Artigo de método

Manipulação de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) e do sono em ratos e camundongos por Acupuntura

DOI:

10.3791/54896

⸱

22 de dezembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Sports, Health & Leisure, College of Tourism, Leisure and Sports, Aletheia University, Tainan Campus, 2Department of Neurology, Mackay Memorial Hospital and Mackay Medical College, 3Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, National Taiwan University, 4Graduate Institute of Brain & Mind Sciences, College of Medicine, National Taiwan University, 5Graduate Institute of Acupuncture Science, College of Chinese Medicine, China Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este artigo demonstra o desempenho da acupuntura, modelos de epilepsia e a análise do sono em roedores. O procedimento de acupuntura e a identificação dos pontos de acupuntura são descritos. Pilocarpina ou pentilenotetrazol (PTZ) é usado para induzir epilepsia. Eletrocorticograma (ECoG), eletromiograma (EMG), temperatura cerebral e registros de atividade locomotora são empregados para análise do sono.

Resumo

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A literatura chinesa antiga documentou que a acupuntura possui efeitos terapêuticos eficientes na epilepsia e na insônia. Há, no entanto, pouca pesquisa para revelar os possíveis mecanismos por trás desses efeitos. Para investigar o efeito da acupuntura na epilepsia e no sono, várias questões precisam ser abordadas. A primeira é identificar os pontos de acupuntura, que correspondem entre humanos, ratos e camundongos. Além disso, a profundidade de inserção da agulha de acupuntura, o grau de torção da agulha na acupuntura manual com agulha e os parâmetros de estimulação para eletroacupuntura (EA) precisam ser determinados. Para avaliar os efeitos da acupuntura na epilepsia e no sono, é necessário um modelo viável de epilepsia em roedores. Administramos pilocarpina no núcleo central esquerdo da amígdala (CeA) para simular epilepsia focal do lobo temporal (ELT) em ratos. A injeção intraperitoneal (IP) de pilocarpina induz epilepsia generalizada e estado de mal epiléptico (SE) em ratos. Cinco injeções IP de pentilenotetrazol (PTZ) com um intervalo de um dia entre cada injeção induzem com sucesso epilepsia generalizada espontânea em camundongos. Registros de eletrocorticogramas (ECoGs), eletromiogramas (EMGs), temperatura cerebral e atividade locomotora são usados para análise do sono em ratos, enquanto ECoGs, EMGs e atividade locomotora são empregados para análise do sono em camundongos. Os eletrodos ECoG são implantados nos córtices occipitais frontal, parietal e contralateral, e um termistor é implantado acima do córtex cerebral por cirurgia estereotáxica. Os eletrodos EMG são implantados nos músculos do pescoço e um detector infravermelho determina a atividade locomotora. Os critérios para categorizar os estágios de vigilância, incluindo vigília, sono REM (movimento rápido dos olhos) e sono não REM (NREM) são baseados em informações de ECoGs, EMGs, temperatura cerebral e atividade locomotora. Os critérios de classificação detalhados são indicados no texto.

