necessário.
Filtro a vácuoFisher Scientific974107Filtro a vácuo Nalgene para meios filtrantes estéreis.
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200Bomba de ar de fluxo ajustável de diafragma duplo para aeração e mistura de meios. 1 necessário.
0,2 μ filtro de seringa de poros mCorning International431229Isso garante que o ar da bomba do aquário não contamine o aparelho. 1 necessário.
Kit de Elastômero de Silicone Slygard 184Dow CorningSlygard 184Para dispositivo microfluídico. 1 necessário.
Lâminas de barbear científicas de borda única GEM American Safety RazorFisher Scientific17989000Para cortar tubos e PDMS. 1 lâmina necessária.
Perfurador de furo Harris Uni-Core 1.2mm IDSigma-AldrichWHAWB100028 ALDRICHPara perfurar entrada/saída em dispositivo microfluídico. 1 necessário.
Vidro de cobertura do microscópio 22x60-1.5Fisher Scientific12-544-GPara dispositivo microfluídico. 1 necessário.
Moldura retangular de alumínio com janela quadradaCustomCustom Para suportar o canal microfluídico. Dimensões externas: 3 polegadas x 1,25 polegadas.
Dimensões internas (parte cortada): 7/8 polegadas x 7/8 polegadas
Espessura: ~1/32 polegadas
MOSFET Tubo PTFE Microbore ,

References

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  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).

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