Introdução

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A epilepsia é um distúrbio neurológico comum em que crises recorrentes ocorrer durante toda a vida de um paciente. A maioria das recorrências epilépticas pode ser bem controlada pelas drogas anti-epilépticas (DAE). No entanto, cerca de 30% dos pacientes epilépticos desenvolver um refractário epilepsia. causas da epilepsia distúrbios do sono, que podem agravar ainda mais a reincidência. Evidências demonstram que a epilepsia pode tanto interromper o sono durante a noite ou pode causar excessiva 2,3 sonolência diurna. Os nossos estudos anteriores indicam ainda que a epilepsia ocorre em tempo zeitgeber (ZT) 0, ou seja, o início do período de luz, à luz: ciclo escuro, diminui o sono; esta é mediada pela hormona de libertação de corticotropina (CRH), um factor homeostática. Da epilepsia em ZT13 (o início do período de escuro) aumenta a expressão de um outro factor homeostático, interleucina-1 (IL-1), o que aumenta o sono. Sono ritmos circadianos são alteradas quando a epilepsia ocorre em ZT6, o meio daperíodo de luz 4,5. Por outro lado, os problemas do sono exacerbar ainda mais a progressão e recorrência da epilepsia 6. Com base nas evidências acima, tentamos revelar um método terapêutico ideal para controlar simultaneamente epilepsia e evitar interrupções do sono em pacientes com epilepsia. Anteriormente verificou que electroacupuncture (AE) com uma frequência de estimulação de 10 Hz, em que uma certa quantidade de corrente é fornecido para o ponto de acupunctura por meio de uma agulha de aço inoxidável, com sucesso suprime eletrocorticograma (ECoG) actividades de epilepsia e distúrbios do sono induzida por epilepsia 7 . EA com uma frequência de estimulação de 100 Hz se deteriorar ainda mais as atividades epilépticas e distúrbios do sono em ratos 8,9. Esta experiência bem sucedida depende de três fatores: em primeiro lugar, um modelo animal de epilepsia viável; Em segundo lugar, um método para a gravação e a análise do sono em roedores; e em terceiro lugar, o desempenho preciso da acupuntura e a precisão do locati acupointons.

A epilepsia tem sido classificados em dois tipos principais: epilepsia focal e epilepsia generalizada. Estamos interessados ​​em epilepsia focal lobo temporal (ELT), epilepsia generalizada, estado de mal epiléptico (SE), e a recorrência de epilepsia generalizada espontânea. Portanto, diferentes manipulações são aplicados para criar modelos de epilepsia adequados para nossos experimentos. Para estabelecer TLE focal, uma dose baixa de pilocarpina é administrado para dentro do núcleo central esquerdo da amígdala (CEA). Para verificar este modelo, seis eléctrodos de ECoG são implantados na frontal (F1 & F2), parietal (P1 e P2), e occipital (O1 & O2) lóbulos em ambos os hemisférios esquerdo e direito, e mais dois eléctrodos de referência (R1 & R2) são colocados sobre o cerebelo, em ambos os hemisférios. Uma cânula guia microinjecção adicional é cirurgicamente implantado no lado esquerdo CEA (AP, 2,8 mm a partir da bregma; mL, 4,2 mm; DV, 7.8 mm em relação ao bregma) relativos. As coordenadas são adaptados a partir da Paxinos e Watlas rato atson 10. Se o TLE focal é induzida com sucesso, somente a gravação do eletrodo no córtex parietal esquerda (P1), que fica perto da CeA esquerda, deve adquirir as ECoGs epileptiformes dominantes, sem ECoGs epileptiformes significativos registados a partir dos outros eletrodos ECoG. Intraperitoneal (ip) de pilocarpina em ratos induzem epilepsia generalizada e SE, mas isto pode ser fatal. Cinco injecções IP de pentilenotetrazol (PTZ) com um intervalo de um dia entre cada injecção induzir com sucesso epilepsia generalizada espontânea em ratos e também garantir a sobrevivência dos ratos. Dois eléctrodos de fio de ECoG são implantados no córtex frontal e parietal em ratinhos a receber sinais de ECoG e para verificar a epilepsia espontaneamente recorrentes.

A polissonografia (PSG) é um método abrangente para gravar as mudanças fisiológicas que ocorrem durante o sono, e pode objectivamente classificar sono em diferentes estágios de movimento não rápido dos olhos (NREM) e rAPID movimento dos olhos (REM). PSG registra os parâmetros de funções do corpo, incluindo as ondas cerebrais (eletroencefalograma, EEG), movimentos oculares (eletrooculograma, EOG), tons de músculo esquelético (eletromiografia, EMG), ritmos cardíacos (eletrocardiograma, ECG), e os níveis de oxigênio no sangue e parâmetros respiratórios. Em ratos, registramos ECoGs, EMG, temperatura cortical e atividade locomotora para classificar os estados de vigilância em vigília, o sono NREM e sono REM. análise de sono em ratos é conduzida usando ECoGs, EMGs, e resultados de atividade locomotora. Os ratos são implantados cirurgicamente, com três ECoG parafuso eletrodos no frontal, parietal e córtex cerebelar contralateral por cirurgia estereotáxica. determinação pós-aquisição dos estados de vigilância (vigília, sono NREM e sono REM) é conduzida de acordo com os parâmetros adquiridos a partir dos ECoGs, EMG, a temperatura do cérebro e atividade locomotora. Os critérios detalhados para classificar o comportamento do animal em ambos os ratos e murganhos são descritos em Tele protocolo.

Ambos os ratos e ratinhos necessitam de ser anestesiados com uma dose baixa de Zoletil (25 mg / kg), que é a metade da dose de anestésicos normalmente administrados durante a cirurgia estereotáxica, antes de realizar a acupunctura manual ou EA. Esta dosagem permite que os animais acordar 30 a 35 minutos após a injecção. De qualquer acupuntura manual ou EA é executada no início do período de escuro, com um período de tempo constante de 30 min, e cada animal é consecutivamente tratados durante dois a três dias. Estimulantes correntes EA são entregues num ponto de acupunctura particular através de uma agulha de aço inoxidável que é inserida no ponto de acupunctura. A corrente de estímulo é uma série de impulsos quadrados bifásica, em que a duração do impulso é de 150 ms e a intensidade de estimulação é de 1 mA. Se uma agulha for utilizada para a acupunctura manual, a agulha inserida nos acupontos se contraiu 10 vezes cada 5 min. A parte difícil da acupuntura manual ou EA é localizar os pontos de acupuntura em roedores. o locção dos pontos de acupuntura em ratos ou camundongos é semelhante à sua localização anatômica em seres humanos. Por exemplo, os pontos de acupuntura bilaterais Fengchí estão localizados 3 mm de distância da linha média posterior do pescoço, entre as duas orelhas, que é semelhante à sua localização anatómica em seres humanos 11. Além disso, os pontos de acupuntura com baixa impedância sobre a pele pode ser ainda confirmada. Sham acupuntura ou EA sham manipulação é necessária para acupuntura ou experimentos EA. Acupuntura Sham ou EA simulada deve ser realizado em um não-acupoint localizado perto do ponto de acupuntura, como perto da axila 12.

Para investigar com êxito os efeitos da acupuntura ou EA sobre a epilepsia e perturbações do sono induzida por epilepsia, os seguintes fatores devem estar no local: um modelo viável epiléptico animal, a análise precisa do ECoGs epileptiformes e a recorrência de epilepsia, um método para classificar os estados de vigilância , eo desempenho precisa da acupuntura ou eA em roedores.

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Protocolo

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Todos os protocolos experimentais são aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan.

1. Cirurgia estereotáxica para implantação ECoG Eletrodos, Eletrodos EMG, Brain Termistor e Guia Injection cânula

  1. Para os ratos (250-350 g, ratos Sprague-Dawley machos com 6 a 8 semanas de idade)
    1. Anestesiar os ratos por injecção IP com 50 mg / kg de Zoletil. Confirmar a profundidade adequada da anestesia, observando a falta de resposta após beliscar a pata traseira. Aplicar pomada, raspar a pele, e esterilizar a pele com solução de iodo-povidona e 75% de etanol. Injectar um antibiótico (penicilina G) para prevenir a infecção.
    2. Prepare bisturis, tesouras, hemostats, gazes e máquina de cautério para a cirurgia. Esterilizar engrenagem cirúrgica e gazes por uma autoclave ea cauterização por 75% de etanol.
    3. Coloque uma barra de ouvido no canal do ouvido e montar o rato ao estereotaxia.
    4. utilizaçãoum bisturi, fazer uma incisão na linha média de 2 cm aproximadamente no crânio ao longo de uma linha entre dois ouvidos, movendo-se caudalmente. Clipe os retalhos de pele com hemostats para expor o crânio e remover o tecido sobre o crânio com um bisturi.
    5. Broca oito furos (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1, e R2), cada um aproximadamente 0,7 mm de diâmetro, sobre o crânio com uma ferramenta rotativa. Parafuso oito eletrodos ECoG sobre os lobos frontal, parietal e occipital e do cerebelo em ambos os hemisférios esquerdo e direito. Estes eléctrodos são utilizados para a detecção de epilepsia focal.
      1. Use as seguintes coordenadas para os eletrodos de gravação: frontal (F1 e F2): +2,0 mm anterior ao bregma e 2,5 milímetros da linha média, parietal (P1 e P2): -2,0 mm anterior ao bregma e 3,0 milímetros da linha média , e occipital (O1 e O2): -5,5 mm anterior ao bregma e 3,0 milímetros da linha média.
      2. Coloque dois eléctrodos de referência (R1 e R2) em relação ao cerebelo (-11,0 mm anterior ao bregma e 4,0 milímetros a partir do midline).
    6. Em grupos separados de ratos, faça três furos e colocar dois eletrodos de EEG parafuso sobre o frontal direita (F2) e lobos parietais (P2) dos córtices com as mesmas coordenadas como descrito no passo 1.1.5.1. Coloque um terceiro eletrodo EEG sobre o cerebelo esquerdo (R1), que serve para aterrar a animais e reduzir os artefatos de sinal. Estes eletrodos são usados ​​para confirmar a epilepsia generalizada e analisar as fases de vigilância.
    7. Separar a pele do pescoço e músculo e inserir dois eletrodos EMG no músculo do pescoço.
    8. Broca outro orifício no crânio e colocar uma cânula guia de microinjecção para a esquerda CEA (AP, 2,8 mm a partir da bregma; mL, 4,2 mm; DV, 7,8 milímetros em relação ao bregma) em ratos. As coordenadas são adaptados a partir da Paxinos e Watson atlas rato 10.
    9. Perfurar um furo maior (com um diâmetro de 1,6 mm) no crânio e inserir um termistor 30 kV calibrada na superfície do córtex parietal, que será mais tarde cimentada, a monitor a temperatura cortical em ratos.
    10. Use gaze e cautério para parar o sangramento quando ele ocorre.
    11. Passe os condutores isolados dos eletrodos ECoG e eletrodos EMG a um pedestal e ligue o termistor para a corda. Cimentar o pedestal e guia de uma cânula para o crânio com acrílico dental.
    12. Tratar a incisão topicamente com polysporin (bacitracina-zinco / sulfato de polimixina B) para prevenir a infecção. Dê os animais tanto ibuprofeno e penicilina G na água durante uma semana após a cirurgia.
  2. Para ratinhos (20 - 30 g ratos, de 6 a 8 semanas de idade C57BL / C)
    1. Anestesiar os ratos por injecção IP com 50 mg / kg de Zoletil e confirmar a correcta profundidade da anestesia através da observação de uma falta de resposta após a beliscar a pata traseira. Aplicar pomada. Depois de raspar a pele, esterilizar a pele com solução de iodo-povidona e 75% de etanol. Injectar um antibiótico (penicilina G) para prevenir a infecção.
    2. Coloque uma barra de ouvido no canal do ouvido emontar o mouse para a estereotaxia.
    3. Usando um bisturi, fazer uma incisão na linha média de 1,5 cm aproximadamente no crânio ao longo de uma linha entre as duas orelhas, movendo-se caudalmente. Clipe os retalhos de pele com hemostats para expor o crânio e remover o tecido sobre o crânio com um bisturi.
    4. Picar dois furos no crânio com tesouras cirúrgicas e colocar dois eléctrodos de fio de ECoG no lobo frontal direito (F2: +2,0 mm em relação ao bregma e 1,5 para a linha média) e lobo parietal esquerdo (P1: -3.0 mm em relação ao bregma e -2,5 mm da linha média).
    5. Separar a pele do pescoço e músculo e inserir dois eletrodos EMG no músculo do pescoço.
    6. Ligar os condutores isolados a partir dos eléctrodos de arame de ECoG e eléctrodos de EMG para os terminais fêmea e a um conector de 2,54 mm, e, em seguida, cimento ao crânio com acrílico dental.
    7. Tratar a incisão topicamente com polysporin (bacitracina-zinco / sulfato de polimixina B) para prevenir a infecção. Dê os animais tanto o ibuprofeno e penicilina G na água por um week após a cirurgia.
  3. Permitir que todos os animais recuperassem durante sete dias antes do início das experiências.
  4. Casa ratos ou ratinhos, separadamente, em gaiolas individuais de gravação, na sala isolada em que a temperatura é mantida a 23 ± 1 ° C e a luz: escuro (L: D) ritmo é controlada de 12: ciclo de 12 h (40 W X 4 tubos de iluminação). Fornecer alimentos e água ad libitum.
  5. Ligue o ECoG, EMG, e termistor através de um grupo de ancoragem para os amplificadores de uma semana após a cirurgia para iniciar as gravações.

2. Estabelecimento de Focal TLE epilepsia, SE, e espontaneamente Recurrent epilepsia

  1. para os ratos
    1. Administrar 0,5 uL de pilocarpina (2,4 mg / mL) para o CeA esquerda através da cânula guia de injecção, utilizando uma bomba de micro-injecção. A taxa de injecção deve ser fixado em 0,2 mL / min para induzir TLE focal.
    2. IP injectar 300 mg / kg de pilocarpina para induzir epi generalizadalepsy com recorrentes SE.
  2. para ratos
    1. IP administrar PTZ (0,035 mg / g de peso corporal do rato) num determinado ponto de ZT todos os dias. Cinco injecções consecutivas irá causar o desenvolvimento de epilepsia espontaneamente e recorrentemente generalizada.
  3. Para ambos os ratos e murganhos
    1. Amplificar os sinais de ECoG por 5.000 e filtrar os de banda analógica entre 0,1 e 40 Hz.
    2. Use um A placa A / D conversão para converter os sinais ECoGs analógicos em sinais digitais com uma taxa de amostragem de 128 Hz.
    3. Usar um software para a pontuação visual e analisar o aparecimento e a duração da epilepsia. Medir o intervalo de tempo, a fim de representar o tempo.
    4. Definir ECoG epilepsia pelo aparecimento de picos epilépticos com amplitudes superiores a 2 mV e com durações de mais do que 30 s 13.

3. Classificação de Vigilância Unidos

  1. para os ratos
    1. Determinar os estados de vigilância usando os parâmetros adquiridos de ECoGs, EMG, as temperaturas do cérebro, e locomoção dentro de um 12-s episódio de gravação. Ligue o ECoG, EMG, e termistor através de um grupo de ancoragem para os amplificadores de uma semana após a cirurgia para começar a gravação. Marcar os estados com um software feito sob medida de acordo com etapas 3.1.5 - 3.1.7.
    2. Medir as atividades de locomoção, utilizando um detector de movimento infravermelho, integrar os sinais cada 1 s, e armazenar os sinais.
    3. Medir a temperatura cortical e armazenar os sinais.
    4. Classificar os estados de vigilância de acordo com os nossos critérios previamente definidos 14.
    5. Pontuação vigília usando as seguintes características: ECoGs de pequena amplitude com espectros de alta-frequência, maior poder de delta (0,5-4,0 Hz) e de potência inferior theta (6,0-9,0 Hz); atividade locomotora dominante; alta atividade EMG; e aumentando gradualmente a temperatura cortical.
    6. Pontuação sono NREM usando o followincaracterísticas de g: de ondas delta ECoGs dominantes com grandes amplitudes, diminuiu a atividade EMG, reduziu a temperatura cortical, e nenhuma atividade locomotora.
    7. Pontuação sono REM usando as seguintes características: diminuição da amplitude de ECoGs com a frequência dominante teta, de repente aumento da temperatura cortical, a atividade EMG mínimo, e baixa atividade locomotora com contrações musculares do corpo.
  2. para ratos
    1. Repita a classificação dos estados de vigilância nos ratos como conduzidos nos ratos, exceto que não há temperatura cortical gravado a partir do termistor.

4. Realização de acupuntura manual e EA em Ratos

  1. O rato é anestesiado para o protocolo EA.
  2. Localize o ponto de acupuntura pela anatomia e confirme baixa impedância pele no ponto de acupuntura. A luz está piscando quando detectar a baixa impedância pele. Nota: acupontos Fengchí está localizado a 3 mm de distância da linha média posterior sejatre as duas orelhas, no pescoço.
  3. Inserir agulhas de aço inoxidável para os pontos de acupuntura, a uma profundidade de 2 mm.
  4. Twitch as agulhas inseridas 10 vezes a cada 5 min.
  5. Usando um estimulador elétrico funcional, entregar um trem de pulsos bifásicos (duração de 150 uS cada) com uma intensidade de 1 mA aos pontos de acupuntura através da agulha.
  6. Executar uma acupuntura sham ou simulada EA como um controle.

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Resultados

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Existem diferentes modelos de ratos e camundongos para satisfazer as necessidades de diferentes tipos de epilepsia. Para induzir TLE focal, 0,5 ul de pilocarpina (2,4 mg / mL) é administrado para a esquerda CeA. Os ECoGs epileptiforme predominantes são adquiridos a partir do eléctrodo de ECoG no lobo parietal do hemisfério esquerdo (Figura 1A: b), e actividades epilépticos raras são apanhados do resto dos eléctrodos de ECoG (Figura 1A: a,

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Discussão

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A escolha de um modelo animal de epilepsia viável é essencial para cada finalidade experimental. Um dos nossos objetivos é elucidar os efeitos da EA na supressão de epilepsia. EA é um medicamento alternativo que pode apresentar efeitos terapêuticos na epilepsia e tem sido documentada em literatura antiga chinesa. No entanto, há uma falta de evidência científica para provar isso. Para determinar os efeitos da EA sobre epilepsia, nós nos concentramos principalmente sobre os efeitos da EA sobre a epilepsia focal suave, em ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelas concessões do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST) MOST104-2410-H-002-053 & NSC99-2320-B-002-026-MY3. Este manuscrito foi editado e revisado pelo Sr. Brian Chang, que tem experiência na revisão de documentos profissionais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Drogas
ZoletilVirbac50 mg/kg i.p.
pilocarpinaSigma-AldrichP6503300 mg/kg i.p.; 1,2 mg microinjeção
PTZSigma-AldrichP65000,035 mg/camundongo
polisporinaPfizer
Surgery
ECoGPlásticos Um eletrodo deE363/20para ratos
PedestalPlásticos UmMS363
CânulaPlásticos UmC315G / spc
TermistorOmega Engineering44008
Dental acrílicoTempron
Instrumento EstereotáxicoStoeltingDural braços
Equipamentos de gravação
ECoG amplificadorColbourn InstrumentsV75-01
A/D BoardNational InstrumentsNI PCI-6033E
Detectores de movimento baseados em infravermelhoBiobserve GmbHfeito sob medida
ICELUSG-System
AxoScope 10 SoftwareMolecular Devices
Necessidades de acupuntura
Agulhas de aço inoxidávelShanghai Yanglong Medical Articles Co.calibre 32 x 1"
Funções Estimulador elétricoI.T.O., JapãoTrio 300
AcuPenLhasa OMSPonteiro Excel II
parafuso

Referências

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